Cellules souches et médecine plastique régénérative

Aujourd'hui, rares sont les médecins praticiens qui ignorent l'émergence d'une nouvelle approche dans le traitement des maladies les plus graves, jusqu'alors incurables par la médecine traditionnelle et alternative. Il s'agit de la médecine régénérative-plastique, fondée sur l'utilisation du potentiel régénérateur des cellules souches. Cette nouvelle approche a suscité un débat scientifique sans précédent et un battage médiatique pseudo-scientifique, largement alimenté par les hyperboles informationnelles du web. En très peu de temps, les études en laboratoire sur les capacités thérapeutiques des cellules souches ont dépassé le stade expérimental et ont commencé à être activement intégrées à la pratique médicale, ce qui a soulevé de nombreux problèmes d'ordre scientifique, éthique, religieux, juridique et législatif. L'État et les institutions publiques se sont clairement montrés mal préparés à la rapidité avec laquelle les cellules souches sont passées des boîtes de Petri aux systèmes d'administration intraveineuse, ce qui n'est bénéfique ni pour la société dans son ensemble ni pour les personnes souffrantes en particulier. Il n’est pas facile de comprendre la quantité inimaginable d’informations sur les capacités des cellules souches, tant en quantité qu’en qualité, même pour les spécialistes (dont il n’y en a pas, puisque chacun essaie de maîtriser la nouvelle tendance scientifique par lui-même), sans parler des médecins qui ne sont pas directement impliqués dans la médecine plastique régénérative.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Pourquoi de telles expériences sont-elles nécessaires et sont-elles vraiment nécessaires?

À première vue, la création de chimères cellulaires interspécifiques est le fruit de l'imagination débridée d'un scientifique fanatique, oubliant la bioéthique. Pourtant, c'est cette approche qui a considérablement élargi nos connaissances fondamentales sur l'embryogenèse, puisqu'elle a permis de calculer le nombre de cellules nécessaires à l'organogenèse (formation du foie, du cerveau, de la peau et des organes du système immunitaire). De plus (et c'est peut-être l'essentiel de la biologie des cellules souches embryonnaires), les généticiens disposent d'un outil unique permettant d'établir la fonction des gènes lors de la chimérisation des embryons. Tout d'abord, une technique spéciale de double knock-out est utilisée pour « désactiver » la paire de gènes étudiée dans les cellules souches embryonnaires. Ces cellules souches embryonnaires sont ensuite introduites dans un blastocyste et les changements qui se produisent dans l'embryon chimérique en développement sont surveillés. De cette manière, les fonctions des gènes sf-1 (développement des glandes surrénales et des organes génitaux), urt-l (ébauche rénale), muoD (développement des muscles squelettiques) et gata-l-4 (ébauche de l'érythropoïèse et de la lymphopoïèse) ont été établies. De plus, des gènes humains non encore étudiés peuvent être introduits (transfectés) dans les cellules souches embryonnaires d'animaux de laboratoire afin de déterminer leur fonction à l'aide d'un embryon chimérique.

Cependant, justifier une expérience par l'acquisition de nouvelles connaissances fondamentales ne recueille généralement pas l'adhésion d'un large public. Prenons un exemple de l'importance pratique de la chimérisation utilisant des cellules souches embryonnaires (CSE). Il s'agit tout d'abord de xénotransplantation, c'est-à-dire de transplantation d'organes animaux chez l'homme. Théoriquement, la création de chimères de cellules humaines et porcines permet d'obtenir un animal présentant des caractéristiques antigéniques bien plus proches de celles du donneur de CSE, ce qui, dans diverses situations cliniques (diabète sucré, cirrhose du foie), peut sauver la vie d'un patient. Cependant, pour cela, il faut d'abord apprendre à restituer la totipotence au génome d'une cellule somatique mature, afin de pouvoir ensuite l'introduire dans un embryon porcin en développement.

Aujourd'hui, la capacité des cellules souches embryonnaires (CES) à se diviser presque à l'infini dans des conditions de culture particulières est utilisée pour produire une masse cellulaire totipotente, puis sa différenciation en cellules spécialisées, telles que les neurones dopaminergiques, qui sont ensuite transplantées chez un patient atteint de la maladie de Parkinson. Dans ce cas, la transplantation est nécessairement précédée d'une différenciation ciblée de la masse cellulaire obtenue en cellules spécialisées nécessaires au traitement et à la purification de ces dernières à partir d'éléments cellulaires indifférenciés.

Il s'est avéré par la suite que la menace de cancérogénèse était loin d'être le seul obstacle à la transplantation cellulaire. Spontanément, les cellules souches embryonnaires (CES) des corps embryoïdes se différencient de manière hétérogène, c'est-à-dire qu'elles forment des dérivés d'une grande variété de lignées cellulaires (neurones, kératinocytes, fibroblastes, endothéliocytes). Dans ce cas, au microscope, les cardiomyocytes se distinguent parmi les cellules de différents phénotypes, chacune se contractant à son propre rythme. Cependant, pour traiter un patient, il est nécessaire de disposer de populations cellulaires pures: neurones – en cas d'accident vasculaire cérébral; cardiomyocytes – en cas d'infarctus du myocarde; cellules bêta du pancréas – en cas de diabète sucré; kératinocytes – en cas de brûlures, etc.

