Études immunologiques en urologie

La prescription d'un immunogramme à un patient urologique signifie que le médecin traitant suspecte la présence de troubles du système immunitaire. Des infections bactériennes, virales et fongiques récurrentes, des manifestations allergiques et des maladies systémiques peuvent être des signes de ces troubles, caractérisés par plusieurs syndromes (infectieux, oncologiques, allergiques, auto-immuns, lymphoprolifératifs). Un même patient peut présenter plusieurs syndromes. Par exemple, les maladies infectieuses chroniques (syndrome infectieux) peuvent entraîner une immunodéficience, et cette dernière peut se manifester par une prédisposition aux maladies infectieuses et oncologiques (syndrome oncologique). Une prédisposition aux infections peut survenir dans le contexte d'une immunodéficience secondaire, développée suite à une maladie lymphoproliférative, comme la leucémie. Il existe trois principaux groupes de modifications pathologiques du système immunitaire:

• déficit quantitatif ou fonctionnel de l’un ou l’autre maillon du système immunitaire, qui conduit au développement d’un état d’immunodéficience;
• un trouble de la reconnaissance des antigènes par le système immunitaire, conduisant au développement de processus auto-immuns;
• une réponse immunitaire hyperréactive ou « pervertie », se manifestant par le développement de maladies allergiques.

Il existe des méthodes d'immunodiagnostic de dépistage (tests de niveau 1) et de clarification (tests de niveau 2). Les premières visent à enregistrer les troubles du système immunitaire, les secondes à établir les mécanismes impliqués dans leur mise en œuvre en vue d'une immunocorrection ultérieure.

Immunité des lymphocytes B

Méthodes de dépistage

• Détermination du nombre relatif et absolu de lymphocytes B par immunofluorescence ou cytofluorométrie de flux avec des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes des lymphocytes B (CD19, CD20, où CD représente les clusters de différenciation). Chez l'adulte, le taux normal de lymphocytes B représente 8 à 19 % du nombre total de leucocytes, soit 190 à 380 cellules/μl. Une augmentation du taux de lymphocytes B est observée en cas d'infections bactériennes et fongiques aiguës et chroniques, d'hépatopathies chroniques, de connectivites systémiques, de leucémie lymphoïde chronique et de myélome.
• Détermination de la concentration d'immunoglobulines non spécifiques (F, M, G, E) par immunodiffusion radiale simple, néphélométrie ou turbométrie, dosage radio-immunologique ou dosage immuno-enzymatique (ELISA). Normes pour les adultes: immunoglobulines (Ig) A: 0,9-4,5 g/l. IgM: 0,3-3,7 g/l. IgG: 8,0-17 g/l. Une augmentation de la concentration d'immunoglobulines survient dans les mêmes conditions pathologiques que celles où se produit une augmentation du taux de lymphocytes B. Une diminution de la concentration d'immunoglobulines survient en cas d'hypogammaglobulinémie congénitale, de néoplasies du système immunitaire, d'ablation de la rate, de perte de protéines, de maladies rénales ou intestinales, de traitement par cytostatiques et immunosuppresseurs.

Méthodes de clarification

• Détermination des complexes immuns circulants dans le sang par précipitation sélective dans le polyéthylène glycol suivie d'un test de densité spectrophotométrique (normale 80-20 U). Une augmentation des complexes immuns circulants est typique des infections bactériennes, fongiques et virales aiguës, des maladies auto-immunes, des maladies à complexes immuns, de la maladie sérique et des réactions allergiques de type 3.
• Détermination des immunoglobulines spécifiques dans le sang en relation avec les antigènes bactériens et viraux, l'acide désoxyribonucléique (ADN) dans les maladies auto-immunes, détection des anticorps antispermatozoïdes (stérilité auto-immune) et antirénaux (pyélonéphrite et glomérulonéphrite) par la méthode d'immunodiffusion radiale ou ELISA.
• Détermination des anticorps anti-spermatozoïdes dans le sperme [test MAR (réaction mixte à l'antiglobuline)], résultat normal - négatif.
• Détermination de la concentration d'immunoglobulines dans les urines en vue du diagnostic différentiel entre pyélonéphrite et glomérulonéphrite (sélectivité de la protéinurie).
• Détermination de la teneur en IgE dans le suc prostatique en vue du diagnostic de la prostatite allergique par la méthode d'immunodiffusion radiale ou ELISA.
• Etude de la réponse dans la réaction de transformation blastique des lymphocytes B au mitogène des cellules B (mitogène du phytolaque pour la stimulation de la réaction de transformation blastique des lymphocytes B en présence de lymphocytes T), dont la valeur normative est de 95-100 %.

