Méthodes de génétique moléculaire pour le diagnostic des maladies héréditaires

Les techniques d'ADN permettent de localiser un gène mutant sur un chromosome particulier, responsable de certaines pathologies héréditaires. Un gène étant une portion d'ADN et une mutation génétique étant une atteinte de sa structure primaire (mutation désignant toute modification de la séquence d'ADN, indépendamment de sa localisation et de son impact sur la viabilité d'un individu), l'analyse de chromosomes métaphasiques d'un patient atteint d'une maladie héréditaire permet de localiser le gène pathologique. Les méthodes de génétique moléculaire permettent de diagnostiquer des maladies en se basant sur une altération de la structure de l'ADN et de localiser des troubles héréditaires. Elles permettent d'identifier les mutations associées au remplacement d'une seule base.

L'étape la plus importante de l'identification d'un gène est son isolement. L'ADN peut être isolé de tout type de tissu et de cellules contenant un noyau. Les étapes de l'isolement de l'ADN comprennent: la lyse rapide des cellules, l'élimination des fragments d'organites et de membranes cellulaires par centrifugation, la destruction enzymatique des protéines et leur extraction de la solution à l'aide de phénol et de chloroforme, et la concentration des molécules d'ADN par précipitation dans l'éthanol.

Dans les laboratoires de génétique, l'ADN est le plus souvent isolé à partir de leucocytes sanguins. Pour cela, 5 à 20 ml de sang veineux sont prélevés du patient dans un tube à essai stérile contenant une solution anticoagulante (héparine). Les leucocytes sont ensuite séparés et traités selon les étapes décrites ci-dessus.

L'étape suivante de la préparation du matériel de recherche consiste à « découper » l'ADN en fragments dans des zones présentant une séquence de bases strictement spécifique. Cette opération est réalisée à l'aide d'enzymes bactériennes: les endonucléases de restriction (enzymes de restriction). Les enzymes de restriction reconnaissent des séquences spécifiques de 4 à 6, plus rarement de 8 à 12 nucléotides dans une molécule d'ADN double brin et la divisent en fragments situés à ces emplacements, appelés sites de restriction. Le nombre de fragments de restriction d'ADN obtenus est déterminé par la fréquence d'apparition des sites de restriction, et leur taille par la nature de leur répartition sur la longueur de la molécule d'ADN d'origine. Plus les sites de restriction sont fréquents, plus les fragments d'ADN après restriction sont courts. On connaît actuellement plus de 500 types différents d'enzymes de restriction d'origine bactérienne, chacune reconnaissant sa propre séquence nucléotidique spécifique. À l'avenir, les sites de restriction pourraient être utilisés comme marqueurs génétiques de l'ADN. Les fragments d'ADN formés suite à la restriction peuvent être classés par longueur par électrophorèse sur gel d'agarose ou de polyacrylamide, ce qui permet de déterminer leur poids moléculaire. Généralement, l'ADN dans un gel est identifié par coloration spécifique (généralement au bromure d'éthidium) et par observation en lumière ultraviolette transmise. Les sites de localisation de l'ADN sont colorés en rouge. Cependant, chez l'homme, lorsque l'ADN est traité par plusieurs enzymes de restriction, il se forme tellement de fragments de longueurs différentes qu'ils ne peuvent être séparés par électrophorèse. Il est donc impossible d'identifier visuellement les fragments d'ADN individuels lors de l'électrophorèse (une coloration uniforme est obtenue sur toute la longueur du gel). Par conséquent, pour identifier les fragments d'ADN souhaités dans un tel gel, la méthode d'hybridation avec des sondes d'ADN marquées est utilisée.

Tout segment simple brin d'ADN ou d'ARN est capable de se lier (hybrider) à un brin complémentaire, la guanine se liant toujours à la cytosine et l'adénine à la thymine. C'est ainsi qu'une molécule double brin est formée. Si une copie simple brin d'un gène cloné est marquée avec un marqueur radioactif, on obtient une sonde. Cette sonde est capable de trouver un segment complémentaire d'ADN, qui est ensuite facilement identifié par autoradiographie. Une sonde radioactive ajoutée à une préparation de chromosomes étirés permet de localiser le gène sur un chromosome spécifique: grâce à une sonde d'ADN, des zones spécifiques peuvent être identifiées lors d'un transfert de Southern. L'hybridation se produit si la section d'ADN testée contient un gène normal. En cas de séquence nucléotidique anormale, c'est-à-dire si les structures chromosomiques correspondantes contiennent un gène mutant, l'hybridation ne se produit pas, ce qui permet de localiser le gène pathologique.

Pour obtenir des sondes d'ADN, on utilise la méthode du clonage génétique. Cette méthode consiste à insérer un fragment d'ADN correspondant à un gène ou à une section de gène dans une particule de clonage, généralement un plasmide bactérien (ADN extrachromosomique annulaire présent dans les cellules bactériennes et porteur de gènes de résistance aux antibiotiques), puis à multiplier les bactéries contenant le plasmide contenant le gène humain inséré. Grâce aux processus de synthèse du plasmide, des milliards de copies du gène humain ou de sa section peuvent être obtenues.

Les copies d'ADN résultantes, marquées avec un marqueur radioactif ou des fluorochromes, sont ensuite utilisées comme sondes pour rechercher des séquences complémentaires parmi le pool de molécules d'ADN étudié.

Actuellement, il existe de nombreux types de méthodes différentes utilisant des sondes ADN pour diagnostiquer les mutations génétiques.

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