Cellules souches embryonnaires

La découverte des cellules souches embryonnaires n'est pas le fruit du hasard, mais s'inscrit dans le contexte de la recherche scientifique en biologie du développement. Le terme « cellule souche » a été introduit en médecine en 1908, lors du congrès de la Société d'hématologie de Berlin, par Alexandre Maximov, en référence aux cellules hématopoïétiques. Bien avant l'isolement et la production de lignées stables de cellules souches embryonnaires pluripotentes, les cellules souches tératogènes (embryon-carcinome) étaient utilisées dans l'étude des processus précoces du développement, permettant d'étudier les mécanismes inconnus de l'embryogenèse, notamment la séquence d'expression des gènes précoces et des produits protéiques de leur activité.

Mais la totipotence du génome humain est-elle irrémédiablement perdue au cours du processus évolutif? Non, et l’embryogenèse en est la preuve. Si tel est le cas, quand, en principe, la seconde voie de développement évolutif sera-t-elle réalisée? Probablement lorsque l’homme entrera dans l’espace, où les conditions environnementales resteront relativement constantes pendant une période suffisamment longue. La perte de tissu osseux (déminéralisation des os en état d’apesanteur), qui subit très lentement un remodelage et une régénération, peut être considérée comme la première étape du processus d’adaptation de l’homme, en tant qu’espèce, à l’existence dans les conditions spatiales. Cependant, le prix de cette seconde voie de développement évolutif sera différent: le prix du retour de la totipotence et de la plasticité absolue de toutes les cellules sera la stérilité. Ainsi, dans ce monde de « caméléons évolutionnaires », nous devrons nous reproduire sans méiose, par bourgeonnement. Mais nous vivrons longtemps. L’immortalité de la télomérase est l’immortalité d’une amibe. Dans un organisme multicellulaire, les cellules souches sont le substrat de la longévité quantitative et qualitative.

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Sources de cellules souches embryonnaires

Aujourd'hui, les sources de cellules souches embryonnaires pour la recherche en laboratoire sont les lignées de tératocarcinome murin (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) et de tératocarcinome humain (NTERA-2, TERA-2, clone H-9), ainsi que les lignées de cellules souches embryonnaires Trauneon. Cependant, la disponibilité d'un passeport cellulaire détaillé indiquant le phénotype immunitaire, les résultats de l'analyse chromosomique, les profils d'expression de l'ARNm, les récepteurs exposés et les protéines de signalisation intracellulaire ne compense pas les lacunes importantes des lignées de cellules souches embryonnaires de tératocarcinome: perte rapide de totipotence et impossibilité de les utiliser dans les essais cliniques, tandis que la différenciation mixte en culture rend très difficile l'isolement d'une lignée spécialisée pure à partir d'une population cellulaire hétérogène. Par conséquent, la source des lignées ESC créées à des fins cliniques est généralement la masse cellulaire interne du blastocyste, les blastomères individuels des embryons au stade 8 cellules, les cellules morula des stades ultérieurs, ainsi que les cellules germinales primordiales.

Il convient de noter que les cellules de tératocarcinome, bien que pluripotentes, se caractérisent par un potentiel pluripotent significativement plus faible que celui des cellules souches embryonnaires. Leur intégration aux cellules embryonnaires conduit rarement à la formation de chimères, qui, de plus, ne forment jamais de gamètes avec le génotype des cellules de tératocarcinome. On pense que cela est dû à la survenue fréquente d'anomalies chromosomiques lors de la culture des cellules de tératocarcinome: perte du chromosome Y, trisomies diverses, délétions ou translocations.

Des tentatives répétées d'isolement d'une lignée de cellules souches embryonnaires humaines ont été menées, mais cette tâche n'a pas été résolue, car les blastocystes humains normaux sont difficiles d'accès. De plus, la fréquence des anomalies chromosomiques chez l'homme est plus élevée que dans l'embryogenèse animale. L'écrasante majorité des embryons humains précoces obtenus après fécondation in vitro présentent un mosaïcisme chromosomique chaotique et présentent souvent des aberrations numériques et structurelles. Même plus tard, au stade blastocyste, seuls 20 à 25 % des embryons humains sont constitués de cellules présentant un caryotype normal. Il était pratiquement impossible d'utiliser de tels embryons pour créer des cellules souches embryonnaires, car les zygotes étaient généralement cultivés jusqu'au stade de deux ou quatre blastomères, puis transplantés dans l'utérus. Ce n'est que relativement récemment qu'une technique fiable de culture d'ovules humains fécondés jusqu'au stade blastocyste a été développée. L'introduction de cette technique dans la pratique de la fécondation in vitro a non seulement augmenté la fréquence des implantations réussies, mais a également rendu les blastocystes normaux plus accessibles.

Les cellules germinales primordiales constituent une autre source de cellules souches pluripotentes. Contrairement aux populations progénitrices plus avancées de l'épithélium germinatif, elles ne présentent pas de bêta-intégrine à leur surface, mais expriment une forte activité de phosphatase alcaline. Il convient de noter que les populations de cellules souches issues de cellules germinales primordiales sont étudiées expérimentalement depuis les années 1980. À cette époque, une technique d'isolement de cellules germinales primordiales à partir de rudiments de gonade d'embryon de souris a été développée. Les premiers résultats infructueux de la culture de cellules germinales primordiales in vitro ont suggéré l'inutilité de ces tentatives, car les cellules, bien que survivantes, n'ont pas proliféré et sont mortes le premier jour. Il a été établi ultérieurement que les cellules germinales primordiales de souris ne se reproduisent in vitro qu'en présence de facteurs de croissance polypeptidiques spécifiques solubles et liés à la membrane dans le milieu de culture. Les résultats de nombreuses études ont montré que la présence non seulement de LIF, mais également de facteurs Steel (SIF) liés à la membrane et solubles dans le milieu de culture est nécessaire à la survie et à la prolifération des cellules germinales primaires. Ces peptides sont produits par des cellules somatiques d'embryons homozygotes pour la mutation Steel, et l'un d'eux est un ligand du proto-oncogène cKit.

Les cellules germinales primaires des mammifères et des humains sont d'origine extragonadique et sont à l'origine du développement clonal de la lignée germinale. L'origine de la lignée germinale primordiale, ainsi que de tous les tissus embryonnaires et du mésoderme extraembryonnaire, est l'épiblaste (ectoderme primaire) des embryons précoces, qui présente une organisation structurale en mosaïque. Grâce à la méthode d'ablation microchirurgicale de différentes parties de l'embryon précoce, une zone de localisation dans l'épiblaste du clone des précurseurs engagés des cellules germinales primordiales a été établie. L'utilisation de la rhodamine dextran comme marqueur cellulaire a permis d'établir que les précurseurs des cellules germinales primordiales sont localisés dans la région proximale de l'épiblaste, à proximité de l'ectoderme extraembryonnaire. La lignée germinale primordiale est issue d'un clone de 45 cellules, dont l'allocation a lieu au tout début de la gastrulation. Le clone se sépare ensuite et, lors de la gastrulation, les cellules germinales primaires pénètrent dans le mésoderme extraembryonnaire et se trouvent à la base du rudiment allantoïde, derrière la ligne primaire. De là, elles migrent vers la partie ventrale de l'endoderme de l'intestin postérieur, puis se déplacent activement le long du mésentère, peuplant les crêtes génitales à la fin de la migration. Pendant la migration, ainsi que durant les 2 à 3 premiers jours de localisation dans le rudiment gonadique, les cellules germinales primaires prolifèrent activement et subissent huit cycles de réplication. Si au début de la migration on compte environ 50 cellules germinales primaires, alors dans les crêtes génitales des embryons de souris à douze jours de développement, le nombre de cellules germinales primaires dépasse 25 000.

La similitude fonctionnelle des cellules souches embryonnaires (ESC) et des cellules germinales primordiales est démontrée par l'intégration complète de ces dernières dans le blastocyste, avec remplacement de la masse cellulaire interne et développement ultérieur complet de l'embryon, dont les tissus sont constitués uniquement des descendants des cellules germinales primordiales. Par ailleurs, les cellules germinales primordiales de souris se sont également révélées identiques aux ESC, démontrant leur capacité à se différencier dans diverses directions, à former des corps embryoïdes in vitro et à former des tératomes in vivo lorsqu'elles sont administrées par voie sous-cutanée à des souris immunodéficientes, ressemblant aux tératomes testiculaires spontanés chez les souris 129/ter.

Il a été constaté que l'ajout de LIF, de SIF membranaire et de SIF soluble au milieu permettait aux cellules germinales primaires isolées d'embryons de souris âgés de 8 jours de survivre et de se reproduire en culture pendant 4 jours, puis de mourir. De plus, la période de mort des cellules germinales primaires observée en culture coïncide avec le stade de développement des embryons de souris (12,5 à 13,5 jours), lorsque les cellules germinales primaires femelles entrent en méiose dans les rudiments des gonades et que les divisions mitotiques sont bloquées chez les cellules germinales primaires mâles. Cependant, si l'on ajoute au milieu non seulement les facteurs de croissance LIF et SIF, mais aussi FGF2, les cellules germinales primaires continuent de proliférer et des colonies de cellules capables de se multiplier même après l'élimination des facteurs de croissance (SIF et FGF) se forment dans les sous-cultures. Ces cellules peuvent être cultivées longtemps sur un substrat de fibroblastes embryonnaires sans ajout de facteur de croissance soluble LIF. Il a été proposé de nommer ces lignées cellulaires stables obtenues à partir de cellules germinales primordiales « cellules germinales embryonnaires ». Ce terme est loin d'être pertinent, car il est impossible d'obtenir des cellules germinales embryonnaires capables d'effectuer les étapes ultérieures de l'ovogenèse ou de la spermatogenèse lors de la culture de cellules EG. Cela est dû au fait que les lignées cellulaires EG, bien qu'issues de cellules germinales primordiales, acquièrent les propriétés des cellules souches pluripotentes embryonnaires en culture, mais perdent leur capacité à s'engager dans des lignées germinales. Autrement dit, les cellules germinales primordiales, une fois cultivées, perdent leurs propriétés de précurseurs de gamètes et se transforment en cellules pluripotentes de type CSE.

Il a été observé que l'introduction de cellules EG chez des souris immunodéficientes ne provoque pas de tératomes. On suppose que la perte de la capacité des cellules EG humaines à induire des tératomes est due au fait que ces lignées n'ont pas été créées directement à partir de cellules germinales primaires cultivées, mais ont été obtenues à partir de cellules isolées de corps embryoïdes. Il est donc possible qu'elles soient issues de cellules pluripotentes, mais déjà engagées.

Il convient de noter qu'il existe des différences fondamentales entre les cellules EG et les cellules germinales primordiales. Ces dernières ne permettent pas d'obtenir d'embryons chimériques de souris, ce qui indique l'incapacité des cellules germinales primordiales à s'intégrer à la masse cellulaire interne ou au trophectoderme. Les caractéristiques de la population de cellules germinales primordiales sont plus proches de celles des lignées de cellules somatiques d'embryons ultérieurs, dont l'introduction dans le blastocyste ne conduit pas non plus à la formation d'embryons chimériques.

La modification de la technique de culture des corps embryoïdes obtenus par agrégation de cellules EG a permis d'obtenir une autre population de cellules pluripotentes, appelées « cellules dérivées de corps embryoïdes » (cellules EBD), par sélection sur milieux sélectifs. La capacité des cellules EBD à proliférer en culture pendant une longue période a permis de créer des lignées cellulaires stables de cellules engagées. Des clones de cellules exprimant une large gamme d'ARNm et de marqueurs protéiques de cellules spécialisées ont été obtenus. Cette approche a finalement prouvé que les cellules germinales primaires humaines sont pluripotentes et se différencient in vitro en différents types cellulaires: neurones, cellules gliales, endothélium vasculaire, cellules hématopoïétiques, cellules musculaires et endodermiques.

Sources alternatives de cellules souches embryonnaires

Une autre source de lignées de cellules souches embryonnaires humaines pourrait être les cellules hybrides. L'implantation dans l'utérus de vaches pseudo-gestantes d'une construction hétérogène obtenue par fusion par électroporation de cellules somatiques de fœtus humain avec un ovule de vache préalablement débarrassé du pronucleus permet d'obtenir une masse cellulaire interne à partir d'un embryon artificiel aux stades de développement préimplantatoire. À cette fin, un blastocyste est obtenu à partir d'un ovule de vache avec un noyau de cellule humaine transplanté.