Lien des lymphocytes T dans l'immunité

Méthodes de dépistage

• Détermination du nombre relatif et absolu de lymphocytes T CD3 matures par immunofluorescence ou cytofluorométrie de flux à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-CD3. La norme chez l'adulte est de 58 à 76 %, soit 1 100 à 1 700 cellules/μl. Une diminution du nombre de lymphocytes T est un indicateur d'une insuffisance du lien cellulaire de l'immunité. Ceci est typique de certains déficits immunitaires secondaires et primaires (infections bactériennes et virales chroniques: tuberculose, syndrome d'immunodéficience acquise, tumeurs malignes, insuffisance rénale chronique, traumatismes, stress, vieillissement, malnutrition, traitement par cytostatiques, exposition aux rayonnements ionisants). Une augmentation du nombre de lymphocytes T survient dans un contexte d'hyperactivité immunitaire ou de maladies lymphoprolifératives. En cas d'inflammation, le nombre de lymphocytes T augmente d'abord, puis diminue. L'absence de diminution des lymphocytes T indique un processus inflammatoire chronique.
• Évaluation des sous-populations de lymphocytes.
  • Détermination du nombre de lymphocytes T auxiliaires (anticorps anti-CD4). Normalement, 36 à 55 %, soit 400 à 1 100 cellules/mL. Une augmentation du nombre de ces cellules se produit dans les maladies auto-immunes, la maladie de Waldenström, l'activation de l'immunité anti-transplantation; une diminution du nombre de lymphocytes T auxiliaires se produit dans les infections bactériennes, virales et protozoaires chroniques, la tuberculose, le syndrome d'immunodéficience acquise, les tumeurs malignes, les brûlures, les blessures, la malnutrition, le vieillissement, les traitements par cytostatiques et l'exposition aux rayonnements ionisants.
  • Détermination du nombre de lymphocytes T suppresseurs (anticorps anti-CD4). Normalement, 17 à 37 %, soit 300 à 700 cellules/μl. Une augmentation du nombre de lymphocytes T suppresseurs se produit dans les mêmes conditions où le nombre de lymphocytes T auxiliaires diminue, et leur diminution se produit dans les mêmes conditions où leur teneur augmente.
  • L'indice immunorégulateur CD4/CD8 est généralement compris entre 1,5 et 2,5. Une hyperactivité supérieure à 2,5 est observée (maladies allergiques et auto-immunes); une hypoactivité inférieure à 1,0 est observée (prédisposition aux infections chroniques). Au début du processus inflammatoire, l'indice immunorégulateur augmente et, lorsqu'il diminue, il se normalise.

Méthodes de clarification

• Détermination du nombre de cellules tueuses naturelles (cellules NK): anticorps anti-CD16 et anti-CD56. La norme pour les lymphocytes CD16 est de 6 à 26 %, celle pour les CD56 de 9 à 19 %. Le nombre de cellules NK augmente en cas de rejet de greffe et diminue en cas d'infections virales, de cancer, de déficits immunitaires primaires et secondaires, de brûlures, de blessures et de stress, de traitement par cytostatiques et d'exposition aux rayonnements ionisants.
• Détermination du nombre de lymphocytes T porteurs d'un récepteur de l'interleukine-2 (marqueur d'activation): anticorps anti-CD25. La norme est de 10 à 15 %. Une augmentation de leur nombre est observée dans les maladies allergiques, le rejet de greffe, la réponse aux antigènes thymodépendants lors de la phase aiguë de la primo-infection, et une diminution dans les mêmes maladies où le nombre de cellules NK diminue.
• Étude de l'expression du marqueur d'activation HLA-DR, molécule d'histocompatibilité de classe II. Son expression accrue se produit lors de processus inflammatoires, chez les patients atteints d'hépatite C, de maladie cœliaque, de syphilis et de maladies respiratoires aiguës.
• Évaluation de l'apoptose lymphocytaire. L'expression du récepteur Fas (CD95) à leur surface et du proto-oncogène bd-2 dans les mitochondries permet d'évaluer approximativement l'état de préparation des lymphocytes à l'apoptose. L'apoptose lymphocytaire est évaluée en les traitant avec deux colorants fluorescents: l'iodure de propidium, qui se lie aux fragments d'ADN, et l'annexine Y, qui se lie à la phosphatidylsérine, présente sur la membrane cellulaire au début de l'apoptose. Les résultats sont évalués à l'aide d'un cytofluoromètre de flux. Ils sont calculés en fonction du ratio de cellules colorées avec différents colorants. Les cellules non colorées sont viables; les cellules liées uniquement à l'annexine Y sont des manifestations précoces de l'apoptose; les cellules liées uniquement à l'iodure de propidium et à l'annexine Y sont des manifestations tardives de l'apoptose; une coloration à l'iodure de propidium seul indique une nécrose.
• Evaluation de la prolifération des lymphocytes T in vitro.
  • Modifications de la blastogenèse cellulaire – réaction de transformation blastique des lymphocytes. Les leucocytes sont incubés avec un mitogène d'origine végétale (lectines). La phytohémagglutinine est généralement utilisée pendant 72 heures, puis un frottis est prélevé, coloré et le nombre de blastes est compté! L'indice de stimulation est le rapport entre le pourcentage de cellules transformées dans l'expérience (culture avec phytohémagglutinine) et le pourcentage de cellules transformées dans le témoin (culture sans phytohémagglutinine). La réaction de transformation blastique des lymphocytes peut être évaluée par l'inclusion d'un marqueur radioactif (ZN-thymndinum) dans les cellules en culture, car la synthèse d'ADN augmente pendant la division cellulaire. Des perturbations de la réponse proliférative surviennent dans les déficits immunitaires primaires et secondaires associés aux infections, au cancer, à l'insuffisance rénale et aux interventions chirurgicales.
  • Dans ces études, l'expression des marqueurs d'activation (CD25, récepteur de la transferrine - CD71) et de la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II HLA-DR, qui sont pratiquement absents sur les lymphocytes T au repos, est évaluée. Les lymphocytes T sont stimulés par la phytohémagglutinine, après 3 jours l'expression des marqueurs d'activation est analysée par la méthode de réaction d'immunofluorescence directe ou indirecte, cytofluorométrie en flux, en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les récepteurs isolés.
  • Mesure de la quantité de médiateurs synthétisés par les lymphocytes T activés [interleukine (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, interféron γ, etc.] par dosage radio-immunologique ou ELISA. L'évaluation de la concentration d'interféron γ et d'IL-4, marqueurs des gènes Th1 et Th2, dans le surnageant des cultures activées et à l'intérieur de la cellule, est particulièrement importante. Si possible, il est utile de déterminer l'expression génétique de la cytokine correspondante en mesurant le taux d'acide ribonucléique matriciel dans la cellule productrice et en mesurant l'intensité de l'expression des récepteurs des cytokines correspondantes.
    