L'étape suivante du développement de la transplantation cellulaire a été associée au développement de technologies permettant d'obtenir un nombre suffisant (des millions de cellules) de telles populations cellulaires pures. La recherche des facteurs responsables de la différenciation dirigée des cellules souches embryonnaires (CSE) était de nature empirique, la séquence de leur synthèse au cours de l'embryogenèse demeurant inconnue. Il a d'abord été établi que la formation du sac vitellin est induite par l'ajout d'AMPc et d'acide rétinoïque à la culture de CSE. Des lignées cellulaires hématopoïétiques ont été formées en présence de 1L-3, de SCF, de facteur de croissance des fibroblastes (FGH), de facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF-1), de 1L-6 et de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-СSF) dans le milieu de culture. Les cellules du système nerveux ont été formées à partir des CSE après élimination du LIF et de la couche de fibroblastes, qui servait de milieu nourricier. Après traitement à l'acide rétinoïque en présence de sérum fœtal, les cellules souches embryonnaires (CES) ont commencé à se différencier en neurones, et des cardiomyocytes ont été obtenus par ajout de diméthylsulfoxyde (DMSO), qui assure l'administration ciblée de molécules de signalisation hydrophobes au noyau cellulaire. Dans ce cas, l'accumulation d'espèces actives de l'oxygène dans le milieu de culture, ainsi que la stimulation électrique, ont contribué à la formation de cardiomyocytes contractiles matures.

D'importants efforts et ressources ont été consacrés à la recherche des conditions de différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cellules pancréatiques productrices d'insuline. Cependant, il est rapidement apparu que plusieurs lignées cellulaires spécialisées (cellules bêta pancréatiques, cellules immunitaires et endocrines, adipocytes) ne se développent pas à partir de CSE lorsqu'elles sont stimulées selon le principe « un facteur stimulant, une lignée cellulaire ». Ce principe s'est avéré valable uniquement pour un nombre limité de lignées cellulaires. En particulier, la formation de neurones peut être induite par l'acide rétinoïque, celle de cellules musculaires par le facteur de croissance transformant β (TCP-β), celle de lignées érythroïdes par 1L-6 et celle de lignées monocytaires-myéloïdes par 1L-3. De plus, les effets de ces facteurs sur la différenciation des CSE se sont avérés strictement dose-dépendants.

La phase de recherche de combinaisons de facteurs de croissance permettant aux cellules souches embryonnaires (ESC) d'atteindre les stades ultérieurs de l'embryogenèse, avec formation du mésoderme (source des cardiomyocytes, des muscles squelettiques, de l'épithélium des tubules rénaux, de la myéloérythropoïèse et des cellules musculaires lisses), de l'ectoderme (épiderme, neurones, rétine) et de l'endoderme (épithélium de l'intestin grêle et des glandes sécrétoires, pneumocytes) a débuté. La nature semblait obliger les chercheurs à poursuivre l'embryogenèse, en répétant ses étapes dans une boîte de Petri, empêchant ainsi l'obtention immédiate et aisée du résultat souhaité. De telles combinaisons de facteurs de croissance ont été trouvées. L'activine A, associée au TGF-β, s'est révélée être un puissant stimulateur de la formation de cellules mésodermiques à partir des ESC, tout en bloquant le développement de l'endoderme et de l'ectoderme. L'acide rétinoïque et une combinaison de signaux de protéine morphogénétique de la moelle osseuse (BMP-4) et de facteur de croissance épidermique (EGF) activent la formation des cellules ectodermiques et mésodermiques, stoppant ainsi le développement de l'endoderme. Une croissance cellulaire intensive des trois feuillets germinaux est observée sous l'effet simultané de deux facteurs sur les cellules souches embryonnaires (ESC): le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et le facteur de croissance des cellules nerveuses.

Ainsi, pour obtenir les lignées cellulaires nécessaires, il est nécessaire de transférer d'abord les cellules souches embryonnaires au stade de formation des cellules d'un feuillet germinatif, puis de sélectionner une nouvelle combinaison de facteurs de croissance capable d'induire la différenciation dirigée de l'ectoderme, du mésoderme et de l'endoderme en cellules spécialisées nécessaires à la transplantation chez le patient. Il existe aujourd'hui des milliers de combinaisons de facteurs de croissance; la plupart sont brevetées, tandis que d'autres ne sont pas divulguées par les sociétés de biotechnologie.

Il était temps de purifier les cellules obtenues des impuretés cellulaires indifférenciées. Les cellules différenciées en culture ont été marquées avec des marqueurs de lignées cellulaires matures et passées dans un trieur immunophénotypique laser à haute vitesse. Le faisceau laser les a détectées dans le flux cellulaire général et les a dirigées vers un chemin distinct. Les animaux de laboratoire ont été les premiers à recevoir le matériel cellulaire purifié obtenu. Il était temps d'évaluer l'efficacité de l'utilisation de dérivés de cellules souches embryonnaires (CSE) sur des modèles de maladies et de processus pathologiques. L'un de ces modèles était la maladie de Parkinson expérimentale, bien reproduite chez l'animal grâce à des composés chimiques détruisant les neurones dopaminergiques. La maladie étant chez l'homme une déficience acquise en neurones dopaminergiques, le recours à la thérapie cellulaire substitutive était justifié d'un point de vue pathogénique. Chez les animaux atteints d'hémiparkinsonisme expérimental, environ la moitié des neurones dopaminergiques obtenus à partir de CSE et introduits dans les structures cérébrales ont pris racine. Cela a suffi à réduire significativement les manifestations cliniques de la maladie. Les tentatives visant à restaurer la fonction des structures endommagées du SNC lors d’accidents vasculaires cérébraux, de blessures et même de ruptures de la moelle épinière se sont avérées assez fructueuses.

Il convient toutefois de noter que la quasi-totalité des cas d'utilisation réussie de dérivés d'ESC différenciés pour la correction d'une pathologie expérimentale ont été réalisés en phase aiguë d'une situation pathologique simulée. Les résultats du traitement à distance n'étaient pas aussi encourageants: après 8 à 16 mois, l'effet positif de la transplantation cellulaire a disparu ou a fortement diminué. Les raisons en sont claires. La différenciation des cellules transplantées in vitro ou in loco morbi conduit inévitablement à l'expression de marqueurs cellulaires d'étrangeté génétique, ce qui provoque une attaque immunitaire de la part de l'organisme du receveur. Pour résoudre le problème d'incompatibilité immunologique, une immunosuppression traditionnelle a été utilisée, parallèlement à laquelle des essais cliniques ont commencé à identifier le potentiel de la transdifférenciation et de la correction génétique des cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses autologues, qui ne provoquent pas de conflit immunitaire.