Au deuxième stade, un embryoblaste est isolé du blastocyste, puis les cellules souches embryonnaires (ESC) sont isolées par la méthode de Thomson. Il est à noter que les meilleurs résultats obtenus lors de l'isolement de lignées d'ESC par cette méthode ont été obtenus à partir de noyaux de cellules folliculaires ou de cellules germinales primaires conservées dans le corps humain en état d'hibernation. Cela est dû au fait que les noyaux de cellules humaines transplantées dans un œuf de vache doivent présenter des télomères non raccourcis et une activité téloméase élevée, ce qui permet d'éviter le vieillissement prématuré des clones d'ESC issus d'un œuf hybride (Repin, 2001). Les protéines marqueurs intracellulaires les plus importantes des ESC sont Oct3, Oct4, Tcf et Groucho, qui font partie des protéines dites « silencieuses de la chromatine ». Ces protéines fournissent un emballage particulièrement compact d'hétérochromatine, empêchant la formation de boucles d'euchromatine. L'emballage de la chromatine médié par ces protéines est corrélé à la totipotence du génome des ESC. Il a été établi à ce jour que les ovocytes matures bovins et humains sont les seuls types de cellules spécialisées dont le cytoplasme contient de fortes concentrations de protéines silencieuses. Sur cette base, une méthode a été développée pour obtenir des cellules souches embryonnaires hybrides par transfert de noyaux de cellules somatiques dans des ovocytes bovins énucléés. Des études in vitro préliminaires ont montré que le cytoplasme des ovocytes bovins restaure la totipotence du génome des noyaux de cellules somatiques humaines après 12 à 24 heures de culture.

Les données sur les particularités du développement préimplantatoire des embryons humains sont particulièrement intéressantes, indiquant un remplacement plus tardif des cellules totipotentes par une population de cellules pluripotentes que chez la souris. Une étude des transformations cellulaires a montré que les cellules trophoblastiques proviennent également des cellules de la masse cellulaire interne des blastocystes humains, en plus des cellules souches embryonnaires (ESC), ce qui témoigne de leur puissance totale.

On sait qu'au stade blastocyste, deux populations cellulaires distinctes apparaissent. L'une d'elles forme la couche externe du blastocyste: le trophectoderme, dont les dérivés sont les cellules trophoblastiques et d'autres composants embryonnaires du placenta. La seconde population de cellules est regroupée en une masse dense en contact avec la surface interne du trophectoderme. Les dérivés de la population de cellules de la masse cellulaire interne sont tous des tissus et des rudiments d'organes de l'embryon. Au stade de blastocyste tardif, l'endoderme extraembryonnaire se forme à partir de la masse cellulaire interne et l'épiblaste (ectoderme primaire) se forme. Dans ce cas, les cellules épiblastiques conservent leur pluripotence, tandis que la capacité de différenciation des cellules de l'endoderme extraembryonnaire est limitée.

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Obtention de cellules souches embryonnaires humaines

Jusqu'à récemment, on pensait qu'il était impossible d'obtenir des cellules souches embryonnaires (CES) à partir du trophoblaste. Cependant, une lignée de cellules souches trophectodermiques diploïdes isolées d'un blastocyste prolifère et se transforme en cellules souches dans un milieu contenant du FGF2 et de l'héparine au lieu du LIF. Si le FGF2 est retiré du milieu, les cellules trophectodermiques cessent de se multiplier, l'endoréduplication chromosomique s'y instaure et les éléments cellulaires trophectodermiques se transforment progressivement en cellules trophoblastiques géantes. Il est probable que le LIF ne stimule pas la prolifération des cellules trophectodermiques, car le FGF2 déclenche un mécanisme de trans-signalisation différent: en se liant au récepteur plasmatique (FGFR2), il active les MAP kinases ERK1 et ERK2 dans le cytoplasme. Par conséquent, lorsqu'une voie de signalisation (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) est activée dans les cellules du blastocyste, les cellules de la masse cellulaire interne sont transformées en cellules souches embryonnaires pluripotentes, et lorsque le deuxième mécanisme de transduction du signal transmembranaire (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2) est activé, des cellules souches trophectodermiques sont formées dans le blastocyste. Le choix de la voie de signalisation dépend à son tour de l'activité du gène oct4. Ce gène, qui appartient au domaine POU, est situé dans le locus t de l'autosome 17 et est exprimé pendant l'ovogenèse, pendant la période de clivage, ainsi que dans les cellules de la masse cellulaire interne du blastocyste et dans les cellules germinales primaires. Le rôle fonctionnel du gène oct4 est de coder un facteur de transcription nécessaire à l'émergence des cellules pluripotentes, à leur différenciation et à leur dédifférenciation.

L'expression du gène oct4 dans les cellules souches embryonnaires varie en fonction de l'interaction de ce facteur de transcription avec les cofacteurs. La régulation dirigée de l'expression d'oct4 dans les blastocystes a montré que lorsque son activité est réduite, la moitié des cellules forment du trophectoderme, tandis que lorsque l'expression induite d'oct4 augmente, ce sont principalement les cellules souches embryonnaires qui apparaissent.

Dans l'expérience, les cellules souches embryonnaires (ESC) ne peuvent pas être transférées dans une lignée lors de la culture de blastomères totipotents au stade de clivage, ainsi qu'au stade de gastrulation et aux stades ultérieurs du développement embryonnaire. Les cellules souches embryonnaires (ESC) de souris sont généralement isolées entre le 3,5 et le 4,5e jour de gestation, ce qui correspond aux sixième (blastocyste monocouche) et septième (blastocyste bicouche – cylindre ovulaire précoce) de l'embryogenèse normale. De toute évidence, ce n'est qu'en période préimplantatoire que les embryons de souris contiennent des populations cellulaires capables de se transformer en ESC. Par conséquent, l'isolement de lignées d'ESC n'est possible qu'à certains stades de l'embryogenèse. Le zygote et les blastomères issus du clivage sont totipotents, du point de vue de la possibilité de développement d'un embryon viable avec membranes embryonnaires et placenta. La perte de puissance totale des cellules germinales commence au stade morula tardif, lorsque l'engagement ultérieur des blastomères dépend de leur localisation. Les blastomères de la morula précoce conservent leur totipotence, car les manipulations expérimentales avec des changements dans leur localisation, comme l'inversion de leur emplacement, n'empêchent pas le développement d'un embryon à part entière.

Il a été établi que l'efficacité de l'isolement des cellules souches embryonnaires (CSE) dans une lignée est affectée par l'état des blastocystes au moment de leur explantation. L'utilisation de blastocystes après modélisation d'une diapause de sept jours dans l'appareil reproducteur de souris ovariectomisées au 3,5e jour de gestation et traitées à la progestérone facilite l'isolement de lignées de cellules souches embryonnaires. On suppose que dans ces conditions, le nombre de blastomères formant la masse cellulaire interne augmente. Il est également possible que le cycle cellulaire soit allongé et que la plupart des blastomères entrent en phase G0.

De plus, la création de lignées ESC pluripotentes stables dépend du génotype des embryons: les ESC sont assez faciles à isoler à partir de blastocystes de la lignée de souris 129, elles sont beaucoup plus difficiles à obtenir avec les souris CS7BL/6, et il est pratiquement impossible d’isoler une lignée ESC à partir de blastocystes de souris CBA/Ca. De toute évidence, les embryons précoces présentent certaines caractéristiques génétiques qui affectent le développement d’une lignée ESC pluripotente. Néanmoins, lors de la culture d’épiblastes isolés, ainsi que par sélection sélective de cellules en différenciation, des lignées ESC ont néanmoins été isolées à partir d’embryons précoces de souris CBA/Ca.

Une technique standard éprouvée pour obtenir des lignées ESC à partir de blastocystes est présentée dans les manuels de laboratoire sur les techniques expérimentales avec des embryons précoces. Des lignées ESC expérimentales peuvent également être obtenues par culture d'épiblaste isolé (ectoderme primaire) d'embryons de souris âgés de 4,5 jours, à l'aide d'une technique microchirurgicale complexe et de conditions de culture modifiées. La complexité de cette procédure est justifiée, car la fréquence de formation de lignées ESC s'est avérée significativement plus élevée que lors des travaux sur la masse cellulaire interne du blastocyste.

Pour isoler les lignées ESC, chaque clone est transféré dans un micropuits, un agrégat de 40 à 60 cellules est cultivé, puis dispersé à nouveau. De multiples répétitions de cette procédure permettent d'obtenir une lignée ESC immortalisée présentant un taux de prolifération maximal de cellules normocaryotypiques fixées sur du plastique, qui conservent leur totipotence et une activité télomérase élevée après 50 à 100 passages. Lors de la conservation des lignées ESC, le principal danger réside dans la contamination du milieu ou du sérum par des endotoxines bactériennes; même des traces d'endotoxines dans le milieu de culture provoquent la mort massive des cellules germinales immatures. Grâce à une surveillance rigoureuse de la croissance linéaire et à une dispersion rapide, les cellules ESC en culture sont capables de se diviser symétriquement, les deux cellules filles restant pluripotentes et capables d'effectuer un nombre illimité de cycles cellulaires, conservant ainsi un caryotype diploïde et une activité totale.

La sélection d'une population pure de cellules souches embryonnaires humaines peut être réalisée après transfection de leur génome par des molécules d'ADN recombinant contenant le gène codant pour la synthèse de la protéine fluorescente verte (GFP). L'expression de la GFP augmente lorsque les cellules souches embryonnaires sont cultivées dans des conditions favorisant leur prolifération, tandis qu'avec le début de la différenciation, son niveau d'expression diminue, ce qui permet la sélection de lignées cellulaires pluripotentes pures et stables sur un milieu sélectif. Lors de la culture de cellules souches embryonnaires isolées par sélection GFP, la fréquence de formation de colonies est multipliée par deux, car le puissant effet antiprolifératif des cellules différenciées est éliminé dans les conditions de culture sélective.

La traduction de cellules souches embryonnaires humaines en lignée est réalisée par isolement à partir d'embryons préimplantatoires (80 à 120 cellules) restants après fécondation in vitro. À cette fin, les embryons « excédentaires » obtenus artificiellement sont dispersés mécaniquement dans le milieu Delbecco-Eagle. Après marquage des cellules avec des anticorps monoclonaux sélectifs fluorescents, les cellules embryoblastiques sont isolées. L'embryoblaste est ensuite dispersé en cellules individuelles à l'aide d'un mélange dispase-collagénase. Les cellules dissociées sont cultivées dans un milieu spécifique (80 % milieu Delbecco + 20 % sérum de veau fœtal en présence de 500 µg/ml d'IL-6, de LIF et de SCF) sur une monocouche nourricière de fibroblastes embryonnaires des 3 premiers passages. Dans ce cas, la survie et la prolifération des cellules souches et progénitrices sont maintenues grâce à l'action de l'IL-6, du LIF et du SCF. Dans un tel milieu, les cellules souches embryonnaires (ESC) se développent sous forme de clones en suspension de cellules en boule non attachées, qui doivent être dissociés par pipetage doux et répété. De nouveaux clones apparaissent dans la culture en suspension entre le 5e et le 7e jour. Le taux de croissance maximal des ESC est atteint par dissociation répétée des clones au stade de 10 à 15 cellules. Chaque clone est ensuite transféré dans un micropuits et cultivé jusqu'à un total de 40 à 50 cellules. La procédure est répétée plusieurs fois par passages, augmentant le volume de la culture jusqu'à une densité de 5 à 10 millions de cellules par boîte de 6 cm. Grâce à ces passages, Thomson a isolé 10 clones immortels d'ESC humaines qui, après 100 passages, conservaient une activité télomérase élevée, une prolifération vigoureuse, des caractéristiques phénotypiques minimales et une puissance totale, avec la capacité de se différencier en l'une des 350 lignées cellulaires spécialisées dérivées de l'ectoderme, du mésoderme et de l'endoderme. La différenciation des cellules souches embryonnaires humaines a débuté (après changement de milieu, ajout de sérum et élimination du LIF) avec la fixation des cellules au substrat, indiquant le développement du cytosquelette et l'expression des récepteurs d'adhésion. Il est important de noter qu'avec une prolifération illimitée, les cellules souches embryonnaires humaines ont conservé un caryotype normal.

La deuxième méthode d'isolement des lignées de cellules souches embryonnaires humaines repose sur l'utilisation de cellules germinales primaires. Des études expérimentales ont montré que des lignées de cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues à partir des plis génitaux d'embryons de souris âgés de 12,5 jours. Cependant, dans ces cas, la fréquence de formation de lignées de cellules progénitrices était significativement plus faible que lors d'expériences menées sur des embryons plus anciens. Parallèlement, les cellules germinales primaires issues des gonades d'embryons de souris de 13,5 jours d'âge gestationnel ne sont pas du tout capables de se transformer en lignées.

Les premières lignées stables de cellules EG humaines pluripotentes ont été obtenues à partir de gonocytes primaires isolés des gonades d'embryons âgés de 5 à 9 semaines. Les cellules isolées ont été cultivées sur un substrat de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés en milieu DMEM avec du sérum fœtal supplémenté en mercaptoéthanol, forskoline et facteurs de croissance humains recombinants (FGF et LIF). Après 7 à 12 jours, des colonies multicellulaires sont apparues dans la culture, correspondant aux cellules EG humaines par leurs caractéristiques morphologiques et leurs marqueurs moléculaires. Après agrégation, ces cellules ont formé des corps embryoïdes, au cours desquels des cellules spécialisées caractéristiques des dérivés des trois feuillets germinaux sont apparues. Au cours de 10 à 20 passages, les lignées cellulaires EG ont conservé un caryotype normal et n'ont pas perdu leur pluripotence.