• Réaction d'inhibition de la migration lymphocytaire. En réaction à l'antigène, les lymphocytes T sensibilisés sécrètent des lymphokines, dont des facteurs inhibant la migration lymphocytaire. Ce phénomène d'inhibition est observé lors de l'introduction de mitogènes dans la culture cellulaire. L'évaluation du degré d'inhibition permet d'évaluer la capacité des lymphocytes à sécréter des cytokines. Normalement, la fréquence de migration, selon le mitogène, est de 20 à 80 %.
• Évaluation de la cytotoxicité des cellules NK. La capacité des cellules tueuses naturelles à détruire les cellules cibles de la lignée érythromyéloïde K-562 est déterminée. Pour évaluer la cytotoxicité dépendante des anticorps, des cellules cibles recouvertes d'anticorps IgG sont utilisées. Les cellules cibles sont marquées à la 3H-uridine et incubées avec des cellules effectrices. La mort des cellules cibles est évaluée par la libération du marqueur radioactif dans la solution. Une diminution de la cytotoxicité est observée dans les tumeurs malignes. Dans certains cas, lorsqu'il est nécessaire de prédire l'efficacité d'un traitement par interleukines, la cytotoxicité des cellules NK est évaluée lors de l'incubation avec certaines cytokines.

Étude de la fonction des phagocytes

Méthodes de dépistage

Étude de l'intensité d'absorption des cellules microbiennes par les phagocytes (phagocytose de particules de latex, culture test de staphylocoques, d'E. coli ou de micro-organismes isolés du patient). Par centrifugation du sang hépariné, une suspension de leucocytes est isolée, puis du sérum de groupe sanguin IV est ajouté pour l'opsonisation (les opsonines sont des protéines qui favorisent la phagocytose). La suspension microbienne est diluée, mélangée aux leucocytes et incubée pendant 120 minutes. Des échantillons sont prélevés pour analyse 30, 90 ou 120 minutes après le début de l'incubation. Des frottis sont réalisés à partir de la suspension leucocytaire collectée. Les indicateurs de phagocytose suivants sont déterminés:

• indice phagocytaire - le pourcentage de cellules entrées en phagocytose dans les 30 minutes et 120 minutes suivant l'incubation; la valeur standard de l'indice phagocytaire (30) est de 94 %, l'indice phagocytaire (120) est de 92 %;
• nombre phagocytaire - le nombre moyen de bactéries situées à l'intérieur des cellules; la valeur standard du nombre phagocytaire (30) est de 11 %, le nombre phagocytaire (120) est de 9,8 %;
• coefficient du nombre de phagocytaires - le rapport entre le nombre de phagocytaires (30) et le nombre de phagocytaires (120); normalement 1,16;
• Indice bactéricide des neutrophiles - rapport entre le nombre de microbes tués à l'intérieur des phagocytes et le nombre total de microbes absorbés; normalement 66 %.