Qu'est-ce que la médecine plastique régénérative?

L'évolution a déterminé deux principales options pour la fin de vie d'une cellule: la nécrose et l'apoptose. Ces processus correspondent, au niveau tissulaire, aux processus de prolifération et de régénération. La prolifération peut être considérée comme une forme de sacrifice, lorsque le tissu endommagé est comblé par son remplacement par des éléments de tissu conjonctif: tout en préservant l'intégrité structurelle, l'organisme perd partiellement la fonction de l'organe affecté, ce qui entraîne le développement ultérieur de réactions compensatoires avec hypertrophie ou hyperplasie des éléments structurels et fonctionnels restés intacts. La durée de la période de compensation dépend de l'ampleur des lésions structurelles causées par les facteurs d'altération primaire et secondaire, après quoi, dans la grande majorité des cas, une décompensation se produit, entraînant une forte détérioration de la qualité et une réduction de la durée de vie. La régénération physiologique assure des processus de remodelage, c'est-à-dire le remplacement des cellules vieillissantes et mourantes par des mécanismes de mort cellulaire naturelle (apoptose) par de nouvelles cellules issues des réserves de cellules souches du corps humain. Les processus de régénération réparatrice impliquent également les ressources cellulaires des espaces souches, qui sont cependant mobilisées dans des conditions pathologiques associées à une maladie ou à des lésions tissulaires, initiant la mort cellulaire par des mécanismes de nécrose.

L'attention particulière portée par les scientifiques, les médecins, la presse, la télévision et le public à l'étude de la biologie des cellules souches embryonnaires (CSE) est due, avant tout, au fort potentiel de la thérapie cellulaire, ou, comme nous l'appelons, régénérative-plastique. Le développement de méthodes de traitement des maladies humaines les plus graves (pathologies dégénératives du système nerveux central, lésions médullaires et cérébrales, maladies d'Alzheimer et de Parkinson, sclérose en plaques, infarctus du myocarde, hypertension artérielle, diabète sucré, maladies auto-immunes et leucémies, brûlures et processus néoplasiques, pour n'en citer que quelques-unes) repose sur les propriétés uniques des cellules souches, qui permettent la création de nouveaux tissus pour remplacer, comme on le croyait auparavant, les zones tissulaires irréversiblement endommagées d'un organisme malade.

Les progrès de la recherche théorique en biologie des cellules souches au cours des dix dernières années ont été réalisés grâce à l'émergence spontanée de nouveaux domaines de la médecine régénérative-plastique, dont la méthodologie est non seulement facilement systématisable, mais aussi indispensable. Le premier domaine d'application pratique du potentiel régénératif des cellules souches, et celui qui connaît le développement le plus rapide, est la thérapie régénérative-plastique de remplacement. Son évolution est facilement retracée dans la littérature scientifique, depuis les expériences sur des animaux atteints de nécrose myocardique jusqu'aux travaux de ces dernières années visant à restaurer le déficit en cardiomyocytes après un infarctus ou à compenser la perte de cellules bêta du pancréas et de neurones dopaminergiques du système nerveux central.

Transplantation cellulaire

La transplantation cellulaire est à la base de la médecine régénérative-plastique substitutive. Cette dernière doit être définie comme un ensemble de mesures médicales au cours desquelles le corps du patient est en contact direct avec des cellules viables d'origine auto-, allo-, iso- ou xénogénique, pendant une durée courte ou longue. Le moyen de transplantation cellulaire est une suspension de cellules souches ou de leurs dérivés, normalisée par le nombre d'unités de transplantation. Une unité de transplantation est le rapport entre le nombre d'unités formant colonie (UC) en culture et le nombre total de cellules transplantées. Les méthodes de transplantation cellulaire sont: administration intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée d'une suspension de cellules souches ou de leurs dérivés; administration d'une suspension de cellules souches ou de leurs dérivés dans les ventricules cérébraux, les vaisseaux lymphatiques ou le liquide céphalorachidien.

La transplantation cellulaire allogénique et autologue utilise deux approches méthodologiques fondamentalement différentes pour exploiter le potentiel pluripotent, multipotent ou polypotent des cellules souches, in vivo ou in vitro. Dans le premier cas, l'introduction des cellules souches dans l'organisme du patient s'effectue sans différenciation préalable; dans le second, après reproduction en culture, différenciation ciblée et purification à partir d'éléments indifférenciés. Parmi les nombreuses techniques méthodologiques de thérapie cellulaire substitutive, trois groupes se distinguent clairement: le remplacement de cellules de moelle osseuse et de cellules sanguines, le remplacement de cellules d'organes et de tissus mous, et le remplacement d'éléments rigides et solides de l'organisme (cartilage, os, tendons, valves cardiaques et vaisseaux capacitifs). Cette dernière approche doit être définie comme une médecine reconstructive et régénérative, car le potentiel de différenciation des cellules souches est réalisé sur une matrice – une structure biologiquement inerte ou résorbable ayant la forme de la zone corporelle remplacée.

Une autre façon d'intensifier les processus de régénération plastique des tissus endommagés consiste à mobiliser les ressources souches du patient en utilisant des facteurs de croissance exogènes, tels que les facteurs de croissance des granulocytes et des granulocytes-macrophages. Dans ce cas, la rupture des connexions stromales entraîne une augmentation de la libération de cellules souches hématopoïétiques dans la circulation sanguine, qui, dans la zone endommagée, assurent les processus de régénération grâce à leur plasticité intrinsèque.