Il a également été démontré que l'action combinée du LIF, des facteurs Steel membranaires et solubles, et du TGF-β modifie le programme de développement des cellules germinales primordiales. Au lieu de cesser leurs divisions mitotiques et de commencer leur différenciation vers l'ovogenèse ou la spermatogenèse, les cellules germinales primordiales continuent de proliférer. Après plusieurs cycles mitotiques supplémentaires, elles deviennent similaires aux cellules épiblastiques et, perdant leurs propriétés de précurseurs germinaux, se transforment en cellules souches embryonnaires pluripotentes (EG).

Français Ainsi, en 1998, des lignées immortalisées de cellules germinales primordiales ont été isolées pour la première fois à partir du rudiment génital du tissu d'autopsie fœtale humaine. Dans l'embryogenèse humaine, les cellules germinales primordiales apparaissent dans le sac vitellin à la 3e semaine de développement, et aux 4e-5e semaines, ces cellules migrent vers la zone du tubercule génital, où elles forment des populations dormantes de gonocytes primaires. À l'état inactif, les cellules germinales primordiales sont conservées dans l'embryon jusqu'à la naissance. Des lignées de cellules germinales primordiales sont isolées du tubercule génital fœtal d'embryons de 5 à 9 semaines, dont le tissu extrait est traité ex tempore avec un mélange de collagénases de types IV-V, d'hyaluronidase et de DNase pour augmenter le rendement cellulaire quantitatif et qualitatif. Les cellules germinales primordiales dans le tissu du tubercule génital fœtal sont entourées de cellules de Sertoli stromales (mésenchymateuses). La fonction des cellules de Sertoli est de produire des facteurs anti-apoptotiques (ligand Fas), des mitogènes et des immunosuppresseurs qui protègent les cellules germinales des attaques immunitaires de l'organisme. De plus, le microenvironnement stromal du tubercule génital joue un rôle important dans la maturation des gamètes. Les cellules germinales primaires isolées sont implantées en culture sur une couche stromale nourricière constituée de fibroblastes fœtaux des trois premiers passages. La combinaison de mitogènes la plus efficace est un complexe composé de LIF, de FGF et de forskoline (un stimulateur de la formation d'AMPc). La prolifération des cellules germinales primaires in vitro nécessite l'ajout de sérum fœtal, en présence duquel la reproduction des gonocytes primaires en culture s'accompagne de la formation de clones de cellules sphériques non fixées au substrat.

Aux National Institutes of Health (États-Unis), sur la base d'une synthèse des données existantes sur les méthodes d'isolement de lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CES) à partir de blastocystes, une conclusion préliminaire a été tirée: l'isolement réussi des CES est plus probable lors de la culture de blastocystes présentant une masse cellulaire interne bien formée (Cellules souches: progrès scientifiques et orientations futures de la recherche. Nat. Inst. of Health (États-Unis). De ce point de vue, la source optimale de CES pour la création de lignées est constituée de blastocystes humains au 5e jour de développement, dont le trophectoderme doit être soigneusement retiré lors de l'isolement de la masse cellulaire interne. La masse cellulaire interne isolée, composée de 30 à 35 cellules à ce stade, doit être cultivée sur un substrat de fibroblastes embryonnaires de souris, condition essentielle à la formation de colonies de CES en culture.

Analyse des caractéristiques phénotypiques des cellules souches embryonnaires

L'analyse comparative interspécifique des caractéristiques phénotypiques des cellules souches embryonnaires (CSE) est particulièrement intéressante. Il a été constaté que les colonies de CSE humaines sont des amas denses de cellules aplaties, de type épithélial, tandis que les corps embryoïdes de souris sont constitués d'un conglomérat lâche de cellules arrondies. Chez les CSE humaines, le rapport noyau-plasma est inférieur à celui des CSE de souris. Les cellules souches embryonnaires de singe forment des colonies plus plates, aux bords irréguliers. Les cellules individuelles sont facilement visibles dans les premiers clones de CSE de primates. Les CSE en prolifération de toutes les espèces animales étudiées n'expriment pas les molécules du CMH de classe I et II. Parallèlement, les CSE humaines réagissent positivement aux anticorps TERA 1-60 et GCTM-2, ce qui indique la présence de protéoglycanes kératine/chondroïtine sulfate à leur surface, caractéristiques des cellules souches de l'embryon (térato)-carcinome. L'expression du gène oct4 dans les cellules souches embryonnaires humaines (CES) de toutes les espèces animales suggère que, malgré les différences phénotypiques, le même ensemble de gènes responsables du maintien de la pluripotence est apparemment activé dans les CES humaines et murines (Pérou, 2001). De plus, les lignées CES isolées d'embryons de rat, de porc, de lapin, de primate et de bovin présentent des caractéristiques morphologiques similaires, un ensemble similaire de marqueurs d'identification moléculaire et un mécanisme moléculaire presque identique pour la mise en œuvre des programmes d'embryogenèse, ce qui nous permet d'envisager sous un nouvel angle le problème de la xénotransplantation.

Contrairement à l'embryogenèse normale in vivo, la prolifération des cellules souches embryonnaires (CES) in vitro ne s'accompagne pas de la formation de feuillets germinaux et se produit dans un contexte de blocage des gènes Hox homéotiques, c'est-à-dire sans organogenèse. Les gènes de segmentation étant inactifs, il est impossible de reproduire des périodes de l'embryogenèse telles que la ponte des somites, la segmentation de l'embryon, la formation du sac vitellin, de l'allantoïde et d'autres organes et tissus provisoires en culture de CES. Les CES cultivées semblent avoir gelé au début du processus de formation de 350 lignées de restriction de cellules spécialisées. Ainsi, un clone de cellules progénitrices filles et une CES localisée centralement ne représentent qu'un modèle d'embryon, au cours duquel différentes lignées de cellules spécialisées se forment simultanément dans différentes régions tissulaires, issues toutefois de précurseurs communs. Malgré la présence minimale de récepteurs à la surface des cellules souches embryonnaires (ESC), celles-ci conservent la capacité de réaliser des processus morphogénétiques primitifs, imitant les structures volumétriques d'un embryon précoce: une suspension d'ESC en culture s'agrège et forme des structures ressemblant à des blastocystes, voire à des embryons plus tardifs (cylindres d'œuf). Ces agrégats en suspension sont respectivement appelés corps embryoïdes simples et complexes.

Dans la différenciation mixte, les gènes précoces de l'ectoderme (oct3, fgf-5, nodal), de l'endoderme (gata-4), du mésoderme (brachyure), du mésoderme cardiogénique (pkh-2.5), du tube neural (msx3) et de l'hématopoïèse (elkf) sont exprimés simultanément dans différentes cellules d'un même corps embryoïde. En utilisant diverses combinaisons de facteurs de croissance et de cytokines pour une action ciblée sur la formation des cellules de la couche germinale in vitro, il a été possible dans un certain nombre de cas d'obtenir des corps embryoïdes dans lesquels les gènes de l'ectoderme ou du mésoderme étaient exprimés préférentiellement, ce qui ouvre la voie à la modélisation de la gastrulation et des phases initiales de l'organogenèse.

La croissance clonale des cellules souches embryonnaires (CSE) témoigne d'une division cellulaire asymétrique: une seule CSE, au centre du clone, conserve un potentiel de prolifération illimité, tandis que la seconde cellule fille génère une génération de cellules progénitrices déjà en cours de différenciation. Par conséquent, le taux de prolifération du clone à la périphérie du corps embryoïde est plus élevé qu'au centre. Les cellules marginales du clone en croissance subissent une différenciation spontanée et désordonnée, migrent ou meurent par apoptose. Ces événements déterminent le devenir du clone: si le taux de prolifération dépasse le taux de migration et de mort cellulaire apoptotique, le clone continue de croître en taille, la stabilisation se produit lorsque le taux d'apoptose et le taux de formation de nouvelles cellules sont égaux, et la régression survient lorsque le rapport de ces processus est inverse. Les cellules progénitrices se divisent symétriquement, c'est-à-dire que les deux cellules filles se différencient ensuite en lignées cellulaires matures spécialisées. Le rapport CSE/cellules progénitrices varie, mais le nombre de CSE ne représente toujours qu'une fraction de pour cent de la population de cellules progénitrices. Par conséquent, seuls un pipetage soigneux et une désagrégation rapide des clones peuvent augmenter le nombre de cellules souches embryonnaires en culture. La désagrégation des clones au stade de 10 à 12 cellules s'est avérée la plus efficace pour obtenir le rendement maximal de cellules souches embryonnaires. La direction et le degré de différenciation des cellules du corps embryoïde dépendent de leur localisation. Les cellules externes du corps embryoïde n'expriment pas le gène oct4 et se différencient en cellules de l'endoderme primaire, à partir desquelles se forment ensuite les cellules épithéliales de l'endoderme extraembryonnaire pariétal et viscéral. Les cellules internes du corps embryoïde expriment le gène oct4 et conservent leur pluripotence pendant 48 heures de culture. Cependant, la culture est ensuite restructurée morphologiquement en une monocouche épithéliale et l'expression des gènes contrôlant le développement de l'ectoderme primaire commence. Ensuite, le processus de cytodifférenciation désordonnée totale commence avec l'apparition de divers types cellulaires dérivés des trois feuillets germinaux. Lors de la différenciation spontanée des cellules du corps embryoïde, des agrégats portant des marqueurs endodermiques, sous forme de fragments (kystes) du sac vitellin, apparaissent en premier. Ensuite, les angioblastes et les cellules endothéliales des capillaires en croissance apparaissent dans ces structures. Aux stades finaux de la différenciation spontanée, diverses cellules différenciées terminalement se développent à partir des cellules internes du corps embryoïde, notamment des neurones, des éléments gliaux, des cardiomyocytes, des macrophages et des érythrocytes. Dans une certaine mesure (compte tenu de l'inversion spatiale de la formation des couches de tissu germinatif), l'utilisation des corps embryoïdes permet d'étudier les processus morphogénétiques in vitro et d'analyser les mécanismes moléculaires des premières phases de la cytodifférenciation embryonnaire.ainsi que d’établir le rôle de gènes spécifiques dans la mise en œuvre de ces processus.

Ainsi, au sein du clone, on trouve des cellules dans lesquelles différents programmes de développement génétique ont été découverts: les cellules souches embryonnaires (ESC), les progéniteurs précoces et les populations de progéniteurs en différenciation. La culture des ESC par les méthodes de culture en goutte suspendue ou de culture de masse, sans couche nourricière et sans ajout de LIF au milieu, conduit inévitablement à la formation de corps embryoïdes. La morphologie des cellules des couches externe et interne des corps embryoïdes diffère. La couche externe est constituée de grandes cellules ramifiées. Leur surface exposée à l'environnement est recouverte de nombreuses microvillosités. La couche externe de cellules est séparée de la couche interne par une membrane basale ressemblant à la membrane de Reichert, tandis que les cellules de la couche interne des corps embryoïdes sont un épithélium cylindrique. Morphologiquement, la couche interne, bien que contenant de nombreuses cellules en division, ressemble davantage à des colonies indifférenciées d'ESC.

Caractéristiques des cellules souches embryonnaires humaines

L'absence d'interactions de signalisation parenchymateuse-mésenchymateuse, dans le contexte du blocage du gène de l'homéose, entraîne une croissance désordonnée des cellules souches embryonnaires en culture, perturbant la formation et le développement de l'infrastructure des organes provisoires. Cette croissance désorganisée et cette différenciation spontanée désordonnée des cellules souches embryonnaires en culture sont dues à l'absence de marquage mésenchymateux de la structure stromale des futurs organes: in vitro, il est tout à fait possible de former des millions d'hépatocytes, mais il est impossible d'obtenir un seul lobule hépatique incluant des éléments structurels et fonctionnels tels que les sinus, les espaces de Disse et les cellules de Kupffer.

