Cellules souches mésenchymateuses

Parmi les cellules souches régionales, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) occupent une place particulière, dont les dérivés constituent la matrice stromale de tous les organes et tissus du corps humain. La priorité dans la recherche de MSC appartient à des représentants de la science biologique russe.

Au milieu du siècle dernier, une culture homogène de cellules souches de la moelle osseuse stromales multipotentes a d'abord été isolée dans le laboratoire de A. Friedenshtein. Les cellules souches mésenchymateuses attachées à un substrat pendant longtemps retenu un taux de prolifération élevé, et les cultures à faible densité d'ensemencement, après fixation sur un substrat formé de clones de cellules de fibroblastes ayant aucune activité phagocytaire. L'arrêt de la prolifération de MSC a entraîné leur différenciation in vitro spontanée en cellules osseuses, graisseuses, cartilagineuses, musculaires ou conjonctives. D'autres études ont permis d'établir le potentiel ostéogénique des cellules de type fibroblaste du stroma de la moelle osseuse de diverses espèces de mammifères, ainsi que leur activité de formation de colonies. Dans des expériences in vivo, il a été démontré que les deux transplantations hétéro- et orthotopique de cellules de formation de colonies de fibroblastes est REMPLI formant os, du cartilage et des tissus adipeux fibreux. Puisque les cellules souches de la moelle osseuse ont une capacité élevée d'auto-renouvellement et une variété de différenciation au sein d'une seule lignée cellulaire, elles ont été appelées cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes.

Il est à noter que depuis 45 ans de recherche fondamentale sur les cellules souches mésenchymateuses, des conditions réelles ont été créées pour l'utilisation de leurs dérivés en pratique clinique.

Aujourd'hui, il ne fait aucun doute que tous les tissus du corps humain sont formés à partir des cellules souches de différentes lignées cellulaires à la suite de processus de prolifération, de migration, de différenciation et de maturation. Cependant, plus récemment, on pensait que les cellules souches dans le corps adulte sont spécifiques des tissus, c'est-à-dire capables de produire des lignées cellulaires spécialisées uniquement des tissus dans lesquels elles sont situées. Cette situation conceptuelle a été réfutée par les faits de transformation des cellules souches hématopoïétiques non seulement en éléments cellulaires du sang périphérique, mais aussi en cellules hépatiques ovales. En outre, les cellules souches neurales ont pu donner naissance à la fois à des neurones et à des éléments gliaux, ainsi qu'à des lignées précoces de cellules progénitrices hématopoïétiques. À leur tour, les cellules souches mésenchymateuses, produisant généralement des éléments cellulaires de l'os, du cartilage et du tissu adipeux, sont capables de se transformer en cellules souches neurales. Il est supposé que dans le processus de croissance, la régénération tissulaire physiologique et réparatrice, des cellules progénitrices non engagées sont générées à partir de réserves de souches spécifiques au tissu. Par exemple, la réparation des tissus musculaires peut être réalisée au moyen de cellules souches mésenchymateuses qui migrent de la moelle osseuse vers les muscles squelettiques.

Bien que ces cellules souches croix de interchangeabilité reconnaissent pas tous les chercheurs la possibilité d'une utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses comme source pour la transplantation de cellules et vecteur de cellule de l'information génétique n'a pas contesté que les cellules souches de la moelle osseuse stromales multipotentes, qui peut être relativement facile à isoler et à se propager en culture in vitro. En même temps, dans la littérature scientifique continue à apparaître des rapports sur le potentiel des cellules souches pluripotentes du stroma de la moelle osseuse. Comme les protocoles de recherche présentés des preuves qui, sous l'influence d'inducteurs spécifiques de transdifférenciation des cellules souches mésenchymateuses sont converties en cellules nerveuses, les cardiomyocytes et les hépatocytes. Cependant, certains scientifiques la possibilité de ré-activation et l'expression des gènes au début de l'embryogenèse sérieusement mise en doute. En même temps, tout le monde comprend que si les conditions s'accroîtront les cellules souches mésenchymateuses multipotentes à pluripotence de la médecine régénérative en CES et en plastique résolu automatiquement de nombreux problèmes de nature éthique, moral, religieux et juridique. En outre, étant donné que dans ce cas, la source de la tige la capacité de régénération du patient sont des cellules stromales autologues est résolu et le problème du rejet immunitaire de la greffe de cellules. Comment réalistes sont les perspectives à court avenir nous dira.

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Utilisation de cellules souches mésenchymateuses en médecine

L'utilisation clinique des dérivés de cellules souches mésenchymateuses est principalement associée à la réduction des défauts des tissus causés par des lésions thermiques étendues et profondes de la peau. évaluation expérimentale pré - clinique du bien- fondé des cellules souches mésenchymateuses fibroblaste allogéniques pour le traitement des brûlures profondes a été réalisée. Il est démontré que la moelle osseuse fibroblaste cellules souches mésenchymateuses forment une monocouche dans la culture, ce qui permet de les transplanter afin d' optimiser la régénération des plaies de brûlures profondes. Les auteurs notent que les propriétés similaires ont des fibroblastes embryonnaires, mais l'application clinique de cette dernière est limitée aux problèmes éthiques et juridiques existants. Brûlure thermique profonde avec PWA-raffermie par toutes les couches de la peau sur le modèle des rats Wistar. La surface de la brûlure représentait 18 à 20% de la surface totale de la peau. Dans le premier groupe expérimental se composait de rats ayant une lésion thermique profonde et la transplantation de cellules souches mésenchymateuses dérivées fibroblaste allogéniques. Le deuxième groupe était composé d'animaux avec des brûlures thermiques profondes et trans-plantation de fibroblastes embryonnaires allogéniques. Le troisième groupe de rats témoins a reçu une blessure thermique profonde, qui n'a pas procédé à la thérapie cellulaire. Une suspension de cellules souches mésenchymateuses dérivées de fibroblastes et de fibroblastes embryonnaires a été appliquée à une brûlure surface de la plaie à la pipette dans une quantité de 2 × 10 ⁴ cellules sur le deuxième jour après l' excision de la modélisation de combustion et escarre nécrotique formé. Après la transplantation, les cellules brûlent surface recouverte d' une gaze trempée dans une solution de chlorure de sodium isotonique avec la gentamicine. Clôture cellules de moelle osseuse pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses avec induction subséquente de lignée de fibroblastes dans les cellules souches mésenchymateuses produites chez des rats Wistar adultes à partir des fémurs. Fibroblastes pulmonaires foetales ont été obtenus à partir d' embryons 14-17 jour. Fibroblastes embryonnaires et les cellules de la moelle osseuse pour obtenir une pré-MSC ont été cultivées dans des boîtes de Petri à 37 ° C dans un iikubatore de C02, dans une atmosphère à 5% de CO2 à 95% d' humidité. Fibroblastes embryonnaires sont cultivées pendant 4-6 jours, alors que pour la formation de monocouche MSC requise de 14 à 17 jours. MSCs ensuite maintenu par cryoconservation comme matériau de départ pour les cellules souches mésenchymateuses dérivées fibroblastes qui ont été préparés par la décongélation et la culture de cellules souches mésenchymateuses pendant 4 jours. Nombre de cellules souches mésenchymateuses généré fibroblaste est plus de 3 fois le nombre de fibroblastes embryonnaires survenant au cours de la même période de culture. Pour identifier les cellules en transtslantirovannyh brûler les plaies à l' étape cultivant leur génome marqué en utilisant un vecteur navette viral basé sur un gène recombinant adenovirus V 1AS-2 porteuses de type codage ß-galactosidase de E. Coli. Les cellules vivantes à différents moments après la transplantation détectée par immunohistochimie dans les cryosections avec le substrat X-Gal ajouté, ce qui donne la couleur bleu-vert caractéristique. En raison de dynamique visuelle, planimétrie et de l' état de l' évaluation histologique des plaies de brûlures, il a été constaté que , même au 3e jour après la transplantation des cellules dans des groupes isolés apparaissent des différences significatives au cours de processus de cicatrisation. Particulièrement distincte, cette différence est devenue le 7ème jour après la transplantation cellulaire. Les animaux du premier groupe, qui ont été transplanté des cellules souches mésenchymateuses fibroblaste, blessure acquis couleur intense uniformément rose, tissu de granulation a augmenté de plus au niveau de l'épiderme, et brûler la surface est considérablement réduite en taille toute sa surface. Plusieurs formé plus mince film de collagène à la surface de la plaie, mais elle a continué à couvrir toute la zone de la brûlure. Les animaux du second groupe, qui ont été transplantées des fibroblastes embryonnaires, le tissu de granulation est soulevé au niveau de l'épiderme des bords de la plaie, mais seulement dans certains endroits, en même plazmoreya temps de la blessure était plus intense que dans le groupe 1, et le film de collagène initialement formé pratiquement disparu. Chez les animaux qui ne reçoivent pas un traitement de cellules souches, le 7 blessure de brûlure de jour était pâle, dénoyautées, tissus nécrosés, enduits de fibrine. Plasmorrhea a été noté tout au long de la surface de la brûlure. Histologiquement, les animaux des 1er et 2e groupes ont montré une diminution de l' infiltration cellulaire et le développement du système vasculaire, ces signes de processus de régénération naissante ont été plus sévères chez les rats du groupe 1. Dans le groupe témoin ont montré des signes d'infiltration de la plaie de la cellule, l'aspect histologique de vaisseaux sanguins nouvellement formés absents. 15-30 ème jour d'observation , les animaux de la 1ère surface de combustion du groupe a été significativement plus faible que chez les rats d'autres groupes et la surface de granulateur était plus développée. Chez les animaux de la 2ème surface de combustion du groupe est également diminué par rapport à la taille des plaies de brûlures dans le groupe témoin de rats qui était due à épithélisation marginal. Dans les sites de surface de combustion du groupe témoin sont restés granulations pâles rares, y apparaissant varicosités, les îlots ont été la plaque fibrineuse a continué plazmoreya modérée sur la surface de brûlure, ce qui est la gale détachable difficile restait. En général, les animaux du groupe 3 réduit également la taille de la plaie, mais la plaie est restée bord podrytymi.