Ainsi, les méthodes de médecine régénérative visent à stimuler les processus de restauration des fonctions perdues – soit par la mobilisation des propres réserves cellulaires du patient, soit par l’introduction de matériel cellulaire allogénique.

Un résultat pratique important de la découverte des cellules souches embryonnaires est le clonage thérapeutique basé sur la compréhension des déclencheurs de l'embryogenèse. Si le signal initial du début de l'embryogenèse est le complexe pré-ARNm situé dans le cytoplasme de l'ovocyte, alors l'introduction du noyau de n'importe quelle cellule somatique dans l'ovule énucléé devrait déclencher le programme de développement embryonnaire. Nous savons déjà aujourd'hui qu'environ 15 000 gènes participent à la mise en œuvre du programme d'embryogenèse. Que deviennent-ils plus tard, après la naissance, pendant les périodes de croissance, de maturité et de vieillissement? La réponse à cette question a été apportée par la brebis Dolly: ils sont préservés. Grâce aux méthodes de recherche les plus modernes, il a été démontré que les noyaux des cellules adultes conservent tous les codes nécessaires à la formation des cellules souches embryonnaires, aux feuillets germinaux, à l'organogenèse et à la maturation de restriction (sortie vers la différenciation et la spécialisation) des lignées cellulaires d'origine mésenchymateuse, ecto-, endo- et mésodermique. Le clonage thérapeutique, en tant que direction, s'est formé dès les premiers stades du développement de la transplantation cellulaire et prévoit le retour de la totipotence aux propres cellules somatiques du patient pour obtenir du matériel de transplantation génétiquement identique.

La découverte des cellules souches a commencé « depuis la fin », puisque le terme, introduit en biologie et en médecine par A. Maksimov, désignait les cellules souches de la moelle osseuse, à l'origine de tous les éléments cellulaires matures du sang périphérique. Cependant, les cellules souches hématopoïétiques, comme les cellules de tous les tissus d'un organisme adulte, ont également leur propre prédécesseur, moins différencié. La source commune à toutes les cellules somatiques est la cellule souche embryonnaire. Il convient de noter que les concepts de « cellules souches embryonnaires » et de « cellules souches embryonnaires » sont loin d'être identiques. Les cellules souches embryonnaires ont été isolées par J. Thomson de la masse cellulaire interne du blastocyste et transférées dans des lignées cellulaires à longue durée de vie. Seules ces cellules possèdent un fac-similé de « cellules souches embryonnaires pluripotentes ». Leroy Stevens, qui a découvert les cellules souches embryonnaires lors d'expériences sur des souris, les a appelées « cellules souches embryonnaires pluripotentes », en référence à la capacité des cellules souches embryonnaires à se différencier en dérivés des trois feuillets germinaux (ecto-, méso- et endoderme). Cependant, toutes les cellules de l'embryon aux stades ultérieurs de son développement sont également des cellules souches, car elles donnent naissance à un grand nombre de cellules qui constituent le corps d'un adulte. Pour les définir, nous proposons le terme « cellules progénitrices pluripotentes embryonnaires ».

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Types de cellules souches

La classification moderne des cellules souches repose sur le principe de leur division selon leur capacité (potentiel) à donner naissance à des lignées cellulaires, définie comme toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- et unipotence. La totipotence, c'est-à-dire la capacité de recréer un organisme génétiquement programmé dans son intégralité, est possédée par les cellules zygotes, les blastomères et les cellules souches embryonnaires (cellules de la masse interne du blastocyste). Un autre groupe de cellules totipotentes, qui se forment à des stades ultérieurs du développement embryonnaire, est représenté par les cellules germinales primaires de la zone génitale embryonnaire (tubercules génitaux). La pluripotence, qui est la capacité de se différencier en cellules de n'importe quel organe ou tissu, est inhérente aux cellules embryonnaires des trois feuillets germinaux: ecto-, méso- et endoderme. On pense que la multipotence, c'est-à-dire la capacité à former n'importe quelle cellule au sein d'une lignée spécialisée, n'est caractéristique que de deux types de cellules: les cellules souches mésenchymateuses, formées dans la crête neurale et précurseurs de toutes les cellules du tissu conjonctif de base de l'organisme, y compris les cellules de la névroglie, ainsi que les cellules souches hématopoïétiques, à l'origine de toutes les lignées de cellules sanguines. On distingue également les cellules souches bi- et unipotentes, notamment les cellules précurseurs des germes hématopoïétiques myéloïdes, lymphoïdes, monocytaires et mégacaryocytaires. L'existence de cellules souches unipotentes a été clairement démontrée par l'exemple des cellules hépatiques: la perte d'une partie importante du tissu hépatique est compensée par la division intensive d'hépatocytes polyploïdes différenciés.

Au cours du développement, tous les organes et tissus se forment grâce à la prolifération et à la différenciation de la masse cellulaire interne du blastocyste, dont les cellules sont, au sens strict, des cellules souches embryonnaires totipotentes. Les premiers travaux sur l'isolement de cellules souches embryonnaires ont été menés par Evans, qui a montré que des blastocystes implantés dans le cerveau de souris donnent naissance à des tératocarcinomes, dont les cellules, une fois clonées, forment des lignées de cellules souches embryonnaires pluripotentes (le nom original de ces cellules – cellules de carcinome embryonnaire ou, en abrégé, ECС – n'est plus utilisé actuellement). Ces données ont été confirmées par plusieurs autres études où des cellules souches embryonnaires ont été obtenues par culture de cellules de blastocystes de souris et d'autres espèces animales, ainsi que d'humains.