On pense que la pluripotence des cellules souches embryonnaires (CES) se réalise exclusivement lors de l'embryogenèse, avec la formation des tissus et organes de l'embryon, tandis que le placenta et le cordon ombilical sont des dérivés du trophoblaste. Les CES, enfermées dans la membrane trophectodermique, génèrent séquentiellement des clones de cellules provisoires qui mettent en œuvre le programme de développement grâce à l'ARNm combinatoire de la matrice topographique volumétrique de Nokhteyov. Ce dernier prédétermine la disposition spatiale, la forme et la taille, le nombre de cellules des organes provisoires et définitifs, ainsi que l'assemblage du parenchyme en unités structurales et fonctionnelles. Cependant, les CES restent le seul type de cellules dont le mécanisme moléculaire de mise en œuvre de leur potentiel est totalement déconnecté du programme de développement génétique, et elles sont privées de la capacité d'interagir avec d'autres cellules en raison du blocage des systèmes de perception des récepteurs et de transsignalisation. Cependant, une activation adéquate des cellules souches embryonnaires (CSE) conduit au développement progressif du programme d'embryogenèse, aboutissant à la naissance d'un organisme pleinement formé, composé de milliards de cellules, prêt pour la vie extra-utérine. Sur ce cheminement à court terme, mais incroyablement long, dans l'espace cellulaire, des erreurs surviennent inévitablement, tant dans les mécanismes moléculaires assurant l'activité vitale des cellules que dans les programmes contrôlant leur prolifération, leur différenciation et leur spécialisation. Par conséquent, en pharmacogénomique moderne, les maladies de la structure moléculaire et celles de la programmation cellulaire sont considérées séparément. De plus, l'action de la plupart des nouveaux médicaments vise à corriger les programmes de différenciation, de prolifération et d'organogenèse, ainsi qu'à régénérer les organes et les tissus. Chez l'adulte, les CSE permettent de contrôler le comportement des cellules souches/progénitrices transplantées dans le cerveau, le foie, la rate, la moelle osseuse et d'autres organes humains afin de restaurer le parenchyme endommagé des organes du receveur en différenciant et en spécialisant les cellules donneuses sur la matrice mésenchymateuse préservée. Essentiellement, le programme de totipotence commence à se concrétiser au niveau des génomes de l'ovocyte, du zygote et du blastomère; cependant, ces cellules n'ont pas encore été clonées et soumises à des passages en quantités suffisantes pour les besoins de la médecine expérimentale et pratique. Par conséquent, les cellules souches embryonnaires (ESC) demeurent une source unique d'information génétique contenant des codes pour une cartographie tridimensionnelle de l'embryon et des codes pour la restriction linéaire de lignées cellulaires spécialisées pendant la gastrulation.

Le potentiel régénératif quasi illimité des cellules souches embryonnaires (CSE) est dû au fait que leur génome, contrairement à l'appareil génétique des cellules somatiques différenciées, conserve sa pluripotence. L'une des manifestations de l'état de dormance de l'information génétique intégrée aux CSE est le phénotype dit minimal: un nombre limité de récepteurs sont exprimés à la surface des CSE et, par conséquent, très peu de programmes de trans-signalisation sont déployés pour l'interaction de l'appareil nucléaire de la cellule avec son microenvironnement. Dans le contexte d'hibernation des gènes responsables de la restriction des lignées cellulaires spécialisées et de la différenciation cellulaire, seuls environ 30 gènes sur 500 sont activés, dont les produits assurent la connexion de la cellule avec son microenvironnement. Grâce à la méthode d'analyse sérielle de l'expression génique, il a été démontré qu'avec le fonctionnement conjoint des principales cellules fonctionnelles du génome régulant l'énergie et le métabolisme dans les cellules somatiques et les cellules souches embryonnaires (CES), ces dernières présentent un très faible taux d'ARNm des récepteurs, de protéines G, de messagers secondaires, de transcriptases, de cofacteurs d'expression et de répression, c'est-à-dire l'ensemble du système de transmission transmembranaire du signal régulateur à la cellule. Ceci est dû à l'absence ou à la très faible expression des gènes de transsignalisation. Pendant la période de différenciation induite dans le génome des CES, 18 gènes fonctionnels cessent de fonctionner de manière synchrone, dans le contexte de l'activation de 61 gènes de transsignalisation contrôlant la synthèse des récepteurs d'adhésion cellulaire, des composants de la matrice extracellulaire, des transcriptases de restriction et des éléments messagers du système de transmission du signal vers l'appareil nucléaire à partir des récepteurs de la membrane plasmique cellulaire. Parallèlement, l'expression des gènes responsables de la synthèse des protéines silencieuses est bloquée, ainsi que celle des co-inhibiteurs de l'expression génique qui assurent la totipotence du génome des CES.

Des marqueurs génétiques ont été identifiés pour les cellules des trois feuillets germinaux. L'identification du feuillet ectodermique est réalisée par l'expression des gènes nodal, oct3 et fgf-5, celle des cellules mésodermiques par les gènes brachyury et zeta-globine, et celle de l'endoderme par l'expression du gène gata-4. Lors de l'embryogenèse normale, pendant la gastrulation, on observe une migration active de populations immatures de cellules souches et progénitrices, marquant localement les zones de développement des os de la face du crâne, de certaines parties du cerveau, du système nerveux périphérique, du système de conduction cardiaque et du thymus, dont les tissus sont formés à partir de clones de cellules migrantes. Le marquage des cellules par les gènes précoces du feuillet germinatif facilite l'analyse topographique des processus de migration des cellules précurseurs dans l'embryon en développement. Il a été établi, en particulier, que dans les agrégats de cellules d'embryocarcinome P19, l'expression du premier gène mésodermique, brachyury, débute pendant la période de diminution de l'expression des gènes de l'activateur tissulaire du plasminogène, de l'α-fœtoprotéine, de la kératine 8 et de la kératine 19, marqueurs des premières populations mésodermiques migrantes. Par conséquent, la formation de tissus d'origine mésodermique ne débute qu'après l'achèvement du processus de migration ponctuelle et de dispersion des cellules progénitrices mésodermiques.

Malgré des caractéristiques phénotypiques extrêmement limitées et l'absence de la plupart des unités de signalisation trans, les cellules souches embryonnaires expriment encore des molécules réceptrices permettant leur identification. Il est à noter que les antigènes marqueurs des cellules souches embryonnaires se sont avérés courants chez l'homme et les primates. Le plus souvent, des anticorps marqués contre les antigènes membranaires SSEA-3 et SSEA-4 (antigènes lipidiques uniques représentant un complexe du glycolipide GL7 avec l'acide sialique), ainsi que les glycoprotéines à haut polymère TRA-1-81 et TRA-1-60, sont utilisés pour le marquage des cellules souches embryonnaires. De plus, les cellules souches embryonnaires expriment l'antigène embryonnaire spécifique SSEA-1, la phosphatase alcaline endogène et le facteur de transcription spécifique Oct4. Ce dernier est nécessaire au maintien des mécanismes de prolifération des cellules souches embryonnaires: le facteur de transcription spécifique Oct4 active l'expression du gène du facteur de croissance des fibroblastes 4 et stabilise l'expression de la boîte de gènes responsable de la réplication illimitée de l'ADN dans les cellules immatures. Les protéines marqueurs intracellulaires les plus importantes sont Oct3, Oct4, Tcf et Groucho, qui sont apparentées aux protéines silencieuses de la chromatine.

Presque immédiatement après de nombreuses années de tentatives fructueuses de culture de cellules souches embryonnaires extracorporelles (CES) et l'obtention des premières cultures de cellules souches isolées de blastocystes de souris et de cellules germinales primaires, une phase de recherche sur le potentiel pluripotent des CES a débuté avec leur introduction dans des embryons à des stades précoces de développement. Il a été démontré qu'aux stades morula et blastocyste, les CES sont capables de former des embryons chimériques dans lesquels les descendants des CES donneuses sont détectés dans tous les tissus somatiques et même dans les gamètes. Ainsi, en biologie du développement, l'utilisation des CES a permis d'établir un pont entre les études expérimentales in vivo et in vitro, ce qui a considérablement élargi les possibilités d'étude des processus de formation des tissus et organes primaires, de leur différenciation et de l'organogenèse embryonnaire.

Il est clairement établi qu'in vivo, au cours de l'embryogenèse, les cellules souches embryonnaires (CES) sont intégrées à la masse cellulaire de l'embryon précoce, et leurs dérivés sont présents dans tous les organes et tissus. Les CES colonisent une lignée de cellules germinales dans l'embryon chimérique, dont les descendants forment des ovules et des spermatozoïdes à part entière. Les cellules souches embryonnaires sont clonogéniques: une seule CES est capable de créer une colonie de cellules génétiquement identiques, dotées de marqueurs moléculaires, parmi lesquels l'expression du gène oct4 et de la phosphatase alcaline, une activité télomérase élevée et l'expression de certains antigènes embryonnaires.

Pour étudier les mécanismes de l'embryogenèse à l'aide des cellules souches embryonnaires (CES), une méthode de chimérisation de la morula a été développée. Cette méthode consiste à créer une construction biologique à l'extérieur de laquelle se trouve une couche de blastomères tétraploïdes receveurs, et à y introduire des CES donneuses. Ainsi, le trophoblaste est formé à partir des descendants des blastomères tétraploïdes receveurs, ce qui assure l'implantation et la placentation. Les CES donneuses agissent comme une masse cellulaire interne à partir de laquelle se forment le corps d'un embryon viable et une lignée de cellules germinales progénitrices primaires. L'intérêt des CES pour la recherche réside non seulement dans la préservation de la pluripotence lors des manipulations in vitro de leur génome, mais aussi dans la préservation de leur capacité à participer à la formation des cellules germinales primaires d'un embryon chimérique. Il a été démontré que les descendants d'une seule CES génétiquement modifiée peuplent tous les rudiments primaires et les tissus en développement d'un embryon chimérique obtenu par agrégation ou co-culture de cette cellule avec un embryon à 8 cellules. Lors de la transplantation de cellules souches embryonnaires transfectées avec le gène de la protéine fluorescente verte dans la morula de souris, des descendants fluorescents de cette cellule ont été retrouvés dans tous les tissus étudiés de l'embryon en développement (Shimada, 1999). La transplantation de cellules souches embryonnaires dans la morula permet de créer des souris viables dont l'organisme est constitué uniquement des descendants de la cellule souche donneuse, ce qui ouvre la voie à diverses options de clonage thérapeutique. Cette approche méthodologique est aujourd'hui utilisée avec succès pour étudier des problèmes de biologie du développement, notamment pour analyser les mécanismes d'inactivation génétique du chromosome X ou l'instabilité épigénétique des cellules souches embryonnaires. La transplantation de cellules souches embryonnaires dans un embryon précoce est également utilisée en biotechnologie agricole, ainsi que dans les expériences de thérapie génique.

La transplantation de cellules souches embryonnaires génétiquement modifiées (CSE) permet de tester des cellules cibles de gènes mutants. Les CSE cultivées in vitro sont utilisées en biotechnologie pour créer des souris knock-out. À cette fin, le gène à étudier est retiré des CSE par recombinaison homologue (knock-out) et les cellules dépourvues de ce gène sont isolées sur un milieu sélectif. Les CSE knock-out sont ensuite introduites dans le blastocyste ou agrégées avec des blastomères de morula. Les embryons précoces chimériques ainsi obtenus sont transplantés chez des femelles receveuses, et les individus dont les gamètes sont nullizygotes pour un gène donné sont sélectionnés parmi les souris nouveau-nées. Cette technologie a permis de créer de nombreuses lignées de souris knock-out, largement utilisées en biologie expérimentale et en médecine expérimentale. Ces modèles biologiques permettent d'étudier l'importance de certains gènes dans le développement embryonnaire, ainsi que leur rôle dans les mécanismes des maladies et pathologies humaines. De plus, les lignées animales knock-out sont utilisées dans les tests précliniques de nouvelles méthodes de thérapie génique. Par exemple, en transfectant l'allèle normal d'un gène mutant dans le génome des cellules souches embryonnaires (ESC), il est possible de corriger efficacement une mutation affectant le système hématopoïétique. L'introduction de gènes étrangers dans les cellules souches embryonnaires (ESC) permet la création rapide de lignées d'animaux de laboratoire transgéniques homozygotes. Il convient toutefois de noter que la technique de délétion génique par recombinaison ciblée n'a jusqu'à présent été développée de manière fiable que pour les cellules souches embryonnaires (ESC) de souris. L'utilisation de cellules souches embryonnaires (ESC) de souris doublement knock-out a permis d'établir le rôle fonctionnel de la région du groupe de gènes sur le chromosome 7 (une copie de la région génomique du chromosome humain 19) et de la région proximale du chromosome 11 (une copie du chromosome humain 5g); la délétion de ces gènes dans les cellules souches embryonnaires de souris a permis d'évaluer la fonction de leurs analogues chez l'homme.