Ainsi, au cours d'une étude comparative des taux de cicatrisation en utilisant des cellules souches mésenchymateuses dérivées des fibroblastes et des fibroblastes foetaux, et sans l'utilisation de la thérapie cellulaire marquée accélération de la cicatrisation de la surface de brûlure à la suite d'une transplantation de cellules souches mésenchymateuses dérivées des fibroblastes et des fibroblastes embryonnaires. Toutefois, dans le cas de l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de taux de cicatrisation de fibroblaste était plus élevé que dans la transplantation de fibroblastes embryonnaires. Cela se manifestait dans l'accélération de changement de phases de régénération du procédé - la réduction des périodes de l'infiltration cellulaire, augmente le taux de prolifération des réseaux vasculaires, ainsi que la formation du tissu de granulation.

Les résultats de la planimétrie dynamique indiquent que le taux de guérison spontanée de la plaie de brûlure (sans recours à la thérapie cellulaire) était le plus bas. Le 15 et le jour 30 après la transplantation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de taux de cicatrisation de fibroblaste était plus élevé que dans la transplantation de fibroblastes embryonnaires. Méthode histochimique pour la détection de la bêta-galactosidase a montré que, après transplantation de cellules souches mésenchymateuses fibroblaste et les fibroblastes embryonnaires pendant toute la période d'observation à la surface et profondes blessures régénérant les cellules transplantées restent viables. Les auteurs suggèrent qu'un taux plus élevé de la régénération des blessures de brûlure en utilisant des cellules souches mésenchymateuses de la libération conditionnée de fibroblaste par ces cellules pendant la maturation rostostimuliruyushih facteurs bioactifs.

La transplantation de kératinocytes autologues ou allogéniques et des fibroblastes allogéniques pour le traitement des brûlures et de blessures utilisé dans la clinique. Il convient de noter que le traitement chirurgical des enfants avec des brûlures profondes étendues est une tâche complexe en raison de la grande multiplicité des interventions de traumatologie et de chirurgie, la perte de sang importante, sur les différentes réactions utilisées médias de perfusion. Les principales difficultés dans la mise en œuvre de la peau et la chirurgie plastique avec de vastes brûlures profondes, la surface supérieure à 40% de la surface du corps, en raison de la gravité de son état et le manque de ressources de la peau des donateurs. L'utilisation des greffes de mailles avec un grand taux de perforation ne résout pas le problème, car l'image après la perforation des cellules epiteliziruyutsya est très lent, et souvent faire des greffes de peau sont lysées ou sèches. Ces revêtements brûlent des blessures comme ksenokozha, allogreffes cadavériques, revêtements de films synthétiques ne sont pas toujours suffisamment efficace, si le développement de nouvelles méthodes de fermeture des couches de surface de brûlure de kératinocytes et des fibroblastes cultivés. En particulier, un procédé de fermeture des surfaces de gravure en utilisant allofibroblastov cultivées fournir lors de la transplantation prononcée effet stimulant sur la prolifération de epidermotsitov conservé dans la bordure de la plaie à des brûlures, et dans les greffes kératinocytes mesh bandes. Dans le Budkevich L. Et al (2000) montre les résultats de l'application de cette méthode pour le traitement des brûlures chez les enfants. 31 enfants traumatisés thermiquement âgés de 1 à 14 ans étaient en observation. A trois enfants superficie totale brûler les plaies IIIA-B - degré IV était de 40%, 25 - 50-70%, même à trois - 71-85% de la surface du corps. La nécrosectomie chirurgicale précoce a été associée à la transplantation de fibroblastes allof cultures et à l'autodermoplastie. Dans le traitement de première étape a été menée excision de tissu nécrotique, la seconde - sur la transplantation d'un film de support de allofibroblastov cultivées, la troisième (48 heures après la transplantation de allofibroblastov cultivées) - élimination de la matrice et des volets peau avec taux de perforation autodermoplasty de 1: 4. Trois patients admis à la clinique avec une brûlure grave, tous les fibroblastes cultivés ont été transplantés dans des plaies de granulation. La transplantation d'allo-fibroblastes en culture a été réalisée une fois chez 18 enfants, deux fois chez 11 et trois fois chez deux patients. La surface de la plaie couverte par la culture cellulaire était de 30 à 3500 cm2. L'efficacité de allofibroblastov culture évaluée par le pourcentage total de prise de greffe de lambeaux de peau, le temps de la guérison des brûlures et le nombre de décès de lésions thermiques graves. La prise de greffe de greffe était complète chez 86% des patients. Un non-aspect partiel des lambeaux cutanés a été noté dans 14% des cas. Malgré le traitement en cours, six enfants (19,3%) sont décédés. La zone totale des lésions cutanées chez eux était de 40 à 70% de la surface du corps. La transplantation d'allo-fibroblastes en culture n'était pas liée à l'issue fatale d'une brûlure chez un patient.

L'analyse des résultats du traitement, les auteurs notent que les brûlures antérieures incompatibles avec la vie, pour traiter des dommages thermiques en profondeur de la surface de la peau de 35-40% de la surface du corps (pour les jeunes enfants - jusqu'à 3 ans - sont des brûlures profondes critiques avec une superficie de 30%, pour les enfants plus âgés âge - plus de 40% de la surface du corps). Lorsque la transplantation chirurgicale de autodermaplasty culture necrectomy de allofibroblastov et de la peau après greffe avec de grandes brûlures, le facteur de perforation IIIB - IV degré restent critiques, mais pour le moment il y a des perspectives dans de nombreux cas pour sauver la vie de même des victimes. Necrectomy chirurgicale conjointement avec la transplantation de allofibroblastov culture et autodermaplasty chez les enfants souffrant de brûlures profondes avéré être particulièrement efficace chez les patients présentant des lésions avancées de la peau avec un déficit de sites donneurs. Tactique chirurgicale active et allofibroblastov culture transplanter favorisent une stabilisation rapide de l'état général de ces patients, la réduction du nombre de complications infectieuses de la maladie de brûlure, de créer des conditions favorables à la prise de greffe, de réduire le temps de restaurer la peau perdue et la durée du traitement hospitalier, ce qui réduit l'incidence des décès chez les patients souffrant de graves brûlures. Ainsi, la transplantation de allofibroblastov culture suivi lambeaux cutanés autodermaplasty chez les enfants permet d'extraire avec des brûlures graves, qui étaient auparavant considérés comme vouée à l'échec.

Il est largement reconnu que l'objectif principal du traitement d'une maladie de brûlure est de maximiser la récupération complète et rapide de la peau endommagée pour prévenir les effets toxiques, les complications infectieuses et la déshydratation du corps qui en résultent. Les résultats de l'application de cellules en culture dépendent en grande partie de la préparation à la transplantation de la blessure elle-même. En cas de transplantation de kératinocytes cultivés, 55% (par zone) des cellules transplantées survivent sur la surface de la plaie après nécrectomie chirurgicale, tandis que dans les plaies greffées, le taux de prise de greffe est réduit à 15%. Par conséquent, un traitement efficace des brûlures étendues de la peau profonde nécessite, en premier lieu, une tactique chirurgicale active. En présence de brûlures IIIB-IV degré, la surface de brûlure est immédiatement libérée des tissus nécrotiques afin de réduire les effets de l'intoxication et de réduire le nombre de complications de la brûlure. L'utilisation de telles tactiques est la clé pour réduire le temps entre le moment de la brûlure et la fermeture des plaies et la durée du séjour des patients souffrant de brûlures étendues à l'hôpital, ainsi que la réduction significative du nombre de décès.

Les premiers rapports sur l'utilisation réussie de kératinocytes cultivés pour couvrir la surface brûlée sont apparus au début des années 80 du siècle dernier. Par la suite, cette manipulation a été réalisée à l'aide de couches de kératinocytes cultivés, obtenus le plus souvent à partir d'autostructures, beaucoup moins souvent à partir d'allokératinocytes. Cependant, la technologie de l'autokératinocytoplastie ne permet pas la création d'une banque de cellules, alors que le temps nécessaire pour produire une greffe suffisante à partir des kératinocytes est important et se situe entre 3 et 4 semaines. Pendant cette période, le risque de développer des complications infectieuses et autres de la brûlure augmente fortement, ce qui prolonge de manière significative la durée totale du séjour des patients à l'hôpital. De plus, les autokératinocytes ne survivent pratiquement pas lors de la transplantation dans des plaies de brûlures par granulation, et le coût élevé des milieux de croissance spéciaux et des stimulants de croissance de kératinocytes biologiquement actifs limite significativement leur application clinique. D'autres méthodes biotechnologiques, telles que la collagénoplastie, la transplantation de xénoïdes cryoconservés et l'utilisation de divers revêtements de biopolymères, augmentent l'efficacité du traitement des brûlures superficielles étendues mais pas profondes. Le procédé de revêtement de la surface de la plaie avec des fibroblastes cultivés est fondamentalement différent en ce que le composant principal du pool cellulaire cultivé n'est pas des kératinocytes mais des fibroblastes.

Une condition sine qua non pour le développement de la méthode a servi de preuve que péricytes qui entourent les petits vaisseaux sont les cellules pro mésenchymateuses genitornymi capables de se transformer en fibroblastes, qui produisent de nombreux facteurs de croissance et de fournir la cicatrisation des plaies en raison du fort effet stimulant sur la prolifération et l' adhésion des kératinocytes. En utilisant des fibroblastes en culture pour fermer les surfaces de la plaie immédiatement identifié un certain nombre d'avantages significatifs de cette méthode sur l'utilisation des kératinocytes cultivés. En particulier, la préparation des fibroblastes en culture ne nécessite pas l'utilisation des promoteurs de médias spéciaux de la culture et de la croissance, ce qui réduit le coût de la greffe plus de 10 fois le coût de l' obtention de kératinocytes. Sont facilement soumis Fibroblastes à repiquage, au cours de laquelle ils perdent partiellement leurs antigènes d'histocompatibilité de surface, ce qui permet d'utiliser pour la fabrication de allogreffes de cellules et de créer leurs banques. Écourte transplantations de réception, prêts à l' emploi dans une clinique, à partir de 3 semaines (kératinocytes) 1-2 jours (pour les fibroblastes). Des cultures primaires de fibroblastes peuvent être obtenus par culture de cellules à partir de fragments de peau prélevés à autodermoplasty et la densité ensemencement des cellules sur des sous - cultures de fibroblastes humains de réception est seulement 20 x 10 ³ par 1 cm ².