Méthodes de clarification

• Étude du pouvoir bactéricide des phagocytes lors du test au nitrobleu de tétrazolium (NBT) – test NBT. Le colorant jaune nitrobleu de tétrazolium est ajouté aux leucocytes. Lorsqu'un neutrophile absorbe le colorant, un processus de réduction se produit sous l'influence des radicaux libres de l'oxygène, entraînant une coloration bleue. La réaction est réalisée dans une plaque à fond plat de 96 puits. Une solution de Hanks (NBT spontané) est ajoutée aux trois premiers puits contenant un mélange de NBT et de leucocytes, et des particules de latex sont ajoutées au second; le mélange est incubé à 37 °C pendant 25 min. Les résultats sont lus à 540 nm sur un lecteur et exprimés en unités arbitraires. Le coefficient de stimulation (K _st ) est calculé, égal au rapport entre la densité optique des puits stimulés et la densité optique moyenne des puits non stimulés. Chez les personnes en bonne santé, NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _m = 1,78 ± 0,36.
• Étude des molécules d'adhésion. La cytofluorométrie de flux permet de déterminer l'expression des antigènes de surface CD11a/CD18, CD11b/CD18 et CD11c/CD18. Les déficits immunitaires avec adhérence altérée se manifestent par des infections récurrentes, une cicatrisation lente et l'absence de pus dans les foyers infectieux.

Étude du système du complément

Méthodes de dépistage

La détermination de l'activité hémolytique du complément est une étude de la voie classique d'activation du complément. Différentes dilutions de sérum de personnes malades et saines sont ajoutées à des érythrocytes de bélier recouverts d'anticorps. L'unité d'activité hémolytique est l'inverse de la dilution sérique à laquelle 50 % des érythrocytes sont détruits. Le degré d'hémolyse est estimé photométriquement par la libération d'hémoglobine dans la solution. Une diminution de l'activité hémolytique du complément est observée dans le lupus érythémateux disséminé avec atteinte rénale, la glomérulonéphrite aiguë, les déficits immunitaires combinés, la myasthénie, l'hépatite virale, les lymphomes, ainsi qu'une augmentation de l'ictère obstructif, de la thyroïdite de Hashimoto, des rhumatismes, de la polyarthrite rhumatoïde, de la périartérite nodulaire, de la dermatomyosite, de l'infarctus du myocarde, de la rectocolite hémorragique, du syndrome de Reiter et de la goutte.

Méthodes de clarification

• Détermination des composants du complément. La détermination quantitative est réalisée par immunodiffusion radiale et néphélométrie.
  L'étude n'est informative que si les propriétés antigéniques des composants du complément sont modifiées.
• Il a été établi que le composant Clq du complément améliore la phagocytose et intervient dans la cytotoxicité cellulaire. Sa diminution se produit dans les maladies à complexes immuns, le lupus érythémateux disséminé, les infections purulentes et les tumeurs.
• Le composant C3 est impliqué dans l'activation des voies classiques et alternatives du complément. Une diminution de sa concentration est associée aux infections bactériennes et fongiques chroniques, ainsi qu'à la présence de complexes immuns circulants ou tissulaires.
• Le composant C4 intervient dans l'activation de la voie classique. Une diminution de sa concentration est associée à une activation prolongée du complément par les complexes immuns et à une diminution de la concentration de l'inhibiteur de C1, qui contrôle l'activation de la voie classique du complément. Un déficit en C4 est observé dans le lupus érythémateux disséminé; une augmentation de C4 est observée dans les maladies rénales, le rejet de greffe, l'inflammation aiguë et les maladies gastro-intestinales.
• Le C5a est un petit fragment de la molécule C5, qui se sépare de celle-ci suite à l'activation du système du complément. Sa concentration augmente en cas d'inflammation, de sepsis, de maladies atopiques et allergiques.
• L'inhibiteur de Cl est un facteur multifonctionnel. Il contrôle l'activation du composant C1 du complément et inhibe l'activité de la kallicréine, de la plasmine et du facteur Hageman activé, ainsi que des protéases Cls et Or. Un déficit en inhibiteur de C1 entraîne un angio-œdème.
• Études fonctionnelles du complément. Le sérum à tester est ajouté à un sérum standard dépourvu de tout composant du complément et l'activité hémolytique de ce dernier est déterminée. Si l'activité hémolytique n'est pas rétablie à la normale, l'activité de ce composant du complément dans le sérum à tester est considérée comme réduite.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]