Les possibilités d'étude de la fonction des gènes de l'embryogenèse humaine se sont élargies. Leur transfection dans le génome des cellules souches embryonnaires humaines (CES) d'animaux de laboratoire a notamment permis de clarifier le rôle du gène crypto dans la formation et le développement du mésoderme cardiogénique, et du gène pax-6 dans l'embryogenèse oculaire. Les premières cartes d'expression génique des cellules souches embryonnaires immatures proliférantes de tératocarcinomes et de blastocystes de souris sont en cours d'élaboration, et la répression suppressive des gènes de transsignalisation dans les CES a été confirmée. La combinaison de 60 à 80 cellules souches embryonnaires mutantes et de 20 à 30 cellules d'embryons de souris préimplantatoires normaux conduit au développement d'embryons chimériques dont les ébauches d'organes sont constituées de cellules donneuses et receveuses, ce qui permet de clarifier le rôle de gènes inconnus dans la gastrulation et l'organogenèse. La carte fonctionnelle des gènes des embryons de souris en développement a été complétée par des informations sur le rôle du gène sf-1 dans la formation de la glande surrénale et des gonades, du gène wt-1 dans la formation du rein, des gènes de la famille myoD dans la formation du muscle squelettique et des gènes de la famille gata-1-4 dans la maturation de restriction des rudiments de l'érythropoïèse et de la lymphopoïèse.

Français La désactivation dirigée des allèles maternels et paternels des gènes dans les cellules souches embryonnaires (ESC) à l'aide de recombinases vectorielles a permis de clarifier les fonctions de divers gènes au début de l'embryogenèse, et la technologie de transfert dirigé de gènes humains inconnus dans les ESC de souris contribue à la découverte de nouveaux gènes mutants responsables du développement de pathologies héréditaires graves. Grâce à la méthode de knock-out, l'importance obligatoire de certains gènes pour la formation des tissus embryonnaires a été déterminée: gata-4 – pour le myocarde; gata-1 – pour la lignée érythroïde du tissu hématopoïétique; myoD – pour les muscles squelettiques; brachyury – pour le mésoderme; transcriptases de restriction hnf3 et hnf4 – pour les cellules souches hépatiques; rag-2 – pour la formation de clones de lymphocytes T et B (Repin, 2001). La double délétion de gènes dans les cellules souches embryonnaires (CSE) a ouvert la voie à l'étude du rôle fonctionnel des gènes du feuillet germinatif, de la segmentation et de l'homéose, et la transplantation de CSE a permis d'obtenir des embryons hybrides interspécifiques viables. Grâce à une technique améliorée de transplantation d'une CSE d'un seul donneur dans un embryon à 8 cellules, la chimérisation au niveau cellulaire de nombreux organes de l'embryon receveur a été démontrée. Il convient de noter que des germes cellulaires de tissu humain ont été découverts dans les organes de souris receveuses après l'introduction de cellules souches hématopoïétiques humaines dans le blastocyste. Il a été établi que les CSE pluripotentes circulent dans le sang des embryons de souris pendant la période de formation des organes. Il est possible que leur fonction biologique réside dans l'organisation embryonnaire du futur système immunitaire. Grâce aux cellules souches embryonnaires humaines (CSE), des modèles adéquats de pathologie génétique humaine ont été reproduits en laboratoire: la double inhibition du gène de la dystrophine modélise la dystrophie musculaire de Duchenne chez la souris et la désactivation du gène atm (contrôle de la synthèse de la chromatine signal kinase) – ataxie-télangiectasie. Dans cette maladie héréditaire mortelle de l'enfant, la dégénérescence des cellules de Purkinje du cervelet se développe en raison de défauts de réparation de l'ADN, qui s'accompagnent d'une involution du thymus due à la mort des cellules proliférantes. Le tableau clinique, la physiopathologie et la morphologie pathologiques de l'ataxie-télangiectasie, reproduits par l'introduction d'informations génétiques pathologiques dans les CSE, chez les souris chimères correspondent à ceux de l'homme. Outre l'ataxie-télangiectasie, en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines (ESC) et des souris knock-out, des modèles expérimentaux de certaines maladies humaines homozygotes héréditaires associées à une pathologie du métabolisme des glucides et des lipides, au catabolisme des acides aminés et à l'excrétion du cuivre et de la bilirubine ont été développés, ce qui a considérablement élargi les capacités de la médecine expérimentale au stade des tests précliniques de nouvelles méthodes de traitement des maladies humaines correspondantes.

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Utilisation de cytohybrides de cellules souches

Les cellules hybrides obtenues par fusion de cellules souches embryonnaires (ESC) avec des cellules somatiques constituent un modèle pertinent et prometteur pour l'étude de la pluripotence des cellules souches et la reprogrammation des chromosomes des cellules différenciées. Les cytohybrides obtenus par fusion de cellules souches embryonnaires (ESC) avec des cellules différenciées d'un animal adulte permettent d'étudier les relations entre des génomes d'âges différents: une situation unique se présente lorsque des chromosomes homologues provenant de cellules à différents stades de différenciation et de maturité sont localisés dans le même noyau, où ils peuvent facilement échanger des signaux régulateurs trans-actifs. Il est difficile de prédire comment les systèmes épigénétiques cis-régulateurs des chromosomes homologues, formés au cours du développement individuel, réagiront à l'influence des signaux trans-actifs émanant des génomes embryonnaires apparentés. De plus, la ségrégation des chromosomes parentaux se produit dans les cellules hybrides, ce qui permet d'étudier l'interaction des génomes au niveau des chromosomes individuels, c'est-à-dire d'identifier potentiellement la participation de chromosomes spécifiques au maintien de la pluripotence ou, inversement, à la sortie vers la différenciation.

Les cytohybrides obtenus par fusion de cellules tératocarcinomes pluripotentes et de cellules somatiques différenciées ont servi de premier modèle expérimental pour étudier l'interaction de génomes présentant différents « histoires développementales ». Dans certains cas, ces cellules hybrides ont conservé des propriétés pluripotentes à un niveau relativement élevé. En particulier, in vivo, des cellules hybrides tératocarcinome-somatiques ont induit le développement de véritables tératomes contenant des dérivés des trois feuillets germinaux et, in vitro, en cultures en suspension, elles ont formé des corps embryoïdes. Même dans les cytohybrides interspécifiques de ce type, la présence d'antigènes embryonnaires a été observée lorsque les partenaires somatiques de la fusion avec les cellules tératocarcinomes étaient des lymphocytes ou des thymocytes. Il est à noter que les cytohybrides créés par fusion de cellules tératocarcinomes avec des fibroblastes correspondaient au phénotype des fibroblastes.

Le fait le plus important est que, dans les cellules hybrides tératocarcinome-somatiques, des signes de reprogrammation du génome cellulaire différencié sont apparus, caractérisés par la réactivation de gènes individuels ou du chromosome X inactif du partenaire somatique. Ainsi, les résultats des études sur les cytohybrides de type tératocarcinome-somatiques indiquent que la pluripotence est souvent préservée dans les cellules hybrides et qu'il existe des signes de reprogrammation du génome du partenaire somatique.

Lors d'expériences visant à obtenir des cellules hybrides embryonnaires intraspécifiques par fusion de cellules souches embryonnaires de souris avec des splénocytes adultes, les caractéristiques de ces cytohybrides ont été étudiées, la ségrégation des chromosomes parentaux a été analysée et la pluripotence du génome hybride a été évaluée. Les cellules hybrides intraspécifiques obtenues par fusion de cellules de tératocarcinome avec des cellules somatiques se caractérisent généralement par un faible niveau de ségrégation chromosomique et un caryotype tétraploïde ou quasi tétraploïde. Une composition chromosomique similaire a été observée chez les cytohybrides lors de la fusion de cellules germinales primaires avec des lymphocytes. Parallèlement, les cellules hybrides interspécifiques obtenues par fusion de cellules de tératocarcinome de souris avec des lymphocytes de vison ont montré une ségrégation intense des chromosomes du partenaire somatique.

Une étape qualitativement nouvelle dans l'étude de la ségrégation des chromosomes parentaux chez les hybrides intraspécifiques a commencé après le développement d'une méthode d'analyse des microsatellites utilisant la réaction en chaîne par polymérase, grâce à laquelle plusieurs centaines de marqueurs ont été trouvés pour chaque chromosome de souris, permettant une discrimination fiable de n'importe quelle paire de chromosomes homologues dans les cellules hybrides.

Français En fusionnant des cellules souches embryonnaires humaines (ESC) (cellules HM-1 déficientes en activité hypoxanthine phosphoribosyltransférase, 2n = 40, XY, isolées de blastocystes de souris 129/01a) avec des splénocytes de souris DD/c congéniques, il a été possible d'obtenir un ensemble de clones hybrides morphologiquement similaires aux ESC. Tous les clones ont été isolés sur un milieu sélectif dans lequel seules les cellules avec une activité hypoxanthine phosphoribosyltransférase active peuvent se développer. L'analyse électrophorétique a montré que tous les clones avaient une variante allélique de l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase caractéristique des souris DD/c. L'analyse cytogénétique a montré que trois des quatre clones hybrides avaient un ensemble de chromosomes quasi diploïdes. Un clone quasi tétraploïde contenait deux populations de cellules hybrides, dont l'une était tétraploïde et la seconde, plus petite, était diploïde.

L'analyse des microsatellites, permettant la discrimination de n'importe quelle paire de chromosomes homologues des souris 129/01a et DD/c, dans des clones hybrides avec un ensemble quasi diploïde, a montré que dans deux clones, il y avait une nette élimination préférentielle des autosomes du partenaire somatique. La plupart des autosomes des clones HESS2 et HESS3 présentaient des marqueurs de la lignée 129/01a, c'est-à-dire du partenaire pluripotent. Les chromosomes 1 et I faisaient exception: dans les clones HESS2 et HESS3, en plus des marqueurs des cellules HM-1, les marqueurs du partenaire somatique étaient présents en faible quantité. De tels résultats pourraient refléter une ségrégation incomplète des chromosomes 1 et I du partenaire somatique et sont cohérents avec les données cytogénétiques selon lesquelles une trisomie pour ces chromosomes est observée dans 30 à 40 % des cellules des clones HESS2 et HESS3. Le clone HESS4 présentait une composition chromosomique significativement différente: de nombreux autosomes de ce clone provenaient du génome des cellules souches embryonnaires (chromosomes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 et 17), mais les chromosomes 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 et 19 étaient représentés par des homologues des deux parents. Le rapport quantitatif des microsatellites marquant ces chromosomes homologues était d'environ 1:1. Cela a permis aux auteurs de supposer qu'un homologue provenait du génome des cellules souches embryonnaires et l'autre de cellules différenciées. Dans certains sous-clones du clone HESS4, seuls les marqueurs des chromosomes 18 et 19 du partenaire somatique étaient présents. Les résultats obtenus indiquent que dans les cellules du clone HESS4, en plus de la ségrégation des chromosomes du partenaire somatique, l'élimination d'un ou des deux homologues des chromosomes susmentionnés du génome pluripotent s'est produite, c'est-à-dire qu'il y a eu une ségrégation bilatérale des chromosomes des deux parents - un phénomène très inhabituel, car la ségrégation des chromosomes d'un seul des parents est caractéristique des cytohybrides.

Français De plus, après le 20e passage, tous les clones de cellules hybrides ne contenaient que des marqueurs du chromosome X du partenaire somatique, c'est-à-dire que le chromosome X de l'ESC était remplacé par le chromosome X du partenaire somatique dans les clones. Ce fait important est confirmé par les données d'hybridation in situ utilisant une sonde marquée au FITC spécifique du chromosome X de souris: un signal positif n'a été détecté que sur un chromosome. Il convient de noter qu'aux premiers stades de culture (avant le 15e passage), selon les données cytogénétiques, de nombreuses cellules contenaient deux chromosomes X. Par conséquent, l'utilisation de milieux sélectifs permet de manipuler la composition chromosomique des cellules hybrides et de sélectionner sélectivement les clones portant des chromosomes uniques du partenaire somatique par rapport au génome de l'ESC.

Étant donné qu'une caractéristique unique du génome cytohybride est la localisation des génomes parentaux dans un noyau, la question se pose naturellement de la préservation des propriétés pluripotentes du génome embryonnaire chez les hybrides cellules souches embryonnaires (ESC)-cellules somatiques en contact étroit avec le génome d'une cellule différenciée. Morphologiquement, les cytohybrides des cellules souches embryonnaires (ESC) et des cellules somatiques étaient similaires à la lignée parentale des cellules souches embryonnaires (ESC). L'évaluation de la pluripotence a montré que tous les clones possédant un ensemble quasi diploïde de chromosomes étaient capables de former des corps embryoïdes dans des cultures en suspension, dans lesquelles des dérivés de trois feuillets germinaux étaient présents.

La plupart des cellules hybrides contenaient l'antigène ECMA-7, un marqueur caractéristique des premiers embryons de souris, et présentaient également une activité phosphatase alcaline élevée. Les données les plus convaincantes sur les propriétés hautement pluripotentes des cellules hybrides ont été obtenues lors d'expériences portant sur l'obtention d'une série de chimères par injection impliquant des cellules hybrides du clone HESS2. L'analyse des marqueurs biochimiques a montré que les descendants des cellules hybrides donneuses étaient présents dans la plupart des tissus des chimères. Par conséquent, les cellules hybrides obtenues par fusion de cellules souches embryonnaires et de cellules somatiques différenciées conservent une forte pluripotence, notamment la capacité de former des chimères lorsqu'elles sont injectées dans la cavité du blastocyste.