Pour étudier l'effet des fibroblastes et leurs protéines de régulation de la prolifération et la différenciation des kératinocytes, une analyse comparative des caractéristiques et de la morphologie de la prolifération des kératinocytes sur des substrats de types de collagène I et III et la fibronectine en co-culture avec des fibroblastes humains. Des kératinocytes humains ont été isolés à partir de fragments de la peau de patients atteints de brûlures, prises pendant le fonctionnement autodermoplasty. La densité des kératinocytes était de 50 x 103 cellules par cm2. L'efficacité clinique de la transplantation de fibroblastes cultivés a été évaluée chez 517 patients. Tous les patients ont été divisés en deux groupes: 1er - adultes victimes de brûlures II, Le - IV de degré; 2ème - les enfants avec des brûlures profondes de degré IIIB - IV. L'évaluation de la dynamique de l'organisation structurelle et fonctionnelle de la culture monocouche de fibroblastes en ce qui concerne le rôle dans le processus de régénération des glycosaminoglycanes, fibronectine, collagène, et a permis aux auteurs de déterminer le troisième jour que les conditions les plus favorables à l'utilisation des cultures de fibroblastes pour la production de greffes. Investigation de l'impact sur la prolifération des fibroblastes et la différenciation des kératinocytes ont montré que, dans des fibroblastes in vitro ont un effet stimulant prononcé, principalement sur les processus d'adhérence des kératinocytes, ce qui augmente le nombre de cellules adhérentes et le taux de fixation de plus de 2 fois. Processus d'adhésion de stimulation accompagnée d'une augmentation de l'intensité de la synthèse de l'ADN et le niveau de prolifération des kératinocytes. En outre, il a été constaté que la présence de fibroblastes et la matrice extracellulaire formé par eux est une condition sine qua non pour la formation de connexions intercellulaires tonofibrillyarnogo appareil de kératinocytes et, en fin de compte, pour la différenciation des kératinocytes et la formation de la membrane basale. Dans le traitement des enfants atteints de brûlures profondes établi l'efficacité clinique de la transplantation de la culture allofibroblastov, en particulier chez les patients présentant des lésions étendues des sites donneurs de la peau dans un déficit. étude complexe morfofunktcionalnoe a montré que les fibroblastes caractérisé greffés de synthèse d'ADN actif, ainsi que le collagène, la fibronectine et les glycosaminoglycanes, qui sont générées dans les cellules de la matrice extracellulaire. Les auteurs suggèrent un pourcentage élevé de prise de greffe de fibroblastes transplantées (à 96%), une forte réduction en termes de préparation (dans les 2-3 heures au lieu de 24-48 semaines dans le cas des kératinocytes), une accélération importante de épithélisation de la surface de combustion et une réduction significative des prix (en 10 fois) greffe technologie croissante des fibroblastes par rapport à la transplantation de kératinocytes. L'utilisation de la transplantation de allofibroblastov culture permet de sauver la vie des enfants avec des brûlures critiques - lésions thermiques plus de 50% de la surface du corps, qui a été pensé auparavant incompatible avec la vie. Il est à noter que la transplantation allogénique de fibroblastes embryonnaires aussi convaincante prouvé non seulement une régénération plus rapide des plaies et des patients avec divers convalescences brûlure et zone degré, mais aussi une réduction substantielle de la mortalité.

Les fibroblastes autologues sont également utilisés dans une zone de chirurgie plastique aussi complexe que la correction réparatrice des lésions des cordes vocales. Habituellement, à cette fin, on utilise du collagène bovin dont la durée est limitée par son immunogénicité. Être une protéine étrangère, le collagène bovin, collagénase sensible au destinataire et peut provoquer des réactions immunitaires, afin de réduire le risque que la technologie des préparations de collagène ont été mis au point, réticulé avec du glutaraldéhyde. Leur avantage est une plus grande stabilité et une immunogénicité plus faible, qui a trouvé une application pratique dans l'élimination des défauts et une atrophie des cordes vocales. Les injections de collagène autologue ont été utilisées pour la première fois en 1995. La technique a assuré la préservation de la structure primaire des fibres de collagène autologues, y compris des réticulations catalysées par voie enzymatique intramoléculaire. Le fait est que les fibres de collagène naturelles sont plus résistantes à la destruction des protéases que le collagène reconstitué, dans lequel les télopeptides sont coupés. L'intégrité des télopeptides est importante pour la structure quaternaire des fibres de collagène et la formation de liaisons croisées entre les molécules de collagène adjacentes. Contrairement à des préparations de collagène bovin, le collagène autologue ne provoque pas de réponses immunitaires chez le receveur, mais il est pas suffisamment efficace que l'agent remplit. Une correction persistante peut être obtenue par la production locale de collagène par transplantation autologue de fibroblastes. Cependant, des études sur l'efficacité de la transplantation autologue de fibroblastes en clinique ont révélé certaines difficultés. Au début de la période de transplantation des fibroblastes, l'effet clinique était plus faible que celui observé après l'administration de collagène bovin. Lorsque les fibroblastes autologues en culture ne peuvent pas exclure la possibilité de la transformation des fibroblastes normaux dans anormaux, les myofibroblastes soi-disant, responsables du développement de la fibrose et la cicatrisation, comme en témoigne la réduction du gel de collagène, en raison de l'interaction spécifique des fibroblastes et des fibrilles de collagène. De plus, après un passage en série in vitro, les fibroblastes perdent leur capacité à synthétiser des protéines de la matrice extracellulaire.

Néanmoins, à l'heure actuelle, la technique de culture de fibroblastes humains autologues a été éliminée expérimentalement, éliminant les inconvénients ci-dessus et ne conduisant pas à une transformation oncogénique de fibroblastes normaux. Les fibroblastes autologues obtenus par cette méthode sont utilisés pour combler les défauts des tissus mous du visage. Dans une étude de H. Keller et co-auteurs (2000), 20 patients âgés de 37 à 61 ans avec des rides et des cicatrices atrophiques ont reçu un traitement. Des biopsies cutanées (4 mm) de la région BTE nous transportés au laboratoire dans des tubes stériles contenant 10 ml de milieu de culture (Dulbecco mikoseptikom antibiotiques, du pyruvate et du sérum de fœtus bovin). Le matériau a été placé à l'intérieur de 3-5 boîtes de culture d'un diamètre de 60 mm et incubé dans un thermostat avec une atmosphère contenant 5% de CO2. Après 1 semaine, les cellules ont été retirées des boîtes par trypsinisation et placées dans des flacons de 25 cm2. Les cellules sont administrées à des patients en une quantité de 4 x 107. L'effet clinique significatif et durable a été observée chez les patients avec correction des plis nasogéniens, et chez les patients avec des cicatrices après 7 et 12 mois après la troisième transplantation de fibroblastes autologues. Selon la cytométrie en flux, les fibroblastes cultivés ont produit une grande quantité de collagène de type I. Des études in vitro, la contractilité normale des fibroblastes injectables est montré. Deux mois après l'administration sous-cutanée de fibroblastes en culture à une dose de 4 x 107 cellules, les souris nues n'ont pas été détectées. Les fibroblastes injectables n'ont pas causé la formation de cicatrices et la fibrose diffuse chez les patients. Selon l'auteur, les fibroblastes autologues implantés sont capables de produire constamment du collagène, ce qui donnera un effet de rajeunissement cosmétique. Dans ce cas, étant donné que la durée de vie des cellules différenciées est limitée, les fibroblastes prélevés chez un jeune patient sont plus efficaces que ceux obtenus chez les personnes âgées. À l'avenir, la possibilité de cryoconservation d'une culture de fibroblastes prélevée sur un jeune donneur est supposée transplanter plus tard chez un patient âgé ses propres jeunes cellules. En conclusion, il n'est pas tout à fait correct de conclure que les fibroblastes autologues sous la condition de leur conservation fonctionnelle sont le moyen idéal de correction des défauts dans les tissus mous du visage. Dans le même temps, l'auteur lui-même note que dans le processus de recherche, certaines situations problématiques liées à l'utilisation d'un système autologue fibroblaste-collagène se sont également manifestées. L'effet clinique était souvent plus faible qu'avec l'utilisation de collagène bovin, ce qui a provoqué une déception chez les patients.

En général, les données de la littérature sur les perspectives d'utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses semblent assez optimistes. Des tentatives sont faites pour utiliser des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes autologues de la moelle osseuse pour le traitement des lésions articulaires dégénératives. Les premiers essais cliniques de cellules progénitrices mésenchymateuses en culture dans le traitement des fractures complexes de l'os sont menées. Autologues et les cellules de moelle osseuse stromales mésenchymateuses allogènes utilisées pour produire des tissus cartilagineux pour la transplantation dans la correction des défauts du cartilage articulaire due à un traumatisme ou des lésions auto-immunes. Méthodes d'application clinique Pratiqué des cellules souches mésenchymateuses multipotentes pour corriger les défauts osseux chez les enfants atteints de progrès grave ostéogenèse causée par des mutations du gène du collagène de type I. Après mieloabelyatsii enfants bénéficiaires de la moelle osseuse transplantés de donneur sain HLA compatible comme la moelle osseuse non fractionnée peut contenir une quantité suffisante de cellules souches mésenchymateuses pour reconstituer défaut osseux sévère. Après la transplantation de la moelle osseuse allogénique, ces enfants ont eu des changements histologiques positifs dans les os trabéculaires, une augmentation du taux de croissance et une diminution de l'incidence des fractures osseuses. Dans certains cas, un résultat clinique positif est obtenu en transplantant de la moelle osseuse allogénique étroitement liée et des ostéoblastes. Pour le traitement de la fragilité congénitale des os due au déséquilibre des ostéoblastes et des ostéoclastes dans le tissu osseux, la transplantation MSK est également utilisée. La restauration de la formation osseuse dans ce cas est réalisée en raison de la chimérisation du pool de cellules stromales souches et progénitrices dans le tissu osseux des patients.