Ces dernières années, la littérature s'est de plus en plus intéressée à la plasticité des cellules souches, considérée non seulement comme leur capacité à se différencier en différents types cellulaires à différents stades de développement, mais aussi à subir une dédifférenciation (transdifférenciation, rétrodifférenciation). Autrement dit, la possibilité fondamentale du retour d'une cellule somatique différenciée au stade de développement embryonnaire avec récapitulation (retour) de la pluripotence et sa mise en œuvre dans une différenciation répétée avec formation de cellules d'un type différent est admise. En particulier, il est rapporté que les cellules souches hématopoïétiques sont capables de transdifférenciation avec formation d'hépatocytes, de cardiomyoblastes et d'endothéliocytes.

Les débats scientifiques concernant la division des cellules souches en fonction de leur plasticité se poursuivent, c'est-à-dire que la terminologie et le glossaire de la transplantation cellulaire sont en cours de formation, ce qui a une signification pratique directe, puisque la plupart des méthodes de médecine plastique régénérative sont basées sur l'utilisation des propriétés plastiques et la capacité des cellules souches à se différencier en diverses lignées cellulaires.

Le nombre de publications dans le domaine des problèmes fondamentaux et appliqués de la médecine régénérative et plastique augmente rapidement. Un éventail d'approches méthodologiques différentes visant à optimiser l'utilisation du potentiel régénératif et plastique des cellules souches a déjà été décrit. Cardiologues et endocrinologues, neurologues et neurochirurgiens, transplantologues et hématologues ont identifié leurs domaines d'intérêt prioritaires. Ophtalmologues, phtisiologues, pneumologues, néphrologues, oncologues, généticiens, pédiatres, gastro-entérologues, thérapeutes et pédiatres, chirurgiens et gynécologues-obstétriciens cherchent une solution aux problèmes urgents liés aux capacités plastiques des cellules souches. Tous les représentants de la médecine moderne espèrent pouvoir guérir des maladies autrefois considérées comme mortelles.

La transplantation cellulaire est-elle la prochaine « panacée »?

Cette question se pose à juste titre chez tous les médecins et scientifiques réfléchis qui analysent l'état actuel de la science médicale. La situation est compliquée par le fait que, d'un côté, dans la confrontation scientifique, se trouvent les « conservateurs sains » et, de l'autre, les « fanatiques malades » de la transplantation cellulaire. Évidemment, la vérité, comme toujours, se trouve entre eux, dans un « no man's land ». Sans aborder les questions de droit, d'éthique, de religion et de morale, examinons les avantages et les inconvénients des domaines désignés de la médecine régénérative-plastique. La « brise légère » des premiers rapports scientifiques sur les possibilités thérapeutiques des cellules souches embryonnaires (CSE) s'est transformée en « vent de tempête » un an après leur découverte, qui s'est transformé en une « tornade d'informations » en 2003. La première série de publications portait sur les questions de la culture de cellules souches embryonnaires, de leur reproduction et de leur différenciation dirigée in vitro.

Il s'est avéré que pour une reproduction illimitée des cellules souches embryonnaires en culture, il est nécessaire de respecter strictement un certain nombre de conditions. Trois facteurs doivent être présents dans le milieu conditionné: l'interleukine-6 (IL-6), le facteur de cellules souches (SCF) et le facteur inhibiteur de leucase (LIF). De plus, les cellules souches embryonnaires doivent être cultivées sur un substrat (couche nourricière) de fibroblastes embryonnaires et en présence de sérum de veau fœtal. Si ces conditions sont remplies, les cellules souches embryonnaires en culture se multiplient sous forme de clones et forment des corps embryoïdes, des agrégats de clones en suspension de cellules sphériques. La principale caractéristique du clone de cellules souches embryonnaires est qu'en culture, le corps embryoïde cesse de croître lorsque 50 à 60, voire 100 cellules au maximum, s'accumulent dans l'agrégat. Durant cette période, un état d'équilibre s'établit: le taux de division cellulaire au sein du clone est égal au taux d'apoptose (mort cellulaire programmée) à sa périphérie. Après avoir atteint cet équilibre dynamique, les cellules périphériques du corps embryoïde subissent une différenciation spontanée (généralement avec formation de fragments endodermiques du sac vitellin, d'angioblastes et d'endothéliocytes) et perdent leur totipotence. Par conséquent, pour obtenir une masse cellulaire totipotente suffisante, le corps embryoïde doit être désagrégé chaque semaine et transplanté des cellules souches embryonnaires individuelles dans un nouveau milieu nutritif – un processus assez laborieux.

La découverte des cellules souches embryonnaires n'a pas permis de déterminer précisément ce qui déclenche les programmes d'embryogenèse cryptés dans l'ADN du zygote, ni comment. Le déroulement du génome au cours de la vie humaine reste flou. Parallèlement, l'étude des cellules souches embryonnaires a permis de développer un concept des mécanismes de maintien de la totipotence, de la pluripotence et de la multipotence des cellules souches lors de leur division. La principale caractéristique distinctive d'une cellule souche est sa capacité à s'auto-reproduire. Cela signifie qu'une cellule souche, contrairement à une cellule différenciée, se divise de manière asymétrique: l'une des cellules filles donne naissance à une lignée cellulaire spécialisée, tandis que la seconde conserve la totipotence, la pluripotence ou la multipotence du génome. On ne comprenait toujours pas pourquoi et comment ce processus se produit aux premiers stades de l'embryogenèse, lorsque la masse cellulaire interne du blastocyste en division est entièrement totipotente et que le génome des cellules souches embryonnaires est en état de dormance (inhibé). Si, lors de la division d'une cellule ordinaire, le processus de duplication est nécessairement précédé de l'activation et de l'expression de tout un complexe de gènes, ce n'est pas le cas lors de la division des cellules souches embryonnaires (CSE). La réponse à la question « pourquoi » a été obtenue après la découverte d'ARNm préexistant (pré-ARNm) dans les CSE, dont une partie est formée dans les cellules folliculaires et stockée dans le cytoplasme de l'ovule et du zygote. La deuxième découverte a répondu à la question « comment »: des enzymes spécifiques appelées « éditases » ont été découvertes dans les CSE. Les éditases remplissent trois fonctions importantes. Premièrement, elles assurent la lecture épigénétique alternative (sans intervention du génome) et la duplication du pré-ARNm. Deuxièmement, elles mettent en œuvre le processus d'activation du pré-ARNm (épissage – élimination des introns, c'est-à-dire des sections inactives d'ARN qui inhibent la synthèse protéique sur l'ARNm), après quoi l'assemblage des molécules protéiques commence dans la cellule. Troisièmement, les éditases favorisent la formation d'ARNm secondaires, répresseurs des mécanismes d'expression génique, qui maintiennent la densité de la chromatine et l'état inactif des gènes. Des produits protéiques synthétisés sur ces ARNm secondaires, appelés protéines silencieuses ou gardiennes du génome, sont présents dans les ovules humains.