Les clones HESS2 et HESS4 différaient significativement dans la composition des chromosomes parentaux, mais présentaient des propriétés pluripotentes similaires. On pourrait supposer que la pluripotence dans le génome hybride se manifeste comme un trait dominant, mais il est possible que tous les chromosomes du génome embryonnaire ne soient pas impliqués dans le processus de maintien de la pluripotence. Si cette hypothèse est correcte, on peut s'attendre à ce que l'élimination de certains chromosomes du partenaire pluripotent du génome des cellules hybrides ne s'accompagne pas d'une modification de leur statut pluripotent. Dans ce cas, l'analyse de la ségrégation des chromosomes parentaux dans les cellules hybrides embryonnaires permettrait d'identifier précisément les chromosomes responsables du contrôle de la pluripotence des cellules embryonnaires.

O. Serov et al. (2001) n'ont trouvé aucune descendance parmi les 50 descendants obtenus en croisant des chimères avec des souris normales possédant le génotype 129/01a et le chromosome X des souris DD. Les auteurs pensent que cela est dû à une diminution de la pluripotence des cellules hybrides sous l'influence du génome somatique. Une autre explication pourrait être l'effet négatif de la trisomie sur certains autosomes et un déséquilibre des chromosomes sexuels (des chromosomes XXY ont été observés dans les cellules jusqu'au 15e passage) chez les cellules hybrides pendant la méiose. Il est connu que les cellules XXY sont incapables de subir la méiose et de former des gamètes. La trisomie peut également entraîner une diminution de l'activité proliférative des cellules hybrides, ce qui pourrait faire que l'avantage sélectif dans le développement des chimères appartienne aux cellules de l'embryon receveur. Il s'ensuit que pour une évaluation adéquate du potentiel pluripotent des cellules hybrides, il est nécessaire d'obtenir des clones hybrides possédant un ensemble diploïde normal de chromosomes.

Français Dans les expériences d'O. Serov et ses co-auteurs (2001), la possibilité de reprogrammer le chromosome X d'une cellule somatique dans le génome de cellules hybrides a été démontrée pour la première fois. Cette conclusion des auteurs découle de l'analyse de l'expression du gène hprt (un marqueur du chromosome X) chez les chimères: la présence du variant allélique de hprt de souris DD/c a été détectée dans tous les tissus chimériques analysés. Il convient de souligner qu'après l'introduction de cellules hybrides dans la cavité du blastocyste, les cytohybrides tombent dans des conditions non sélectives et que la préservation du chromosome X dans le génome des cellules hybrides signifie qu'il est devenu son composant obligatoire et que le génome ne le distingue pas du chromosome Y du partenaire pluripotent.

En résumant les résultats de l'analyse de l'interaction des génomes somatique et pluripotent dans les cellules embryonnaires hybrides, les auteurs concluent que chez certains cytohybrides, la pluripotence se manifeste comme un trait dominant. Le génome hybride est capable de reprogrammer les chromosomes individuels des cellules différenciées, ce qui n'exclut toutefois pas la possibilité d'un effet inverse du génome somatique sur la pluripotence du génome embryonnaire. Lors de la culture de cellules hybrides, l'induction de la différenciation se produit significativement plus souvent que dans la lignée parentale d'origine des cellules souches embryonnaires embryonnaires HM-1. Un effet similaire est observé lors de la formation de colonies primaires: de nombreuses colonies primaires de cellules hybrides embryonnaires se différencient aux premiers stades de leur formation, entraînant d'importantes pertes de clones lors de leur sélection et de leur reproduction.

Ainsi, les cytohybrides créés par la fusion de cellules souches embryonnaires embryonnaires (ESC) avec des cellules somatiques, malgré un contact étroit avec le génome des cellules différenciées, conservent la pluripotence, propriété unique du génome embryonnaire. De plus, dans ces cellules hybrides, la reprogrammation de chromosomes individuels provenant de cellules différenciées est possible. On ignore encore dans quelle mesure les propriétés pluripotentes du génome embryonnaire sont conservées dans les cellules hybrides, en particulier leur capacité à participer à la formation de la lignée germinale chez les chimères. Cela nécessite l'obtention de cellules hybrides embryonnaires présentant un caryotype normal. Quoi qu'il en soit, les cellules hybrides embryonnaires pluripotentes peuvent devenir un véritable modèle génétique pour l'identification des chromosomes impliqués dans le maintien ou le contrôle de la pluripotence, puisque la ségrégation bilatérale des chromosomes parentaux offre potentiellement une telle opportunité.

L'étude du phénomène que O. Serov et al. (2001) définissent comme « mémoire chromosomique » n'est pas moins intéressante. Dans le génome hybride, les chromosomes homologues présentent deux configurations alternatives: les homologues du partenaire somatique ont déjà subi une différenciation, tandis que chez les homologues du partenaire pluripotent, ce processus ne fait que commencer. Par conséquent, la préservation de propriétés pluripotentes élevées par les cellules hybrides indique que la configuration « pluripotente » des homologues des cellules souches embryonnaires (ESC) est suffisamment stable dans le génome hybride, malgré l'influence des facteurs de transaction émanant du partenaire somatique. Les signes de reprogrammation des chromosomes homologues du génome différencié décrits ci-dessus au cours du développement des chimères n'excluent pas la possibilité que, lors des premiers stades de formation et de culture in vitro des cytohybrides, ceux-ci conservent leur statut acquis lors de la différenciation in vivo. Selon des données récemment obtenues, lorsque des cellules hybrides embryonnaires sont transférées dans un environnement non sélectif, elles présentent une élimination intensive des chromosomes du seul partenaire somatique; autrement dit, le génome des cellules hybrides discrimine facilement ses homologues après 10 à 15 passages de culture in vitro. Ainsi, les cellules hybrides embryonnaires constituent un modèle expérimental prometteur pour étudier non seulement une propriété fondamentale du génome embryonnaire, la pluripotence, mais aussi son alternative: la différenciation embryonnaire.

Efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules souches embryonnaires

Avant d'analyser l'efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules souches embryonnaires humaines (CES) et de leurs dérivés, nous résumons les éléments ci-dessus. Les capacités des CES à mener pleinement l'embryogenèse in vitro sont insuffisantes, car les défauts de développement sont dus à l'absence de cellules souches mésenchymateuses, qui se développent dans l'organisme de manière autonome et indépendante des CES. Le potentiel génétique des CES étant inférieur à celui du zygote, elles ne sont pas directement utilisées pour le clonage d'embryons. Le potentiel biologique unique des CES, seules cellules où les programmes de développement sont pleinement déployés et mis en œuvre de manière cohérente, est exploité dans les études de la fonction des gènes. Grâce aux CES, les premières combinaisons de signaux activant l'expression des gènes précoces et tardifs codant pour le développement des trois feuillets embryonnaires sont décodées. La préservation de la pluripotence du génome des CES in vitro en fait un outil unique de régénération réparatrice, capable de compenser automatiquement les pertes cellulaires en cas de lésions des organes et des tissus. Dans un scénario hypothétique idéal, on peut supposer que «... lors de la transplantation d'ESC de donneur, des programmes compacts sont transférés dans le corps du receveur, qui, dans des conditions favorables, se concrétisent par la construction de nouveaux tissus7, capables de «... s'intégrer efficacement dans le corps du receveur aux niveaux morphologique et fonctionnel. »

Naturellement, suite au développement de méthodes de monodifférenciation des cellules souches embryonnaires (CSE), l'étude in vivo de l'activité fonctionnelle de cellules obtenues in vitro à partir d'un clone spécialisé a débuté. Un clone de CSE proliférant génère des populations de cellules progénitrices migrantes véritablement capables de s'intégrer activement dans les zones endommagées des tissus receveurs, ce qui est utilisé en médecine régénérative et plastique. Il a été établi que la transplantation de neurones DOPA dans la substance noire réduit les manifestations cliniques de l'hémiparkinsonisme expérimental. Les transplantations régionales de cellules souches neurales du donneur réduisent l'intensité des troubles moteurs causés par un traumatisme ou une contusion de la moelle épinière et du cerveau. Les premiers résultats positifs de la transplantation de cellules souches dans les maladies démyélinisantes ont également été obtenus. Il semblerait que le potentiel régénératif et plastique des CSE ouvre des possibilités illimitées pour l'utilisation de la transplantation cellulaire en médecine pratique. Cependant, lorsqu'elles sont transplantées dans des zones ectopiques, les CSE se transforment inévitablement en tumeurs. Des tératomes se forment lorsque des CSE sont injectées par voie sous-cutanée à des souris immunodéficientes. La transplantation de suspensions d'ESC sous la capsule testiculaire chez des souris syngéniques entraîne également la formation de tératomes, composés de différents tissus, dont les cellules sont dérivées des trois feuillets germinaux. Dans ces tératomes, les processus d'organogenèse réduite sont extrêmement rares.

Plusieurs études fournissent des informations sur les résultats positifs de la transplantation de dérivés précoces des cellules souches embryonnaires (ESC) chez des animaux présentant une pathologie expérimentale. La neurotransplantation cellulaire utilisant des dérivés des ESC est en cours de développement expérimental et de premiers essais cliniques pour corriger les troubles fonctionnels des lésions cérébrales et médullaires, et pour traiter la syringomyélie et la sclérose en plaques (Repin, 2001). Avec l'avènement de la technique de neurogenèse in vitro à partir des ESC, au lieu d'utiliser du tissu cérébral embryonnaire, des méthodes sont développées pour transplanter des dérivés de neurosphères obtenus à partir de cultures de tissus nerveux embryonnaires. Ces suspensions de transplantation sont nettement plus homogènes et contiennent des précurseurs de neurones et de cellules gliales.

Grâce à l'ajout régulier d'acide rétinoïque à la dose de 10 μg/ml au milieu de culture pendant 6 semaines, plus de 80 % des neurones postmitotiques sont formés dans la lignée d'embryons (térato)-carcinomes humains NTERA-2. L'homogénéité complète de la population neuronale est obtenue par le tri en flux des neurones matures marqués par des marqueurs immunophénotypiques, ce qui permet d'éliminer les restes de tératocarcinome et les cellules immatures. Après transplantation dans différentes régions du cerveau d'animaux de laboratoire, ces neurones non seulement survivent, mais s'intègrent également aux réseaux neuronaux régionaux. Chez les animaux présentant des modèles expérimentaux de troubles locaux du système nerveux central, la neurotransplantation réduit les manifestations cliniques de pathologies humaines telles que les conséquences de traumatismes crâniens, d'accidents vasculaires cérébraux, de maladies démyélinisantes, de troubles héréditaires du développement du cervelet et de maladies liées aux dépôts de lipides et de polysaccharides.

Afin d'optimiser les processus de régénération dans les maladies dégénératives du système nerveux central, des technologies sont en cours de développement pour obtenir des oligodendrocytes myélinisants à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). La première étape comprend traditionnellement la prolifération des CSE avec reproduction du nombre de cellules nécessaires à la transplantation. La deuxième étape consiste en une différenciation ciblée des cellules en une population de précurseurs d'oligodendrocytes myélinisants, contrôlée par des antigènes marqueurs sélectifs.

L'utilisation de dérivés de cellules souches embryonnaires (ESC) ouvre des perspectives pour le développement de méthodes de correction des déficits immunitaires causés par des anomalies génétiques de la maturation du thymus. Dans des études sur des souris knock-out (rag 1) présentant une anomalie génétique induite (perturbation du mécanisme de recombinaison des loci V(D)J des gènes TCR, entraînant la perte de la fonction des lymphocytes T), la transplantation de dérivés précoces de cellules souches embryonnaires (ESC) dans le thymus des animaux restaure la maturation de populations normales de clones immuns responsables de l'immunité cellulaire. Des essais cliniques de transplantation de cellules souches embryonnaires préformées in vitro pour le traitement des anémies héréditaires mortelles chez l'enfant sont en cours.