Les méthodes de modification génétique des cellules souches mésenchymateuses donneuses sont améliorées pour corriger les défauts génétiques des tissus stromaux. On suppose que les cellules souches mésenchymateuses seront bientôt utilisés en neurologie pour les cellules du cerveau de chimérisation directionnel et créer un pool de cellules saines, capables de produire une enzyme déficiente ou un facteur responsable des manifestations cliniques de la maladie. La transplantation de cellules souches mésenchymateuses peut être utilisé pour restaurer stroma de moelle osseuse chez les patients cancéreux après radiothérapie et la chimiothérapie, et en association avec des cellules de la moelle osseuse - pour la restauration de l'hématopoïèse. Le développement de la thérapie de substitution visant à éliminer les défauts du système musculo-squelettique en utilisant l'ingénierie dans MSCs promouvoir les biomatériaux de la matrice de conception ou biomimics formant squelettes peuplant la descendance des cellules souches mésenchymateuses.

Sources de cellules souches mésenchymateuses

La principale source de cellules souches mésenchymateuses est la moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques qui chez les mammifères est différenciant constamment dans les cellules sanguines et le système immunitaire, alors que les cellules souches mésenchymateuses présentées de petites populations de cellules stromales moelle osseuse fibroblaste et aider à maintenir l'état indifférencié des cellules souches hématopoïétiques. Dans certaines conditions, les cellules souches mésenchymateuses se différencient en cellules de tissu cartilagineux et osseux. Lorsque plaqué sur un milieu de culture dans des cellules de stroma osseux mononucléaires de plantation à faible densité de moelle former des colonies de cellules adhérentes, ce qui, en fait, sont des cellules fibroblastiques précurseurs mésenchymateuses multipotentes. Certains auteurs ont suggéré que la moelle osseuse déposée cellules non engagées souches mésenchymateuses, qui, grâce à la capacité d'auto-renouvellement et à fort potentiel de différenciation, fournissent tous les tissus du corps prédécesseurs cellules mésenchymateuses tout au long de l'organisme des mammifères de la vie.

Dans la moelle osseuse, les cellules stromales forment un réseau qui remplit l'espace entre les sinusoïdes et le tissu osseux. La teneur en CSM dormante dans la moelle osseuse d'un adulte est comparable au nombre de cellules souches hématopoïétiques et ne dépasse pas 0,01-0,001%. Les cellules souches mésenchymateuses isolées de la moelle osseuse et non cultivées sont dépourvues de molécules adhésives. De tels MSC n'expriment pas CD34, ICAM, VCAM, le collagène de type I et III, CD44 et CD29. Par conséquent, in vitro des cellules souches mésenchymateuses ne sont pas fixés sur le substrat de culture, et progénitrices dérivées de cellules souches mésenchymateuses plus avancés, ont formé des composants du cytosquelette et un appareil récepteur de molécules d'adhésion cellulaire. Les cellules stromales avec le phénotype CD34 sont présentes même dans le sang périphérique, bien qu'elles soient beaucoup moins présentes dans la moelle osseuse que les cellules mononucléées CD34-positives. Les cellules CD34 isolées du sang et transférées dans la culture s'attachent au substrat et forment des colonies de cellules de type fibroblaste.

Il est connu que dans la période embryonnaire, la base stromale de tous les organes et tissus des mammifères et des humains provient d'un pool commun de cellules souches mésenchymateuses avant et au stade de l'organogenèse. Par conséquent, on pense que dans un corps mature, la plupart des cellules souches mésenchymateuses doivent être dans le tissu conjonctif et osseux. Il a été établi que la majorité des éléments cellulaires du stroma du tissu conjonctif et osseux lâche sont représentés par des cellules progénitrices engagées, qui, cependant, conservent la capacité de proliférer et de former des clones in vitro. Avec l'introduction de telles cellules dans le flux sanguin total, plus de 20% des cellules progénitrices mésenchymateuses sont implantées parmi les éléments stromaux du tissu hématopoïétique et des organes parenchymateux.

Une source potentielle de cellules souches mésenchymateuses est le tissu adipeux, parmi lesquels des cellules souches trouvées engagées à des degrés divers de progéniteurs adipocytaires. éléments progénitrices moins matures de tissu adipeux - cellules stromales-vasculaires, qui est le même que progéniteurs mésenchymateuses multipotentes de la moelle osseuse peuvent se différencier en adipocytes sous l'action des glucocorticoïdes, le facteur de croissance analogue à l'insuline et l'insuline. Dans la culture de cellules vasculaires stromales se différencier en adipocytes et des chondrocytes et des cellules dérivées de moelle osseuse du tissu adipeux se forment adipocytes et ostéoblastes.

Dans les muscles, des sources de la tige stromale ont également été trouvées. Dans la culture primaire de cellules isolées à partir de muscles squelettiques humains, des cellules de forme stellaire et des myotubes multinucléés sont détectés. En présence de cellules étoilées de sérum de cheval proliférer in vitro sans signes de cytodifferentiation et après l'addition de dexaméthasone dans le milieu de culture de différenciation est caractérisée par l'apparition de cellules d'éléments de cellules avec le phénotype de muscle squelettique et lisse, l'os, le cartilage et le tissu adipeux. Par conséquent, des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes engagées et non engagées sont présentes dans le tissu musculaire humain. Il est démontré qu'une population de cellules progénitrices présentes dans le muscle squelettique provient de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse multipotentes non engagés, et diffère des cellules satellites myogéniques.

Dans le myocarde de rats nouveau-nés a également trouvé cellules étoilées adhésives, appropriées pour le potentiel de différenciation des cellules souches mésenchymateuses multipotentes, comme sous l'influence de la dexaméthasone, ils se différencient en adipocytes, ostéoblastes, chondrocytes, cellules musculaires lisses, myotubes des muscles squelettiques et myocytes cardiaques. Il a été montré que les cellules musculaires lisses vasculaires (péricytes) sont dérivés pluripotentes non différenciées des cellules précurseurs mésenchymateuses périvasculaire. Dans la culture de cellules souches mésenchymateuses expriment une périvasculaires-actine de muscle lisse et récepteur plaquettaire dérivé du facteur de croissance et sont capables de se différencier des cellules musculaires lisses au moins.

Une place particulière en termes de réserves de tige prend du cartilage, très faible potentiel réparatrices dont on croit être due à une carence de cellules souches mésenchymateuses multipotentes ou des facteurs de différenciation et de croissance. On suppose que les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes pré-données à la chondro- et à l'ostéogenèse pénètrent dans le tissu cartilagineux à partir d'autres sources tissulaires.

L'origine tissulaire et les conditions de la mise en place de cellules progénitrices mésenchymateuses dans les tendons ne sont pas non plus établies. Observations Ekspermentalnye suggèrent que dans les premières cellules du tendon d'Achille de lapin après la naissance dans les cultures primaires dans le premier passage et retenir l'expression de collagène de type I et décorine, mais sur la culture plus ils perdent tenotsitov marqueurs de différenciation.

Il convient de noter que la réponse à la question de savoir si en effet localisé dans divers tissus de cellules souches mésenchymateuses multipotentes sont toujours présents dans leur stroma, ou à la piscine de tissus de cellules souches mésenchymateuses est compensée par la migration des cellules souches de moelle osseuse stromales, il est encore attendu.

En plus de la moelle osseuse et d'autres zones de tissus mésenchymateuses d'un organisme adulte, une autre source de CSM peut être le sang de cordon. Il a été démontré que le sang de la veine du cordon ombilical contient des cellules qui ont des caractéristiques similaires morphologiques et antigéniques avec des cellules souches mésenchymateuses multipotentes sont capables d'adhésion, et non inférieure des cellules souches mésenchymateuses multipotentes d'origine de la moelle osseuse en différenciant le potentiel. Dans les cultures de cellules souches mésenchymateuses de sang de cordon ombilical détectées de 5 à 10% non engagés progéniteurs mésenchymateuses multipotentes. Il est avéré que leur nombre dans le sang de cordon est inversement proportionnelle à l'âge gestationnel, ce qui est une preuve indirecte de la migration des cellules souches mésenchymateuses multipotentes dans divers tissus au cours du développement du fœtus. Il y avait d'abord des informations sur l'application clinique des cellules souches mésenchymateuses isolées à partir du sang du cordon ombilical, ainsi que biomatériau dérivé de l'embryon, qui est basée sur la capacité connue des cellules souches fœtales intégrer et prizhivlyatsya fonction dans les organes et systèmes de tissus receveurs adultes.

La recherche de nouvelles sources de cellules souches mésenchymateuses

L'utilisation de cellules souches mésenchymateuses d'origine embryonnaire, comme d'autres cellules fœtales, crée un certain nombre de problèmes éthiques, juridiques, juridiques et législatifs. Par conséquent, la recherche de matériel donneur extra-embryonnaire cellulaire continue. Tentative infructueuse application clinique des fibroblastes de peau humaine, il a été déterminé non seulement la capacité financière élevée de la technologie, mais aussi la différenciation rapide des fibrocytes dans des fibroblastes ayant une prolifération beaucoup moins potentiel et la production d'un nombre limité de facteurs de croissance. De nouveaux progrès dans le domaine de la biologie et sont des cellules MSCs progénitrices de la moelle osseuse mésenchymateuses multipotentes ont permis de développer une stratégie pour l'utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses autologues. La technologie de leur isolement, de leur culture, de leur reproduction ex vivo et de leur différenciation dirigée nécessitait, tout d'abord, l'étude du spectre des marqueurs moléculaires des CSM. Leur analyse a montré que dans les cultures primaires de tissu osseux humain, il existe plusieurs types de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Phénotype Proosteoblastov trouvé dans les cellules exprimant les cellules souches stromales marqueur STRO-1, mais ne portent pas un marqueur de ostéoblastes - phosphatase alcaline. De telles cellules sont caractérisées par une faible capacité à former une matrice osseuse minéralisée, ainsi que par l'absence d'expression de l'ostéopontine et du récepteur de l'hormone parathyroïdienne. Les dérivés de cellules STRO-1-positives qui n'expriment pas la phosphatase alcaline sont représentés par des ostéoblastes intermédiaires et complètement différenciés. On a constaté que les éléments cellulaires des lignes clonées de cellules positives STRO-1 de l'os trabéculaire humain sont capables de se différencier en ostéocytes matures et adipocytes. La différenciation de direction de ces cellules dépend de l'exposition des acides gras poly-insaturés, - cytokines pro-inflammatoires IL-1b et le facteur de nécrose tumorale a (TNF-a), ainsi que le TGF-b anti-inflammatoire et immunosuppressive.