C'est ainsi que se présente aujourd'hui le mécanisme de formation des lignées cellulaires immortelles de cellules souches embryonnaires. En termes simples, le signal de lancement du programme d'embryogenèse, dont les premières étapes consistent en la formation d'une masse cellulaire totipotente, provient du cytoplasme de l'ovule. Si, à ce stade, la masse cellulaire interne du blastocyste, c'est-à-dire les cellules souches embryonnaires, est isolée de tout autre signal régulateur, le processus d'autoreproduction des cellules se déroule en cycle fermé, sans la participation des gènes du noyau cellulaire (par voie épigénétique). Si une telle cellule est alimentée en nutriments et isolée des signaux externes favorisant la différenciation de la masse cellulaire, elle se divisera et se reproduira indéfiniment.

Les premiers résultats des tentatives expérimentales d'utilisation de cellules totipotentes pour la transplantation ont été assez impressionnants: l'introduction de cellules souches embryonnaires dans les tissus de souris dont le système immunitaire était affaibli par des immunosuppresseurs a entraîné le développement de tumeurs dans 100 % des cas. Parmi les cellules néoplasiques, dont les cellules souches embryonnaires (CSE) étaient à l'origine, on trouvait des dérivés différenciés du matériel cellulaire exogène totipotent, notamment des neurones, mais la croissance de tératocarcinomes a réduit à néant la valeur des résultats obtenus. Parallèlement, selon les travaux de L. Stevens, les CSE introduites dans la cavité abdominale formaient de grands agrégats dans lesquels se formaient fragmentairement les muscles embryonnaires, le cœur, les cheveux, la peau, les os, les muscles et le tissu nerveux. (Les chirurgiens ayant ouvert des kystes dermoïdes devraient connaître ce phénomène.) Il est intéressant de noter que les cellules embryoblastiques de souris en suspension se comportent exactement de la même manière: leur introduction dans les tissus d'animaux adultes immunodéprimés provoque systématiquement la formation de tératocarcinomes. Mais si une lignée pure d'ESC est isolée d'une telle tumeur et introduite dans la cavité abdominale, alors des dérivés somatiques spécialisés des trois couches germinales se forment à nouveau sans signes de cancérogenèse.

Le problème suivant à résoudre était donc de purifier le matériel cellulaire des impuretés des cellules indifférenciées. Cependant, même avec une très grande efficacité de différenciation cellulaire ciblée, jusqu'à 20 % des cellules en culture conservent leur potentiel totipotent, qui se manifeste malheureusement in vivo lors de la croissance tumorale. Autre « lance-pierre » de la nature: à l'échelle du risque médical, la garantie de guérison du patient s'oppose à la garantie de son décès.

La relation entre les cellules tumorales et les cellules progénitrices pluripotentes embryonnaires (EPPC), dont le développement est plus avancé que celui des cellules souches embryonnaires (ESC), est assez ambiguë. Nos études ont montré que l'introduction d'EPPC dans diverses tumeurs transplantables chez le rat peut entraîner la désintégration du tissu tumoral (G), une augmentation rapide de la masse tumorale (D), sa réduction (E-3), ou n'affecte pas la taille de la nécrose focale centrale spontanée du tissu néoplasique (I, K). Il est évident que le résultat de l'interaction des EPPC et des cellules tumorales est déterminé par l'ensemble des cytokines et des facteurs de croissance produits par elles in vivo.

Il est à noter que les cellules souches embryonnaires, réagissant par cancérogénèse au contact des tissus adultes, s'assimilent parfaitement à la masse cellulaire de l'embryon et s'intègrent à tous ses organes. Ces chimères, constituées des propres cellules de l'embryon et des cellules souches embryonnaires donneuses, sont appelées animaux allophènes, bien qu'il ne s'agisse pas en réalité de chimères phénotypiques. Le système hématopoïétique, la peau, le tissu nerveux, le foie et l'intestin grêle subissent une chimérisation cellulaire maximale lorsque les cellules souches embryonnaires sont introduites dans un embryon précoce. Des cas de chimérisation des organes génitaux ont été décrits. La seule zone inviolable pour les cellules souches embryonnaires est constituée des cellules germinales primaires.

Autrement dit, l’embryon conserve l’information génétique de ses parents, ce qui protège la pureté et la pérennité du genre et de l’espèce.

Dans des conditions de blocage de la division cellulaire de l'embryon précoce par la cytoclazine, l'introduction de cellules souches embryonnaires dans le blastocyste conduit au développement d'un embryon dont les cellules germinales primaires, comme toutes les autres, ont été formées à partir de cellules souches embryonnaires du donneur. Mais dans ce cas, l'embryon lui-même est entièrement donneur, génétiquement étranger à l'organisme de la mère porteuse. Les mécanismes d'un tel blocage naturel du potentiel de mélange de l'information héréditaire propre et étrangère ne sont pas encore élucidés. On peut supposer que dans ce cas, le programme d'apoptose se réalise, dont les déterminants nous restent inconnus.