Les objections à l'introduction rapide de la transplantation de cellules souches en clinique reposent sur le nombre limité de lignées stables de cellules souches embryonnaires humaines et la nécessité de leur standardisation. Afin d'accroître la pureté des lignées de cellules souches embryonnaires humaines standardisées, ainsi que des cellules souches adultes humaines, il est proposé d'utiliser une méthode de sélection de lignées basée sur l'analyse génétique moléculaire des courtes répétitions d'ADN en tandem. Il est également nécessaire de tester les lignées de cellules souches embryonnaires afin de détecter la présence de petits réarrangements chromosomiques et de mutations génétiques, dont le risque de survenue en culture cellulaire est élevé. Une thèse est avancée concernant l'obligation de tester les propriétés de tous les types de cellules souches embryonnaires et de cellules souches pluripotentes régionales, car leur reproduction in vitro peut conduire à l'émergence de nouvelles caractéristiques non inhérentes aux cellules souches embryonnaires ou aux tissus définitifs. En particulier, il est supposé que la culture à long terme dans des milieux contenant des cytokines rapproche les lignées de cellules souches embryonnaires des cellules tumorales, car elles subissent des modifications similaires des voies de régulation du cycle cellulaire, acquérant ainsi la capacité d'effectuer un nombre illimité de divisions cellulaires. Certains auteurs, se basant sur le risque de développement tumoral, considèrent la transplantation de dérivés de cellules souches embryonnaires précoces chez l'homme comme imprudente. Selon eux, il est beaucoup plus sûr d'utiliser des descendants de cellules souches embryonnaires, c'est-à-dire des lignées de progéniteurs cellulaires différenciés. Cependant, à l'heure actuelle, aucune technique fiable permettant d'obtenir des lignées cellulaires humaines stables se différenciant dans la direction souhaitée n'a encore été développée.

Ainsi, de plus en plus de données sur l'effet thérapeutique positif de la transplantation de dérivés de cellules souches embryonnaires humaines apparaissent dans la littérature. Cependant, nombre de ces études sont examinées et critiquées. Certains chercheurs estiment que les résultats des premiers essais cliniques sont préliminaires et indiquent seulement que les cellules souches sont capables d'exercer un effet favorable sur l'évolution clinique d'une maladie donnée. Il est donc nécessaire d'obtenir des données sur les résultats à long terme de la transplantation cellulaire. Les stades de développement de la neurotransplantologie clinique sont cités comme argument. En effet, si, dans un premier temps, les publications sur la grande efficacité de la transplantation de fragments cérébraux embryonnaires dans la maladie de Parkinson prédominaient, des rapports ont ensuite commencé à apparaître niant l'efficacité thérapeutique de la transplantation de tissu nerveux embryonnaire ou fœtal dans le cerveau des patients.

Les premiers essais cliniques ont été menés pour évaluer la sécurité de la transplantation de neuroblastes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (CES) de tératocarcinome NTERA-2. Les cellules immatures ont été soumises à une prolifération en culture jusqu'à l'accumulation d'une masse cellulaire de 100 millions. Certaines des cellules ainsi obtenues ont été utilisées pour caractériser le phénotype et déterminer les impuretés cellulaires, ainsi que pour tester une éventuelle contamination par des virus et des bactéries. Le LIF et la couche nourricière de cellules stromales fœtales ont été retirés du milieu de culture, et les conditions ont été créées pour une différenciation ciblée des CES en neuroblastes grâce à une combinaison de cytokines et de facteurs de croissance. Les neuroblastes ont ensuite été purifiés à partir de cellules immatures de tératocarcinome sur un trieur de cellules à flux. Après purification secondaire et caractérisation phénotypique des cellules transplantées, une suspension de neuroblastes (10 à 12 millions) a été injectée dans le noyau basal du cerveau des patients (au septième mois après l'AVC hémorragique) à l'aide d'une microcanule et d'une seringue spéciales, sous contrôle stéréotaxique et tomodensitométrique. Un suivi post-transplantation d'un an des conséquences de la transplantation de neurones dans la zone d'AVC n'a révélé aucun effet secondaire ni indésirable. La moitié des patients ont présenté une amélioration de la fonction motrice entre 6 et 12 mois après la transplantation. Les changements cliniques positifs se sont accompagnés d'une augmentation de l'apport sanguin dans la zone d'AVC après la transplantation cellulaire: l'augmentation moyenne de l'absorption du 2-désoxyglucose marqué par fluorescence, selon la tomographie par émission de positons, a atteint 18 %, et chez certains patients, 35 %.

Cependant, les Instituts nationaux de la santé des États-Unis ont mené une étude indépendante sur l'efficacité clinique de la neurotransplantation chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Les patients du premier groupe ont reçu une greffe de tissus nerveux embryonnaires producteurs de dopamine, tandis que le second groupe a subi une opération simulée. Les résultats indiquent une efficacité clinique nulle de cette neurotransplantation, malgré la survie des neurones embryonnaires producteurs de dopamine dans le cerveau des receveurs. De plus, deux ans après la greffe de tissus nerveux embryonnaires, 15 % des patients ont développé une dyskinésie persistante, absente chez les patients du groupe placebo (Cellules souches: progrès scientifiques et orientations futures de la recherche. Institut national de la santé des États-Unis). L'évolution de la maladie chez ces patients est en cours d'observation.

Certains auteurs associent les données contradictoires de la littérature sur l'évaluation de l'efficacité clinique de la neurotransplantation à différentes approches de sélection des groupes de patients, à un choix inadéquat de méthodes pour évaluer objectivement leur état et, surtout, à différentes périodes de développement du tissu nerveux embryonnaire et à différentes zones du cerveau à partir desquelles ce tissu a été obtenu, à différentes tailles de transplantation et à différentes caractéristiques méthodologiques de l'intervention chirurgicale.

Il convient de noter que les tentatives de transplantation directe de cellules souches embryonnaires pluripotentes dans le striatum cérébral de rats atteints d'hémiparkinsonisme expérimental se sont accompagnées d'une prolifération des cellules souches embryonnaires et de leur différenciation en neurones dopaminergiques. Il convient de supposer que les neurones nouvellement formés ont été efficacement intégrés aux réseaux neuronaux, car après la transplantation des cellules souches embryonnaires, une correction des anomalies comportementales et de l'asymétrie motrice a été observée lors du test à l'apomorphine. Parallèlement, certains animaux sont morts suite à la transformation des cellules souches embryonnaires transplantées en tumeurs cérébrales.

Les experts des Académies nationales et médicales des États-Unis, les spécialistes de l'Institut national de la santé des États-Unis estiment que le potentiel clinique des cellules souches embryonnaires mérite la plus grande attention, mais insistent sur la nécessité d'une étude détaillée de leurs propriétés, de la probabilité de complications et des conséquences à long terme dans les expériences sur des modèles biologiques adéquats de maladies humaines (Les cellules souches et la future médecine régénérative National Academy Press.; Les cellules souches et les futures directions de recherche. Nat. Inst, of Health USA).

De ce point de vue, il est important qu'une analyse histologique comparative de tératomes expérimentaux obtenus par transplantation d'une suspension d'ESC dans le testicule avec des tératomes formés suite à la transplantation d'un embryon précoce contenant également des ESC ait montré que les ESC, indépendamment de leur origine ou de leur interaction avec certaines cellules environnantes, déploient leur potentiel tumorigène de la même manière. Il a été démontré que ces tératomes ont une origine clonale, puisque des tumeurs constituées de dérivés des trois feuillets germinaux peuvent provenir d'une seule ESC (Rega, 2001). Il est à noter que lorsque des ESC clonées avec un caryotype normal ont été transplantées chez des souris immunodéficientes, des tératomes constitués de différents types de cellules somatiques différenciées se sont également formés. Ces données expérimentales constituent une preuve irréfutable de l'origine clonale des tératomes. Du point de vue de la biologie du développement, elles indiquent que ce ne sont pas plusieurs cellules progénitrices engagées, mais une seule cellule souche pluripotente qui constitue un tératome, mais une seule cellule souche pluripotente. Cependant, sur la voie de la transplantation cellulaire pratique, les résultats de ces études constituent, sinon un obstacle, du moins un signal d'alarme quant à un danger potentiel, car l'inoculation de cellules souches embryonnaires (ESC) ou de cellules germinales primordiales dans divers tissus de souris adultes immunodéficientes entraîne inévitablement le développement de tumeurs à partir des cellules souches transplantées. La dégénérescence néoplasique des ESC transplantées ectopiquement s'accompagne de l'émergence de populations satellites de cellules différenciées, due à la différenciation partielle des ESC et des clones progéniteurs en lignées spécialisées. Il est intéressant de noter que lorsque les ESC sont transplantées dans les muscles squelettiques, les neurones se forment le plus souvent à proximité des cellules de tératocarcinome. Cependant, l'introduction d'ESC dans un ovule en division ou un blastocyste s'accompagne d'une intégration complète des cellules dans l'embryon sans formation d'éléments néoplasiques. Dans ce cas, les ESC sont intégrées dans la quasi-totalité des organes et tissus de l'embryon, y compris le primordium génital. De tels animaux allophènes ont été obtenus pour la première fois par l'introduction de cellules de tératocarcinome 129 dans des embryons précoces aux stades 8 à 100 cellules. Chez les souris allophènes, des populations de cellules hétérogènes dérivées de cellules souches embryonnaires donneuses sont intégrées aux tissus de la moelle osseuse, de l'intestin, de la peau, du foie et des organes génitaux, ce qui permet de créer des chimères cellulaires interspécifiques. Plus la période de développement de l'embryon précoce est courte, plus le pourcentage de chimérisation cellulaire est élevé, le degré le plus élevé étant observé dans le système hématopoïétique, la peau, le système nerveux, le foie et l'intestin grêle de l'embryon allophène. Chez l'adulte, les tissus protégés du système immunitaire du receveur par des barrières histohématiques sont sensibles à la chimérisation:La transplantation de cellules germinales primaires dans le parenchyme testiculaire s'accompagne de l'incorporation de cellules souches du donneur dans la couche de tissu germinatif du receveur. Cependant, lors de la transplantation de cellules souches embryonnaires humaines (CES) dans un blastocyste, la formation de rudiments chimériques des organes sexuels avec la génération de cellules germinales primaires du donneur ne se produit pas. La pluripotence des CES, lorsque des conditions particulières sont réunies, peut également être utilisée pour le clonage: la transplantation de CES de souris dans un embryon de souris de 8 à 16 cellules, dans lequel les mitoses cellulaires sont bloquées par la cytocalsine, favorise la mise en œuvre d'une embryogenèse normale avec le développement d'un embryon à partir de CES du donneur.

Par conséquent, une alternative à la transplantation allogénique de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) est le clonage thérapeutique basé sur la transplantation de noyaux de cellules somatiques dans un ovule énucléé afin de créer un blastocyste, à partir de la masse cellulaire interne duquel sont ensuite isolées des lignées d'ESC génétiquement identiques au donneur du noyau somatique. Techniquement, cette idée est tout à fait réalisable, car la possibilité de créer des lignées d'ESC à partir de blastocystes obtenus après transplantation de noyaux somatiques dans des ovules énucléés a été démontrée à plusieurs reprises lors d'expériences sur des animaux de laboratoire (Nagy, 1990; Munsie, 2000). En particulier, chez des souris homozygotes pour la mutation du gène rag2, des fibroblastes obtenus par culture de cellules tissulaires sous-épidermiques ont été utilisés comme donneurs de noyaux, qui ont été transplantés dans des ovocytes énucléés. Après activation de l'ovocyte, le « zygote » a été cultivé jusqu'à la formation d'un blastocyste, à partir duquel des cellules souches embryonnaires humaines (ESC) ont été isolées de la masse cellulaire interne et transférées vers une lignée de cellules nullizygotes pour le gène mutant (rag2~/~). La mutation d'un gène allélique a été corrigée dans ces cellules souches embryonnaires par recombinaison homologue. Dans la première série d'expériences, des corps embryoïdes ont été obtenus à partir de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) portant un gène recombinant restauré. Leurs cellules ont été transfectées par un rétrovirus recombinant (HoxB4i/GFP) et, après reproduction, injectées dans une veine de souris rag2~/~. Dans la deuxième série, des blastomères tétraploïdes ont été agrégés avec des ESC génétiquement modifiées et transplantés chez des femelles receveuses. Les souris immunocompétentes ainsi obtenues ont servi de donneuses de moelle osseuse pour la transplantation chez des souris mutantes rag2~/~. Dans les deux séries, le résultat était positif: après 3 à 4 semaines, des cellules myéloïdes et lymphoïdes normales matures capables de produire des immunoglobulines ont été trouvées chez toutes les souris. Ainsi, la transplantation de noyaux de cellules somatiques dans des ovocytes peut être utilisée non seulement pour obtenir des lignées de cellules souches embryonnaires (CSE), mais aussi pour la cytogénothérapie (correction d'anomalies héréditaires), en utilisant les CSE comme vecteur de transport de l'information génétique corrective. Cependant, outre les problèmes bioéthiques, cette voie de transplantation cellulaire présente des limites. La sécurité de la transplantation de cellules clonées thérapeutiquement, dont le génotype est identique à celui d'un patient spécifique, est incertaine, car ces cellules peuvent introduire des mutations prédisposant à d'autres maladies. Les ovules humains normaux restent difficiles d'accès, tandis que même avec la transplantation de noyaux somatiques dans des ovules animaux énucléés, seuls 15 à 25 % des « zygotes » construits atteignent le stade de blastocyste. Le nombre de blastocystes nécessaires pour obtenir une lignée de CSE clonées pluripotentes n'est pas encore déterminé. Il convient également de noter les coûts financiers élevés associés à la complexité de la méthodologie de clonage thérapeutique.