Plus tard, il a été constaté que les cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes manquent seulement spécifique à leur phénotype inhérente, mais expriment des marqueurs complexes, caractéristiques pour mésenchymateuses, cellules endothéliales, épithéliales et musculaires en l'absence d'expression d'antigènes immunophénotypiques des cellules hématopoïétiques - CD45, CD34 et CD14. En outre, les cellules souches mésenchymateuses et produisent constitutivement inductible facteurs de croissance hématopoïétique et non hématopoïétique, interleukines, et chimiokines, et dans les cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes exprimés récepteurs pour certains facteurs de croissance et cytokines. Parmi les cellules stromales de base du corps humain trouvé cellules dormantnye ou de repos avec immunophénotypage, presque identique au profil antigénique des premières 5-fluorouracile cellules multipotentes progénitrices mésenchymateuses - ceux-ci et d'autres cellules expriment le CD117, le marquage des cellules souches « adultes ».

Ainsi, un marqueur cellulaire unique aux cellules souches mésenchymateuses n'a pas encore été établi. On suppose que les cellules au repos sont des populations non engagés des cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes car ils n'expriment des marqueurs cellulaires de déterminé à l'arthrose (Cbfa-1) ou adipogenèse (PPAR-y-2). L'exposition prolongée de cellules en repos proliférant lentement au sérum de veau fœtal conduit à la formation de précurseurs différenciés en phase terminale, caractérisés par une croissance rapide. La croissance clonale de ces cellules souches mésenchymateuses est soutenue par FGF2. Il semble que les dérivés assez génome des cellules souches stromales « fermé » serré a été rapporté sur l'absence de différenciation spontanée dans MSCs -. Sans conditions particulières pour commettre la même ils ne sont pas converties en cellules de la série mésenchymateuses.

Pour étudier la structure de la population dérivée des cellules souches mésenchymateuses sont recherchées protéines marqueurs de différenciation sur les lignées de cellules stromales et les cultures primaires. Dans l'essai de colonies clonales de cellules de moelle osseuse in vitro a constaté que lorsqu'il est soumis à des cultures primaires de l'EGF augmente la taille moyenne des colonies et réduit l'expression clonale de la phosphatase alcaline, alors que l'addition d'hydrocortisone active l'expression de la phosphatase alcaline qui est un marqueur de différenciation ostéogénique de l'orientation MSCs. Les anticorps monoclonaux contre STRO-1 ont permis de séparer et les populations d'étude des cellules adhérentes STRO-1 positifs dans un système hétérogène des cultures Dexter. Le spectre de cytokines régulent non seulement la prolifération et la différenciation des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes, mais aussi participer à la formation, la formation et la résorption du tissu osseux par para, automatique et des mécanismes endocriniens. La libération médiée par le récepteur de messagers secondaires tels que l'AMPc, le diacylglycérol, de l'inositol triphosphate, et Ca2 + sont également utilisés pour l'analyse des marqueurs de différentes catégories de tissus du stroma de cellules exprimant les récepteurs correspondants. L'utilisation d'anticorps monoclonaux en tant que marqueurs a permis de mettre en place les organes lymphoïdes stromales appartenant cellules réticulaires pour T et des zones dépendantes-B.

Pendant un certain temps les disputes scientifiques ont continué autour de la question de la possibilité de l'origine de MSC de la cellule souche hématopoïétique. En effet, avec l'explantation de la suspension de cellules de moelle osseuse en cultures monocouches, des colonies discrètes de fibroblastes s'y développent. Cependant, il a été démontré que la présence de précurseurs de colonies de fibroblastes et divers différenciation des germes de tissu hématopoïétique dans le cadre de la moelle osseuse ne sont pas la preuve de leur origine commune des cellules souches hématopoïétiques. En utilisant l'analyse discriminante des cellules souches de la moelle osseuse a constaté que le microenvironnement à la transplantation hétérotopique, les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse est transférée, ce qui prouve l'existence, dans la moelle osseuse indépendante de la population histogénétique MSC de cellules hématopoïétiques.

En outre, un procédé de clonage sélectif révélé dans des cultures monocouches de cellules stromales de moelle osseuse d'une nouvelle catégorie de cellules précurseurs de déterminer leur nombre, pour étudier leurs propriétés, potentiel de prolifération et de différenciation. On a constaté que les cellules stromales in vitro fibroblaste prolifèrent et forment des colonies diploïdes que lorsque la transplantation inverse dans le corps assurant la formation de nouveaux organes hématopoïétiques. Les résultats des études de clones individuels indiquent qu'il ya une population de cellules dans leur potentiel de prolifération et la différenciation en mesure de revendiquer le rôle des cellules souches du tissu stromal, indépendamment Gistogeneticheskaja des cellules souches hématopoïétiques dans les cellules souches stromales. Les cellules de cette population sont caractérisées par une croissance auto-entretenue et se différencient en cellules progénitrices de l'os, du cartilage et du tissu réticulaire de la moelle osseuse.

D'un grand intérêt sont les résultats des études Chailakhyan R. Et al (1997-2001), qui étaient les cellules progénitrices stromales dérivées de la moelle osseuse cultivées lapins, cobayes, et les souris d'un milieu de culture MEM complété avec du sérum de veau foetal. Les auteurs ont réalisé une explantation avec une densité initiale de 2-4 x 103 cellules de moelle osseuse par 1 cm2. En tant que source nourricière, des cellules de moelle osseuse inactivées par irradiation, homologues ou hétérologues, ont été utilisées dans une dose conservant l'action d'alimentation mais bloquant complètement leur prolifération. Des colonies discrètes primaires de deux semaines de fibroblastes ont été trypsinisées pour produire des souches monoclonales. Preuve des colonies d'origine clonale ont été obtenus en utilisant des marqueurs chromosomiques dans les cultures mixtes de la moelle osseuse des hommes et des cobayes femelles, tir time-lapse cultures vivantes, ainsi que dans les cultures mixtes de la moelle osseuse de souris syngéniques et ABC SVAT6T6. Suspension de La transplantation de cellules de moelle osseuse fraîchement isolées cultivées dans des fibroblastes in vitro ou stromales sous la capsule rénale a été réalisée en ivalonovyh supports poreux ou de la gélatine, ainsi que de lapin inactivé par la matrice de l'os spongieux. Les clones de transplantation dans les cuisses couverture des os de porc Guinée nettoyé de tissus mous et périoste, couper l'épiphyse et laver à fond leur moelle osseuse. L'os a été découpé en fragments (3-5 mm), séché et irradié à une dose de 60 Gy. Dans les couvertures osseuses, des colonies de fibroblastes individuelles ont été placées et implantées par voie intramusculaire. Pour la transplantation intraperitoneale des fibroblastes du stroma, cultivées in vitro, nous avons utilisé les types une chambre de diffusion (V = 0015 cm 3, h = 0, l mm) et D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Lors de l' étude de la dynamique de croissance des souches clonales Chailakhyan R. Et al (2001) ont constaté que les cellules individuelles, formant colonie fibroblastes, ainsi que leurs descendants ont un grand potentiel prolifératif. Le 10 passage du nombre de fibroblastes dans certaines souches était 1,2-7,2 x 10 ⁹ cellules. Au cours de leur développement, ils ont effectué jusqu'à 31-34 duplications cellulaires. Ainsi , la transplantation hétérotopique de souches dérivées de moelle osseuse formées par des précurseurs stromales plusieurs clones douzaine ont conduit au transfert de microenvironnement de la moelle osseuse et de l' éducation dans la nouvelle transplantation d'organes hématopoïétique de la zone. Les auteurs ont soulevé la question de savoir si les clones individuels peuvent tolérer les cellules stromales de la moelle osseuse microenvironnement, ou nécessite la collaboration de plusieurs différents progénitrices stromales clonogénique? Et si les clones individuels seront en mesure de transférer le microenvironnement, si elle est pleine de sang tous les trois de germes, ou différents clones fournissent la formation de microenvironnement hématopoïétique pour différents germes? Pour répondre à ces questions a été mis au point la technologie de culture des cellules souches stromales dans le gel de collagène qui vous permet de tirer de la surface des fibroblastes cultivés colonies destinées à être replantées ectopique. Les clones individuels fibroblastes du stroma, les cellules de moelle osseuse issues de souris CBA et les cobayes, les couper en même temps qu'un fragment de la couche de gel et hétérotopique transplanté - sous la capsule rénale de souris syngéniques ou autologues chez le cobaye du ventre du muscle. Lors de la transplantation dans le muscle, les colonies sur le gel ont été placés dans les couvertures osseuses.