Il convient de noter que l'embryogenèse des animaux d'espèces différentes n'est jamais coordonnée: lors de la mise en œuvre du programme d'organogenèse du donneur dans l'embryon receveur de cellules souches embryonnaires xénogéniques, l'embryon meurt in utero et se résorbe. Par conséquent, l'existence de chimères « rat-souris », « cochon-vache », « humain-rat » doit être comprise comme un mosaïcisme cellulaire, et non morphologique. En d'autres termes, lorsque des cellules souches embryonnaires humaines (CSE) d'une espèce de mammifère sont introduites dans le blastocyste d'une autre espèce, une descendance de l'espèce maternelle se développe systématiquement, chez laquelle, parmi les cellules de presque tous les organes, on trouve des inclusions, et parfois des amas, d'unités structurelles et fonctionnelles constituées de matériel génétiquement étranger de dérivés de CSE. Le terme « porc humanisé » ne peut être interprété comme la désignation d'un monstre doté d'une intelligence ou de caractéristiques externes humaines. Il s'agit simplement d'un animal dont une partie des cellules corporelles provient de CSE humaines introduites dans le blastocyste d'un porc.

Perspectives d'utilisation des cellules souches

Il est connu depuis longtemps que les maladies associées à la génopathologie des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes sont souvent éliminées après une greffe de moelle osseuse allogénique. Le remplacement du propre tissu hématopoïétique par des cellules génétiquement normales provenant d'un donneur apparenté conduit à une guérison partielle, voire totale, du patient. Parmi les maladies génétiques traitées par greffe de moelle osseuse allogénique, on peut citer le syndrome d'immunodéficience combinée, l'agammaglobulinémie liée à l'X, la granulomatose chronique, le syndrome de Wiskott-Aldrich, les maladies de Gaucher et de Hurler, l'adrénoleucodystrophie, la leucodystrophie métachromatique, la drépanocytose, la thalassémie, l'anémie de Fanconi et le sida. Le principal problème dans l'utilisation de la greffe de moelle osseuse allogénique dans le traitement de ces maladies est lié à la sélection d'un donneur apparenté compatible avec l'HbA, pour la recherche réussie duquel une moyenne de 100 000 échantillons de tissu hématopoïétique de donneur typé sont nécessaires.

La thérapie génique permet de corriger un défaut génétique directement dans les cellules souches hématopoïétiques du patient. Théoriquement, la thérapie génique offre les mêmes avantages que la greffe allogénique de moelle osseuse dans le traitement des maladies génétiques du système hématopoïétique, mais sans toutes les complications immunologiques possibles. Cependant, cela nécessite une technique permettant le transfert efficace d'un gène complet dans les cellules souches hématopoïétiques et le maintien du niveau d'expression requis, qui peut être faible dans certains types de pathologies héréditaires. Dans ce cas, même une légère reconstitution du produit protéique du gène déficient produit un effet clinique positif. En particulier, dans l'hémophilie B, 10 à 20 % du taux normal de facteur IX suffisent amplement à restaurer le mécanisme interne de la coagulation sanguine. La modification génétique du matériel cellulaire autologue s'est avérée efficace dans l'hémiparkinsonisme expérimental (destruction unilatérale des neurones dopaminergiques). La transfection de fibroblastes embryonnaires de rat avec un vecteur rétroviral contenant le gène de la tyrosine hydroxylase a assuré la synthèse de dopamine dans le système nerveux central: l'administration intracérébrale de fibroblastes transfectés a fortement réduit l'intensité des manifestations cliniques d'un modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez les animaux de laboratoire.

La perspective d'utiliser des cellules souches pour la thérapie génique des maladies humaines a posé de nombreux défis aux cliniciens et aux expérimentateurs. Les aspects problématiques de la thérapie génique sont liés au développement d'un système sûr et efficace pour le transport des gènes vers la cellule cible. Actuellement, l'efficacité du transfert de gènes vers les grandes cellules de mammifères est très faible (1 %). Ce problème est résolu de différentes manières. Le transfert de gènes in vitro implique la transfection de matériel génétique dans les cellules du patient en culture, puis leur réintroduction dans l'organisme du patient. Cette approche devrait être reconnue comme optimale pour l'utilisation de gènes introduits dans des cellules souches de moelle osseuse, car les méthodes de transfert de cellules hématopoïétiques de l'organisme vers la culture et inversement sont bien établies. Les rétrovirus sont le plus souvent utilisés pour le transfert de gènes vers les cellules hématopoïétiques in vitro. Cependant, la plupart des cellules souches hématopoïétiques sont à l'état dormant, ce qui complique le transport de l'information génétique par rétrovirus et nécessite la recherche de nouvelles méthodes efficaces de transport de gènes vers les cellules souches dormantes. Actuellement, des méthodes de transfert de gènes sont utilisées, telles que la transfection, la microinjection directe d'ADN dans les cellules, la lipofection, l'électroporation, le « canon à gènes », le couplage mécanique à l'aide de billes de verre, la transfection d'hépatocytes avec couplage d'ADN dépendant du récepteur à l'asialoglycoprotéine et l'introduction par aérosol du transgène dans les cellules de l'épithélium alvéolaire pulmonaire. L'efficacité du transfert d'ADN par ces méthodes est de 10,0 à 0,01 %. Autrement dit, selon la méthode d'introduction de l'information génétique, le succès est attendu chez 10 patients sur 100 ou 1 patient sur 10 000. Il est évident qu'une méthode à la fois efficace et sûre de transfert de gènes thérapeutiques reste à développer.