Français En conclusion, il convient de noter que dans les ESC, la pluripotence du génome avec l'ADN hypométhylé est combinée à une activité télomérase élevée et à une courte phase C^ du cycle cellulaire, ce qui assure leur reproduction intensive et potentiellement infinie, au cours de laquelle les ESC conservent un ensemble diploïde de chromosomes et un ensemble « juvénile » de caractéristiques phénotypiques. La croissance clonale des ESC en culture n'interfère pas avec leur différenciation en une lignée cellulaire spécialisée de l'organisme lorsque la prolifération est arrêtée et que des signaux régulateurs appropriés sont ajoutés. La différenciation par restriction des ESC en lignées cellulaires somatiques in vitro est réalisée sans la participation du mésenchyme, en contournant les Nochteys, en dehors de l'organogenèse et sans formation d'embryon. L'introduction ectopique d'ESC in vivo conduit inévitablement à la formation de tératocarcinomes. La transplantation d'ESC dans un blastocyste ou un embryon précoce s'accompagne de leur intégration aux tissus embryonnaires et d'une chimérisation stable de ses organes.

Les technologies régénératives-plastiques basées sur la transplantation cellulaire sont au carrefour des intérêts des spécialistes de la biologie cellulaire, de la biologie du développement, de la génétique expérimentale, de l'immunologie, de la neurologie, de la cardiologie, de l'hématologie et de nombreuses autres branches de la médecine expérimentale et pratique. Les principaux résultats des études expérimentales démontrent la possibilité de reprogrammer les cellules souches par une modification ciblée de leurs propriétés, ouvrant ainsi des perspectives de contrôle des processus de cytodifférenciation par l'utilisation de facteurs de croissance pour la régénération myocardique, la restauration des lésions du SNC et la normalisation de la fonction des îlots pancréatiques. Cependant, pour une introduction généralisée de la transplantation de dérivés de cellules souches embryonnaires humaines en médecine pratique, il est nécessaire d'étudier plus en détail les propriétés des cellules souches humaines et de poursuivre les expériences avec les cellules souches embryonnaires humaines sur des modèles expérimentaux de maladies.

Les questions bioéthiques et le problème du rejet d'une greffe de cellules allogéniques pourraient être résolus par la découverte de la plasticité du génome des cellules souches régionales d'un organisme adulte. Cependant, les informations initiales selon lesquelles la transplantation de cellules autologues hématopoïétiques isolées et soigneusement caractérisées dans le foie, à partir desquelles de nouveaux hépatocytes sont dérivés, s'intègrent aux lobules hépatiques, sont actuellement révisées et critiquées. Néanmoins, des données ont été publiées indiquant que la transplantation de cellules souches neurales dans le thymus entraîne la formation de nouveaux germes de lymphocytes T et B du donneur, et que la transplantation de cellules souches neurales cérébrales dans la moelle osseuse conduit à la formation de germes hématopoïétiques avec une myélo- et érythropoïèse à long terme du donneur. Par conséquent, des cellules souches pluripotentes capables de reprogrammer le génome au potentiel de cellules souches hématopoïétiques peuvent persister dans les organes d'un organisme adulte.

La source d'obtention des cellules souches embryonnaires humaines (CSE) à des fins médicales reste l'embryon humain, ce qui présuppose l'inévitabilité d'un nouveau croisement de questions morales, éthiques, juridiques et religieuses à l'origine de la vie humaine. La découverte des CSE a donné un puissant élan à la reprise d'âpres discussions sur la frontière entre les cellules vivantes et la matière, l'être et la personnalité. Parallèlement, il n'existe pas de normes, règles et lois universelles concernant l'utilisation des CSE en médecine, malgré des tentatives répétées pour en créer et les adopter. Chaque État, dans le cadre de sa législation, résout ce problème de manière indépendante. De leur côté, les médecins du monde entier continuent de s'efforcer de sortir la médecine régénérative-plastique du champ de ces discussions, principalement en utilisant des réserves de cellules souches adultes plutôt que des cellules souches embryonnaires.

Un peu d'histoire de l'isolement des cellules souches embryonnaires

Des cellules de térato(embryon)carcinome ont été isolées à partir de tératomes testiculaires spontanés de souris 129/ter-Sv, de tératomes ovariens spontanés de souris Lt/Sv et de tératomes dérivés de cellules ou tissus embryonnaires transplantés ectopiquement. Parmi les lignées cellulaires stables de térato(embryon)carcinome de souris ainsi obtenues, certaines étaient pluripotentes, d'autres ne se différenciaient qu'en un seul type cellulaire spécifique, et certaines étaient totalement incapables de cytodifférenciation.

À une époque, l'accent était mis sur les études dont les résultats indiquaient la possibilité de ramener les cellules de térato-(embryon)-carcinome à un phénotype normal après leur introduction dans les tissus d'un embryon en développement, ainsi que sur les travaux sur la création in vitro de cellules de térato-(embryon)-carcinome génétiquement modifiées, à l'aide desquelles des souris mutantes ont été obtenues pour la modélisation biologique de la pathologie héréditaire humaine.

La culture en suspension conditionnée a été utilisée pour isoler des lignées cellulaires de térato-(embryon)-carcinome. En culture, les cellules de térato-(embryon)-carcinome, comme les cellules souches embryonnaires (ESC), se développent pour former des corps embryoïdes et nécessitent une dissociation obligatoire pour le transfert de lignée, maintenant ainsi leur pluripotence sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires ou lors de la culture en suspension dans un milieu conditionné. Les cellules des lignées pluripotentes de térato-(embryon)-carcinome sont de grande taille, sphériques, caractérisées par une activité phosphatase alcaline élevée, forment des agrégats et sont capables de différenciation multidirectionnelle. Introduites dans un blastocyste, elles s'agrègent avec la morula, ce qui conduit à la formation d'embryons chimériques, entrant dans la composition de divers organes et tissus, dont des dérivés de cellules de térato-(embryon)-carcinome. Cependant, l'écrasante majorité de ces embryons chimériques meurent in utero, et dans les organes des chimères nouveau-nées survivantes, les cellules étrangères sont rarement détectées et en faible densité. Dans le même temps, l'incidence des tumeurs (fibrosarcome, rhabdomyosarcome, autres types de tumeurs malignes et adénome pancréatique) augmente fortement et la dégénérescence tumorale se produit souvent pendant la période de développement intra-utérin des embryons chimériques.

La plupart des cellules de térato-(embryon)-carcinome présentes dans le microenvironnement des cellules embryonnaires normales acquièrent presque naturellement des caractéristiques néoplasiques malignes. On pense que la malignité irréversible est due à l'activation de proto-oncogènes lors de réarrangements structuraux. L'une des exceptions est constituée par les cellules de la lignée d'embryocarcinome SST3, obtenues à partir de tératomes testiculaires de souris (lignée 129/Sv-ter), qui présentent une forte capacité d'intégration dans les tissus et organes de l'embryon sans formation tumorale ultérieure chez les souris chimériques. Les dérivés de lignées cellulaires de térato-(embryon)-carcinome chez les souris chimériques ne participent pratiquement pas à la formation de gonocytes primaires. Cela serait dû à la fréquence élevée d'aberrations chromosomiques caractéristiques de la plupart des lignées de térato-(embryon)-carcinome, dans lesquelles on observe à la fois des aneuploïdies et des anomalies chromosomiques.

Plusieurs lignées stables de cellules humaines de térato-(embryon)-carcinome caractérisées par leur pluripotence, leur forte activité proliférative et leur capacité à se différencier lors de la croissance en culture ont été obtenues en laboratoire. La lignée NTERA-2 a notamment été utilisée pour étudier les mécanismes de cytodifférenciation neuronale. Après transplantation de cellules de cette lignée dans la région sous-ventriculaire du prosencéphale de rats nouveau-nés, leur migration et leur neurogenèse ont été observées. Des tentatives ont même été faites pour transplanter des neurones obtenus par culture de cellules de la lignée NTERA-2 de térato-(embryon)-carcinome à des patients victimes d'AVC, ce qui, selon les auteurs, a conduit à une amélioration de l'évolution clinique de la maladie. Parallèlement, aucun cas de malignité des cellules transplantées de la lignée NTERA-2 de térato-(embryon)-carcinome chez les patients victimes d'AVC n'a été observé.

Les premières lignées de cellules souches embryonnaires pluripotentes indifférenciées de souris ont été obtenues au début des années 1980 par Evans et Martin, qui les ont isolées de la masse cellulaire interne du blastocyste – l'embryoblaste. Les lignées de cellules souches embryonnaires isolées ont conservé longtemps leur pluripotence et leur capacité à se différencier en différents types cellulaires sous l'influence de facteurs dans un milieu de culture spécifique.

Le terme « cellule souche pluripotente embryonnaire » lui-même appartient à Leroy Stevens, qui, en étudiant l'effet du goudron de tabac sur l'incidence du développement tumoral, a attiré l'attention sur l'apparition spontanée de tératocarcinomes testiculaires chez des souris linéaires (129/v) du groupe témoin. Les cellules de tératocarcinomes testiculaires se caractérisaient par un taux de prolifération élevé et, en présence de liquide abdominal, se différenciaient spontanément avec formation de neurones, de kératinocytes, de chondrocytes, de cardiomyocytes, ainsi que de fragments de cheveux et d'os, mais sans aucun signe de cytoarchitecture ordonnée du tissu correspondant. Une fois mises en culture, les cellules de tératocarcinome se développaient sous forme de clones pluripotents non attachés au substrat et formaient des corps embryoïdes, après quoi elles cessaient de se diviser et subissaient une différenciation spontanée et désordonnée en neurones, cellules gliales, cellules musculaires et cardiomyocytes. Stevens a découvert que le tératocarcinome de souris 129/v contient moins de 1 % de cellules capables de se différencier en diverses lignées somatiques spécialisées, et que la différenciation elle-même dépend des facteurs qui les affectent (la composition du liquide péritonéal, les produits de cellules matures ou les tissus ajoutés à la culture). L'hypothèse de Leroy Stevenson sur la présence de cellules progénitrices embryonnaires de la lignée germinale parmi les cellules de tératocarcinome a été confirmée: une suspension de cellules embryoblastiques provenant d'embryons préimplantatoires dans les tissus de souris adultes a formé des tératocarcinomes, et des lignées cellulaires pures isolées de celles-ci après administration intrapéritonéale à des animaux receveurs se sont différenciées en neurones, cardiomyocytes et autres cellules somatiques dérivées des trois feuillets germinaux. Dans des expériences in vivo, la transplantation de cellules souches embryonnaires (ESC) (obtenues à partir de l'embryoblaste, mais pas du trophoblaste) dans des embryons de souris d'une autre lignée aux stades blastomères 8 à 32 a donné naissance à des animaux chimériques (sans développement de tumeurs), dans les organes desquels des germes de tissu donneur ont été trouvés. Un chimérisme a été observé même dans la lignée germinale.

Les cellules germinales progénitrices primaires isolées du rudiment génital d'un embryon de souris correspondaient, par leur morphologie, leur phénotype immunologique et leurs caractéristiques fonctionnelles, aux cellules souches embryonnaires (CES) obtenues par Stevenson à partir d'un tératocarcinome et d'un embryoblaste. Chez les chimères nées après introduction des CES dans un blastocyste, la morphogenèse allophène des organes était caractérisée par une alternance en mosaïque d'unités structurelles et fonctionnelles du foie, des poumons et des reins, chez les donneurs et les donneuses. Dans certains cas, la formation de cryptes intestinales ou de lobules hépatiques constitués à la fois de cellules receveuses et de cellules donneuses a été observée. Cependant, la morphogenèse était toujours réalisée selon le programme génétique de l'espèce à laquelle appartenait le receveur, et le chimérisme se limitait exclusivement au niveau cellulaire.

Il a ensuite été établi que la prolifération des cellules souches embryonnaires (ESC) sans cytodifférenciation sur une couche nourricière de cellules dérivées du mésenchyme (fibroblastes fœtaux) se produit avec la présence obligatoire de LIF dans des milieux nutritifs sélectifs, qui assurent sélectivement la survie des seules cellules souches et progénitrices, tandis que l'écrasante majorité des éléments cellulaires spécialisés meurent. Grâce à ces méthodes, James Thomson a isolé en 1998 cinq lignées immortalisées de cellules souches embryonnaires à partir de la masse cellulaire interne d'un blastocyste humain. La même année, John Gerhart a développé une méthode permettant d'isoler des lignées de cellules souches embryonnaires immortelles à partir du tubercule génital d'embryons humains âgés de quatre à cinq semaines. Grâce à leurs propriétés uniques, seulement deux ans plus tard, les cellules souches embryonnaires et les cellules souches de tissus définitifs ont commencé à être utilisées en médecine régénérative et en thérapie génique.