Nous avons constaté que par 50-90 jours après la transplantation de colonie de fibroblastes de moelle osseuse dans 20% des cas ont été observés dans le développement de la zone de transplantation d'os ou des os et des tissus hématopoïétiques. Chez 5% des animaux receveurs, les foyers de tissu osseux formés contenaient une cavité remplie de moelle osseuse. A l'intérieur des cylindres d'os de tels foyers ont une forme arrondie et une capsule constituée d'un tissu osseux, avec des ostéocytes et bien développée couche ostéoblastique. La cavité de la moelle osseuse contient tissu réticulaire avec des cellules myéloïdes et érythroïdes, les proportions qui ne diffèrent pas de celui de la moelle osseuse normale. La greffe de rein est un organe médullaire typique formée par greffe de moelle osseuse d'origine, où la capsule osseuse ne couvre que la cavité médullaire de la capsule rénale. Hématopoïétique tissu inclus myéloïdes, mégacaryocytes et des éléments érythroïdes. Stroma du canal médullaire a été bien développé des sinus et contenait le système de cellules de graisse typique. En même temps, dans le domaine de la transplantation de certaines colonies d'os avec aucun signe de hématopoïèse il a été trouvé sous la capsule rénale. Etude de la puissance proliferative et la différenciation des clones individuels ont été poursuivies sur des souches de moelle osseuse de lapin monoclonaux, les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture et dans une éponge de ivalonovoy séparé pesant 1-2 mg repliée sous la capsule rénale de l'os de lapin donneur de moelle osseuse. Ces cellules ont été soumises à une autotransplantation 21 souche monoclonal. Les résultats ont été pris en compte en 2-3 mois. Les auteurs ont constaté que 14% des souches monoclonaux de moelle osseuse transplantées corps formé composé de cavité de l'os et la moelle osseuse remplie de cellules hématopoïétiques. Dans 33% des cas, les souches transplantées formées os compact avec des cavités de taille différente ostootsitami briqué en ostéoblastique et la couche développée. Dans certains cas, des éponges clones transplantées développés réticulum sans os ou des cellules hématopoïétiques. Parfois, la formation de stroma réticulaire a eu lieu avec un réseau bien développé de sinusoïdes, mais pas peuplé les cellules hématopoïétiques. Ainsi, les résultats obtenus sont similaires à ceux obtenus par la transplantation de clones sur gel de collagène. Cependant, si la transplantation des clones cultivés sur le substrat conduit à la formation du tissu de moelle osseuse est de 5% de l'os - 15% et le tissu réticulaire - dans 80% des cas, les souches monoclonal de transplantation formation de cellules de la moelle osseuse a été observée dans 14% des cas d'os - dans 53% et réticulaire - dans 53% des cas. Selon les auteurs, cela indique que les conditions pour la mise en œuvre des potentiels de prolifération et la différenciation des fibroblastes stromales lorsqu'elles sont transplantées sur supports poreux étaient plus optimale que leurs greffes dans l'os et recouvre le substrat de collagène. Il est pas exclu que l'utilisation de méthodes plus avancées de la culture et de la transplantation de la rétroaction des clones peut améliorer les conditions de la mise en œuvre de ses clones potentiels de différenciation et de modifier ces relations. D'une façon ou une autre, mais la valeur principale de la recherche réside dans le fait que certains des clones de cellules stromales capables de former du tissu osseux tout en assurant microenvironnement hématopoïétique stromales immédiatement pour trois germes de sang de la moelle osseuse: érythroïde, myéloïde et mégacaryocytaire, créant ainsi un grand points d'appui assez de tissu hématopoïétique et une certaine masse osseuse.

En outre, les auteurs ont résolu le problème de la capacité de ces types de différenciation cellulaire de cellules progénitrices stromales clonales individuelles dans des conditions d'un système fermé de chambres de diffusion. En outre, il était nécessaire de déterminer si les clones individuels d'exposition pluripotentes ou affichage pour différencier le potentiel requiert une interaction coopérative de plusieurs clones avec un signe cytodifferentiation fixe, rapport différent détermine la formation préférentielle de l'os, du cartilage ou réticulaire. En combinant deux approches méthodologiques - monoclonal isole os cellules souches stromales de la moelle et les transplanter dans les chambres de diffusion, Chailakhyan R. Et al (2001) ont obtenu des résultats qui ont permis d'aborder la compréhension de l'organisation structurelle du stroma de la moelle osseuse. Transplantation souches monoclonaux cellules souches stromales dans des cellules de type S ont donné lieu à la formation à la fois de tissu osseux et du cartilage, ce qui démontre la capacité de la progéniture d'un cellules stromales formant colonie formant simultanément l'os et du cartilage. L'hypothèse selon laquelle les tissus osseux et cartilagineux proviennent de la cellule progénitrice stromale commune a été répétée à plusieurs reprises. Cependant, cette hypothèse n'a pas eu une confirmation expérimentale correcte. La formation d'os et de cartilage dans les chambres de diffusion était une preuve nécessaire de l'existence parmi les cellules souches du stroma de la moelle osseuse d'une cellule précurseur commune pour ces deux types de tissus.

Ensuite, 29 souches clonales des deuxième et troisième passages obtenus à partir des cultures primaires de la moelle de lapin ont été placées dans des chambres de diffusion et implantées par voie intrapéritonéale avec des animaux homologues. Des études ont montré que 45% des souches monoclonales de moelle osseuse ont des pouvoirs ostéogéniques. Exceptionnellement, le tissu réticulaire contenait 9 chambres, mais avec l'os et le tissu cartilagineux, il était présent dans 13 autres chambres, ce qui représentait 76% de toutes les souches. Dans les chambres de type O, où la différenciation était possible à la fois pour les tissus osseux et cartilagineux, 16 souches ont été étudiées. Dans quatre chambres (25%), les tissus osseux et cartilagineux se sont formés. Il convient encore de noter que les études Chailakhyan R. Et al (2001) des cellules progénitrices individuelles ont subi une souche de cellules consistant en 31 à 34 doublements, et leur descendance est 0,9-2,0 × 10 ⁹ cellules. Le nombre de mitoses auxquelles étaient exposées les cellules précurseurs des souches polyclonales était pratiquement le même que celui des cellules des souches monoclonales. En même temps, la vitesse de développement des souches polyclonales, en particulier dans la première phase de leur formation, dépendait dans une large mesure du nombre de colonies utilisées pour l'initiation des souches. Des souches diploïdes de fibroblastes embryonnaires humains (WI-38) lorsqu'elles ont été reformées à 12-15 niveaux de duplication ont également formé des colonies qui diffèrent par leur diamètre et par la teneur en cellules de celles-ci. Les grandes colonies contenant plus de 103 cellules n'étaient que 5-10%. Avec l'augmentation du nombre de divisions, le pourcentage de grandes colonies a diminué. Les souches de fibroblaste stromales de la moelle osseuse mono- et polyclonaux conservé un chromosome diploïde fixé après 20 doublements ou plus, et la tendance de développement est comparable à la dynamique des souches diploïdes de fibroblastes embryonnaires. L'analyse du potentiel de différenciation des cellules progénitrices stromales de la moelle osseuse, réalisée par transplantation de souches monoclonales dans des chambres de diffusion, a montré que la moitié d'entre elles sont ostéogéniques. Les grandes colonies représentaient 10% de leur nombre total. Par conséquent, le nombre de cellules formant des colonies ostéogéniques correspond à environ 5% de leur population totale. Dans la masse totale des cellules progénitrices ostéogéniques identifiées par les auteurs, il y avait des cellules capables de former des tissus osseux et cartilagineux simultanément. Pour la première fois , il a constaté que pour ces deux types de tissus dans l'organisme adulte est la cellule précurseur commun: 25% des clones testés ont été créés par des cellules similaires, et leur nombre dans la population générale des cellules progénitrices n'a pas été inférieur à 2,5%.

Ainsi, la transplantation hétérotopique de clones individuels de fibroblastes de moelle osseuse a ouvert de nouveaux aspects de l'organisation structurelle de la population de cellules progénitrices mésenchymateuses. Trouvé cellules souches stromales capables de transférer immédiatement microenvironnement spécifique pour toutes les souches hématopoïétiques qui comptent parmi les clones étudiés plus grands sur différents modèles est de 5 à 15% (0,5 à 1,5% du nombre total de cellules progénitrices détecté). En plus des clones, le transfert complet microenvironnement de la moelle osseuse, il y a des cellules progénitrices, seulement déterministes à la formation osseuse, qui forme lors de son transfert à un système ouvert, l'os qui ne prend pas en charge le développement de l'hématopoïèse. Leur nombre à partir du nombre total de cellules progénitrices est de 1,5-3%. Certaines de ces cellules peuvent former un tissu osseux avec une période limitée d'auto-entretien. Par conséquent, la population de cellules progénitrices stromales est hétérogène dans son potentiel de différenciation. Parmi eux, il y a une catégorie de cellules, qui revendique le rôle des cellules souches stromales capables de se différencier en trois dimensions inhérentes au tissu stromal de moelle osseuse, la formation des os, du cartilage et du tissu réticulaire. Ces données nous permettent d'espérer que, avec l'aide de différents marqueurs cellulaires sera possible de déterminer la contribution de chaque type de cellules stromales dans le microenvironnement de l'organisation et un soutien hématopoïèse dans les cultures Dexter.

Caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses

Au cours des dernières années, on a constaté que dans des cultures stationnaires de la moelle osseuse mésenchymateuses cellules progénitrices multipotentes ont présenté une population limitée de petites cellules agranulaires cellules (RS-1), caractérisé par une faible capacité de colonisation et l'absence d'expression de l'antigène Ki-67 spécifique pour les cellules en prolifération. Paramètres antigéniques dormantnyh cellules RS-1 sont différents du spectre d'antigènes déterminés à prolifération rapide de cellules souches stromales. Il a été constaté qu'un taux élevé de prolifération de cellules progénitrices engagées était observé uniquement en présence de cellules RS-1. A leur tour, les cellules RS-1 augmentent le taux de croissance sous l'influence de facteurs sécrétés par les dérivés les plus matures des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Il semble que les cellules RS-1 sont une sous-classe de MSC non engagées capables de recyclage. In vitro résistantes au 5-fluorouracile cellules souches stromales de la moelle osseuse caractérisée par une faible teneur en ARN et des niveaux élevés d'expression du gène de l'ornithine-décarboxylase - marqueur des cellules non proliférantes.