Une solution fondamentalement différente au problème du rejet de matériel cellulaire allogénique en transplantation cellulaire consiste à utiliser de fortes doses de cellules souches embryonnaires pluripotentes pour rétablir le système de contrôle de l'homéostasie antigénique de l'organisme adulte (effet Kukharchuk-Radchenko-Sirman). Cet effet repose essentiellement sur l'induction d'une tolérance immunologique par la création d'une nouvelle base de cellules immunocompétentes et la reprogrammation simultanée du système de contrôle de l'homéostasie antigénique. Après l'administration de fortes doses d'EPPC, ces dernières se fixent dans les tissus du thymus et de la moelle osseuse. Dans le thymus, les EPPC, sous l'influence d'un microenvironnement spécifique, se différencient en cellules dendritiques, interdigitées et en éléments épithéliaux-stromaux. Lors de la différenciation des EPPC dans le thymus du receveur, en même temps que les propres molécules du récepteur du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), les molécules du CMH génétiquement déterminées dans les cellules du donneur sont exprimées, c'est-à-dire qu'un double standard de molécules du CMH est établi, selon lequel une sélection positive et négative des lymphocytes T est réalisée.

Ainsi, le renouvellement du lien effecteur du système immunitaire du receveur se produit par les mécanismes connus de sélection positive et négative des lymphocytes T, mais par le double standard des molécules du CMH - les EPPC du receveur et du donneur.

La reprogrammation du système immunitaire par EPPC permet non seulement la transplantation cellulaire sans recours ultérieur à long terme à des immunosuppresseurs, mais ouvre également de nouvelles perspectives dans le traitement des maladies auto-immunes et ouvre la voie au développement de nouvelles idées sur le processus de vieillissement humain. Afin de comprendre les mécanismes du vieillissement, nous avons proposé une théorie de la diminution des espaces souches de l'organisme. Selon le principe principal de cette théorie, le vieillissement est une réduction permanente de la taille des espaces souches de l'organisme, considérés comme un réservoir de cellules souches régionales (« adultes ») (cellules souches mésenchymateuses, neuronales, hématopoïétiques, cellules progénitrices de la peau, du tube digestif, de l'épithélium endocrinien, cellules pigmentaires des plis ciliaires, etc.), compensant les pertes cellulaires du tissu correspondant lors du remodelage corporel. Le remodelage corporel est le renouvellement de la composition cellulaire de tous les tissus et organes grâce aux cellules des espaces souches, qui se poursuit tout au long de la vie d'un organisme multicellulaire. Le nombre de cellules dans les espaces souches est déterminé génétiquement, ce qui détermine la taille limitée (potentiel prolifératif) de chaque espace souche. À son tour, la taille des espaces souches détermine le rythme de vieillissement des organes, tissus et systèmes de l'organisme. Après l'épuisement des réserves cellulaires des espaces souches, l'intensité et le rythme du vieillissement d'un organisme multicellulaire sont déterminés par les mécanismes de vieillissement des cellules somatiques différenciées, dans la limite de Hayflick.

Par conséquent, au stade de l'ontogenèse postnatale, l'expansion des espaces souches peut non seulement augmenter significativement la durée de vie, mais aussi améliorer la qualité de vie en restaurant le potentiel de remodelage de l'organisme. L'expansion des espaces souches peut être obtenue par l'introduction de fortes doses de cellules progénitrices pluripotentes embryonnaires allogéniques, à condition que le système immunitaire du receveur soit simultanément reprogrammé, ce qui augmente significativement la durée de vie des souris âgées participant à l'expérience.

La théorie de la déplétion des cellules souches peut modifier les idées reçues non seulement sur les mécanismes du vieillissement, mais aussi sur la maladie elle-même et les conséquences de son traitement médicamenteux. En particulier, la maladie peut se développer suite à une pathologie des cellules souches (oncopathologie). La déplétion des réserves de cellules souches mésenchymateuses perturbe le remodelage du tissu conjonctif, ce qui entraîne l'apparition de signes externes de vieillissement (rides, relâchement cutané, cellulite). La déplétion des réserves de cellules souches endothéliales entraîne le développement d'une hypertension artérielle et d'une athérosclérose. La petite taille initiale de l'espace souche du thymus détermine son involution précoce et permanente liée à l'âge. Le vieillissement prématuré est la conséquence de la diminution pathologique initiale de la taille de tous les espaces souches de l'organisme. La stimulation médicamenteuse et non médicamenteuse des réserves de cellules souches améliore la qualité de vie en réduisant sa durée, car elle réduit la taille des espaces souches. La faible efficacité des géroprotecteurs modernes est due à leur effet protecteur sur les cellules somatiques différenciées vieillissantes, et non sur les espaces souches du corps.

En conclusion, nous tenons à souligner une fois de plus que la médecine régénérative-plastique représente une nouvelle orientation dans le traitement des maladies humaines, fondée sur l'exploitation du potentiel régénératif-plastique des cellules souches. Dans ce contexte, la plasticité désigne la capacité des cellules souches exogènes ou endogènes à s'implanter et à donner naissance à de nouvelles cellules spécialisées dans les tissus endommagés d'un organisme malade. La médecine régénérative-plastique s'adresse aux maladies humaines mortelles actuellement incurables, aux pathologies héréditaires, aux maladies pour lesquelles les méthodes de médecine traditionnelle n'ont qu'un effet symptomatique, ainsi qu'aux anomalies anatomiques, dont la restauration est l'objectif de la chirurgie régénérative-plastique reconstructive. À notre avis, il est prématuré de considérer les premières tentatives de reconstitution d'organes complets et fonctionnellement complets à partir de cellules souches comme un domaine à part entière de la médecine pratique. La médecine régénérative-plastique s'intéresse aux cellules souches, qui, selon leur source, présentent un potentiel régénératif-plastique différent. La méthodologie de la médecine plastique régénérative repose sur la transplantation de cellules souches ou de leurs dérivés.