La reproduction intensive des cellules progénitrices stromales commence après la fixation sur le substrat. Lorsque cela est exprimé profil de marqueur des cellules peu différenciées: SH2 (récepteur de TGF (3), SH3 (protéine de signalisation de domaine), les types de collagène I et III, la fibronectine, le récepteur d'adhésion VCAM-1 (CD106) et ICAM (CD54), de cadhérine-11 , CD44, CD71 (récepteur de transferrine), CD90, CD120a et CD124, mais sans l'expression des marqueurs caractéristiques des cellules souches hématopoïétiques (CD34, CD14, CD45). La croissance clonale permet aux cellules souches mésenchymateuses à plusieurs reprises des passages pour produire une culture d'un grand nombre pluripotentes progénitrices stromales génétiquement homogène des cellules. 2-3 le passage de leur nombre atteint 50-300000000. Dans la culture d'une densité suffisante après l'arrêt de la prolifération des cellules souches stromales, à la différence des fibroblastes de tissus hématopoïétiques se différencient en adipocytes, myocytes, cellules du cartilage et du tissu osseux. La combinaison des trois différenciation des signaux régulateurs comprenant 1-méthyl-izobutilksantin (inducteur de la formation d'AMPc intracellulaire), la dexaméthasone (un inhibiteur de phospholipase a et C) et d'indométhacine (inhibiteur de la cyclooxygénase, une activité d'abaissement de la thromboxane et) tourne dans les adipocytes jusqu'à 95% des cellules mésenchymateuses progénitrices. La formation des adipocytes à partir de cellules stromales immatures a confirmé l'expression du gène de la lipoprotéine lipase, l'identification histochimique des apolipoprotéines et des récepteurs peroxysomale. Les cellules d'un même clone influencé par le TGF-b dans du milieu exempt de sérum crée une population homogène de chondrocyte. La culture cellulaire à plusieurs couches de la matrice extracellulaire du cartilage est caractérisé développé constitué par le type de protéoglycanes et le collagène II. Le milieu nutritif à 10% constitué de signaux de différenciation de l'effet de sérum complexe foetal b-glycérophosphate (phosphate inorganique donator), l'acide ascorbique et la dexaméthasone, dans les mêmes cellules progénitrices souches stromales de la culture mène à la formation d'agrégats cellulaires. Dans de telles cellules, il y a une augmentation progressive de l'activité du taux de phosphatase alcaline et ostéopontine, ce qui indique la formation de la minéralisation des os de laquelle les cellules ont confirmé une augmentation progressive de calcium intracellulaire.

Selon certains, la capacité des cellules souches mésenchymateuses de se diviser indéfiniment et la reproduction de différents types de cellules de la lignée mésenchymateuses associées à un haut degré de plasticité. Lorsqu'ils sont administrés dans les ventricules, ou la substance blanche des cellules souches mésenchymateuses migrer dans le parenchyme du tissu nerveux et se différencier en lignée cellulaire dérivée neuronale ou gliale. De plus, il y a des informations sur MSC transdifférenciation dans les cellules souches hématopoïétiques in vitro et in vivo. Une analyse plus approfondie analyse dans certaines études déterminées ductilité exceptionnellement élevé de MSCS, qui se manifeste dans leur capacité à se différencier en astrocytes, oligodendrocytes, les neurones, les cardiomyocytes, les cellules musculaires lisses et des cellules musculaires squelettiques. Dans un certain nombre d'études transdifferentsirovochnogo potentiel des cellules souches mésenchymateuses in vitro et in vivo ont trouvé que des cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes d'origine de la moelle osseuse se différencient en phase terminale dans des lignées cellulaires qui forment les os, le cartilage, les muscles, les nerfs et le tissu adipeux, ainsi que des tendons et du stroma qui prend en charge l'hématopoïèse .

Cependant, dans d'autres études, aucun signe de restriction du génome de pluripotence des cellules souches mésenchymateuses et ne pouvaient pas être détectés populations de cellules souches stromales, mais pour vérifier d'éventuelles cellules stromales pluripotentes a enquêté sur plus de 200 clones de MSC isolés à partir d'une culture primaire. La grande majorité des clones in vitro a conservé la capacité de se différencier dans des directions ostéogénique, chondrogénique et adipogènes. Si l'on exclut la probabilité de migration des cellules receveuses par transplantation de cellules souches mésenchymateuses sous la capsule rénale ou dans des chambres de diffusion, il est apparu que les cellules progénitrices du stroma conservent in situ phénotype hétérogène, ce qui indique soit l'absence d'un des facteurs de restriction de greffe de zone ou l'absence de cellules souches mésenchymateuses pluripotentes seul. En même temps, a permis l'existence d'un type rare de cellules souches pluripotentes somatiques, qui sont des précurseurs communs de cellules souches adultes.

Sur multi, mais pas de véritables cellules souches mésenchymateuses pluripotentes constituent une très petite fraction de cellules de moelle osseuse et sont capables, dans certaines circonstances, lorsqu'elles sont cultivées in vitro à proliférer sans entrer en différenciation, comme en témoigne leur engagement de la lignée induite par des cellules dans les os, le cartilage, la graisse, le tissu musculaire ainsi que dans les ténocytes et les éléments stromaux supportant l'hématopoïèse. Typiquement, une exposition continue dans un milieu de culture avec du sérum de veau foetal provoque MSCs de sortie dans stromales de cellules progénitrices engagées, la descendance qui subit une différenciation terminale spontanée. In vitro possible d'obtenir la formation d'ostéoblastes directionnel en ajoutant à la dexaméthasone milieu de conditionnement, ß-glycerophosphate et de l'acide ascorbique, tandis que la combinaison de la différenciation des signaux de la dexaméthasone et de l'insuline induit la formation d'adipocytes.

Établi que avant d'entrer dans l'étape de la différenciation terminale des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse pour créer certaines conditions de culture initialement différencier en cellules souches mésenchymateuses fibroblaste. Des dérivés de ces cellules in vivo sont impliqués dans la formation des os, du cartilage, des tendons, la graisse et le tissu musculaire ainsi que l'hématopoïèse support stromal. De nombreux auteurs comprennent le terme « cellules souches mésenchymateuses multipotentes » en fait MSCS, et les cellules souches stromales engagées et les tissus mésenchymateuses de la moelle osseuse. Analyse clonale de cellules progénitrices multipotentes d'origine mésenchymateuses de moelle osseuse a montré qu'un peu plus d'un tiers des clones différenciés dans l'arthrose, la hondro- et adipocytes, tandis que d'autres clones de cellules ont un potentiel osteogene et une forme seulement hondro- et ostéocytes. Ce clone de cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes comme stérilet-9, dans des conditions appropriées microenvironnement différenciées en cellules ayant des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles non seulement des ostéoblastes, des chondrocytes et des adique potsitov mais les cellules stromales qui supportent l'hématopoïèse. Isolées à partir de cellules de la moelle osseuse de rat fœtal clone cellules mésenchymateuses différenciées de RCJ3.1 de phénotypes différents. Par l'action combinée de l'acide ascorbique, b-glycérophosphate, et de la dexaméthasone à partir d'éléments cellulaires de ce clone est tout d'abord formé myocytes multinucléées, puis, successivement, les adipocytes, les chondrocytes et les îlots os minéralisé. La population de cellules granulaires du périoste de foetus de rat correspond à des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes non engagés, caractérisée par un faible taux de prolifération, de ne pas exprimer des marqueurs de différenciation et de différenciation dans des conditions de culture pour former hondro-, ostéo et adipocytes et des cellules musculaires lisses.

Ainsi, il faut reconnaître que la question du génome plyuri- ou pluripotence des cellules souches mésenchymateuses est toujours ouverte, ce qui affecte par conséquent la présentation du potentiel de différenciation des cellules souches stromales, qui est pas complètement installé.

La caractéristique expérimentalement prouvée et importante des cellules souches mésenchymateuses est leur capacité à quitter la niche tissulaire et à circuler dans la circulation sanguine générale. Pour activer le programme de différenciation génétique, ces cellules souches circulantes doivent tomber dans le microenvironnement approprié. Il est montré que lorsqu'il est administré de façon systémique dans le sang des animaux receveurs des cellules immatures implantées MSCs dans différents organes et tissus, puis différenciées en cellules sanguines, les myocytes, adipocytes, chondrocytes et les fibroblastes. Par conséquent, dans les zones tissulaires locales, il existe une interaction régulatrice du signal entre les cellules progénitrices stromales non créditées et engagées, ainsi qu'entre elles et les cellules matures environnantes. On suppose que l'induction de la différenciation est effectuée facteurs de régulation paracrine d'origine mésenchymateuse et nemezenhimalnogo (facteurs de croissance, les eicosanoïdes, les molécules de la matrice extracellulaire) qui fournissent les relations spatiales et temporelles dans le microenvironnement de progéniteurs mésenchymateuses multipotentes. Par conséquent, des dommages locaux de tissu mésenchymateux devrait conduire à la formation d'une zone de micro-environnement des cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes diffèrent qualitativement à partir des signaux régulateurs complexes des tissus intacts dans lequel les processus physiologiques se produisent au lieu de la régénération de réparation. Cette différence est extrêmement importante en termes de spécialisation du phénotype cellulaire dans un microenvironnement normal et induit par les dommages.

Selon les idées, c'est ici que sont posés les mécanismes de la différence fondamentale de deux processus connus - la régénération physiologique et la prolifération inflammatoire. Le premier d'entre eux se termine par la restauration de la composition tissulaire cellulaire spécialisée et de sa fonction, alors que le résultat du processus de prolifération est la formation d'éléments du tissu conjonctif mature et la perte de fonction de la zone tissulaire lésée. Ainsi, pour le développement de programmes optimaux pour l'utilisation de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes en médecine régénératrice-plastique, une étude attentive des caractéristiques de l'influence des facteurs de microenvironnement sur la différenciation des MSC est nécessaire.

La dépendance du compartiment de la structure des cellules souches de la para- cellulaire et les régulateurs autocrines dont l'expression est modulée par des signaux externes, n'a pas une incontestable. Parmi les fonctions des facteurs de régulation, les plus importantes sont le contrôle de la division asymétrique des CSM et l'expression des gènes déterminant les étapes de la commision et le nombre de divisions cellulaires. Les signaux externes, dont dépend le développement ultérieur de MSC, sont fournis par leur microenvironnement. Dans immatures MSCs à proliférer suffisamment longtemps, tout en maintenant la capacité de se différencier en ligne adipocytes, myofibroblastes, tissu stromal hématogène, les cellules du cartilage et l'os. On constate qu'une population limitée de circulation d'éléments de cellules stromales SB34-négatives de la circulation générale est renvoyée au tissu du stroma de la moelle osseuse, se transforme en une ligne où des cellules souches hématopoïétiques CD34-positive. Ces observations suggèrent que les cellules mésenchymateuses progénitrices de recirculation dans le sang du tissu apporte son soutien à l'équilibre des cellules souches stromales dans différents organes en mobilisant pool commun de cellules stromales de la moelle osseuse immature. La différenciation des cellules souches mésenchymateuses dans les cellules avec plusieurs phénotypes mésenchymateuses et leur participation à la réparation ou la régénération des os, du cartilage, des tendons et le tissu adipeux in vivo démontrent des modèles de transfert adoptif chez les animaux de laboratoire. Selon d'autres auteurs, la migration éloignée du lit vasculaire MSCs est combiné avec un déplacement local ou korotkodistantnym cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes dans le tissu du cartilage de réparation, la régénération musculaire, et d'autres réactions de réduction.

Les réserves locales proviennent des fondations de tissus stromales jouent une source de rôle des cellules dans un processus de régénération des tissus physiologiques et sont alimentés par des transports lointains MSCs les ressources souches des tissus stromales des dépenses. Cependant, dans le besoin de la mobilisation d'urgence de la capacité cellulaire réparatrices, tels que les traumatismes multiples, dans les processus de régénération réparatrices participe train toute MSCS, et la périphérie par la circulation sanguine a recruté des cellules précurseurs mésenchymateuses de la moelle osseuse.

Transplantation de cellules souches mésenchymateuses

Il existe certains parallèles entre les processus de régénération physiologique des tissus et leur formation au cours de la période de développement intra-utérin. L'embryogenèse de l'homme et les mammifères, la formation de divers types de cellules spécialisées dérivées de ecto, méso et piscine couches de germe de endoderme, mais avec la participation obligatoire du mésenchyme. Le réseau cellulaire lâche du tissu mésenchymateux embryonnaire remplit de nombreuses fonctions régulatrices, métaboliques, squelettiques et morphogénétiques. La tabulation des organes provisoires est effectuée seulement après la condensation du mésenchyme due à la croissance clonogénique des cellules progénitrices, qui génèrent les signaux morphogénétiques primaires de l'organogenèse. Stromales mésenchyme embryonnaire dérivé créer corps d'échafaudage et provisoires constituent la base de la future energoplasticheskogo assurer en raison de la croissance de la vasculaire primaire et les vaisseaux lymphatiques. En d'autres termes, les éléments stromaux de l'unité microcirculatoire des organes fœtaux apparaissent avant la formation de leurs unités structurelles-fonctionnelles. En outre, la migration active des cellules mésenchymateuses pendant l'organogenèse fournit l'orientation spatiale le développement des organes en raison marquer leurs limites en volume Restriction homéotique Hox-tepov. Sur l'échafaud stromal il y a aussi un assemblage d'unités structurelles et fonctionnelles d'organes parenchymateux, qui contiennent souvent des cellules morphogénétiquement et fonctionnellement complètement différentes. Par conséquent, dans l'embryogenèse, les fonctions mésenchymateuses sont primaires et sont réalisées en générant des signaux régulateurs qui activent la prolifération régionale et la différenciation des cellules épithéliales progénitrices. Les cellules de mésenchyme embryonnaires produisent des facteurs de croissance tels que LEG, HGF-b, CSF, pour lesquels les cellules progénitrices parenchymales ont des récepteurs correspondants. Dans le tissu mature différencié d'un organisme adulte, le réseau de cellules stromales génère également des signaux pour maintenir la viabilité et la prolifération de cellules progénitrices d'origine non mésenchymateuse. Cependant, les signaux régulateurs de stroma de spectre dans postnatal ontogenèse autre (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) et vise à assurer la régénération physiologique ou la réparation des zones tissulaires endommagées. De plus, les caractéristiques spectrales des facteurs régulateurs stromaux dans chaque type de tissu et même dans le même organe sont différentes. En particulier, l'hématopoïèse et lymphopoïèse à la multiplication et la différenciation des cellules hématopoïétiques et immunocompétentes ne se produit que dans certains organes, au sein de laquelle agit microenvironnement stromal offrant des conditions de maturation des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes. Il appartient aux facteurs réglementaires microenvironnement dépend de la capacité des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes pour repeupler le corps à proliférer et à mûrir dans ses niches microstructurales.

Parmi les composants de la matrice extracellulaire, qui produisent des cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes, il convient de noter la fibronectine, la laminine, le collagène et les protéoglycanes, ainsi que CD44 (hyaluronane et du récepteur d'ostéopontine) recevant la partie principale dans l'organisation de l'interaction intercellulaire et la formation de la matrice extracellulaire dans la moelle osseuse et l'os . Il est prouvé que mésenchymateuses de la moelle osseuse, les cellules multipotentes créer microenvironnement stromal redshestvenniki, fournissant les signaux inductifs et réglementaires non seulement le MSC, mais aussi des précurseurs hématopoïétiques et os nemezenhimalnye cellules souches de la moelle. On sait que les cellules souches mésenchymateuses impliquées dans l'hématopoïèse mesuré par leur aptitude à se différencier en cellules stromales qui supportent l'hématopoïèse, dans lequel le signal de guidage actif MSK obtenue directement à partir des cellules souches hématopoïétiques. Voilà pourquoi la culture de cellules souches stromales de réseau est la base de l'alimentation de tous les clones de cellules hématopoïétiques.

Dans une intensité de l'organisme mature de l'hémodialyse et lymphopoïèse dans un état d'équilibre dynamique avec la « dépense » des cellules sanguines matures et les cellules du système immunitaire dans la périphérie. Comme les cellules stromales de la moelle osseuse et les organes lymphoïdes rarement mis à jour, les structures stromales de restructuration importantes ne se produit pas en eux. Apportez le système d'équilibre dynamique est possible avec l'aide des dommages mécaniques à tous les organes hémo ou lymphopoïèse, ce qui conduit au même type de changements successifs qui affectent non seulement et pas tant de cellules hématopoïétiques ou lymphoïdes, en tant que structures stromales organes endommagés. Dans le processus de régénération réparatrices principalement formé cadre stromale, qui repeupler alors les cellules hématopoïétiques ou immunitaires. Ce fait connu depuis longtemps fait le modèle pratique de régénération post-traumatique pour étudier le microenvironnement stromal des organes hématopoïétiques. En particulier, pour l'étude de la régénération de réparation de la moelle osseuse est utilisée cavité médullaire vidange mécanique des os longs - curetage, ce qui permet de mettre rapidement et efficacement le tissu hématopoïétique à partir d'un état d'équilibre dynamique. Lorsque l'on étudie le processus de régénération de réparation de composants hématopoïétiques et la moelle osseuse du stroma après la vidange mécanique de la cavité médullaire des cochons d'Inde du tibia trouvé que, entre la régénération des indicateurs de cellules hématopoïétiques et stromales (le nombre de cellules hématopoïétiques, la concentration et la quantité de cellules souches stromales) il n'y a pas de corrélation directe. De plus, on a constaté que l'augmentation de la population des cellules souches stromales se produit à une date antérieure après curetage, et eux-mêmes des fibroblastes stromales sont fosfatazopolozhitelnymi, qui est caractéristique du tissu ostéogénique. Il a également été établi que les os longs curetage 3-5 conduit à la croissance de la population de cellules dans la moelle osseuse et non utilisé même dans la rate, qui chez le cobaye est seul organisme lymphopoïétique.

Processus morphologiques image réparatrices dans la moelle osseuse kyuretirovannyh cobayes tibiales correspond généralement aux données de la littérature obtenues dans des expériences sur les animaux d'autres espèces, la dynamique des changements qui ont lieu après l'ablation du tissu hématopoïétique est la même pour toutes les espèces et la différence ne concerne que les paramètres de temps . Morphologiquement procédure de phase pour la restauration de l'hématopoïèse dans la cavité médullaire est vidé dans des processus successifs organisant la formation de caillots de sang os de fibres grossières, sa résorption, des sinusoïdes et du stroma de formation réticulaire, qui repopulation en outre des éléments hématopoïétiques. Le nombre de cellules progénitrices hématopoïétiques dans le processus de régénération des tissus de la moelle osseuse augmente en parallèle augmentation de la teneur en cellules souches hématopoïétiques.

Gerasimov Yu et al (2001) ont comparé les changements dans le nombre de cellules hématopoïétiques et de la quantité de précurseurs de cellules de stroma dans les différentes phases du processus de régénération. Il a été constaté que les changements quantitatifs dans les cellules de la moelle osseuse dans kyuretirovannoy osseuse correspond à la dynamique des caractéristiques de régénération morphologique. Réduction au cours des trois premiers jours de contenu cellulaire dans les auteurs régénérés attribuent la perte de cellules hématopoïétiques en raison des effets indésirables du microenvironnement, ce qui crée un tissu réticulaire se développe dans l'os restant la moelle dans l'épiphyse et dans celui-ci pour former des foyers ostéoïde et des lésions vasculaires avec curetage. 7-12 e jour élever les cellules yaderosoderzhaschih coïncide avec l'apparition des foyers individuels dans les zones de prolifération des cellules stromales hématopoïétiques myéloïdes. Le jour 20, il y a des parties importantes de la moelle osseuse régénéré et des sinus bien développés, qui est accompagnée d'une augmentation significative du nombre total de cellules. Cependant, le nombre de cellules hématopoïétiques dans cette période a été de 68% des niveaux de contrôle. Ceci est cohérent avec les données précédemment publiées montrent que le nombre de cellules hématopoïétiques après curetage atteint les normes seulement 35-40 jours après l'opération.

Dans la période post-traumatique précoce, la principale source cellulaire pour la restauration de l'hématopoïèse est les éléments cellulaires conservés dans le curetage. Plus tard, la principale source de régénération du tissu hématopoïétique de la moelle osseuse sont les cellules souches, repeuplant les zones stromales libres. Comme pour certaines catégories de cellules stromales (endothéliales, réticulaires et ostéogéniques), les sources assurant leur formation lors de la reconstruction de la cavité médullaire restent inexpliquées. Les résultats de Yu.V. Gerasimov et ses co-auteurs (2001) montrent que dans la moelle osseuse conservée après curetage, la concentration de cellules formant des colonies de fibroblastes est significativement plus élevée que dans la moelle osseuse normale. Les auteurs pensent que, avec curetage est élution sélective plus intense des cellules hématopoïétiques par rapport aux cellules formant des colonies de stroma qui sont impliqués dans la formation de stroma et plus fermement liés à la substance de base que les cellules hématopoïétiques.

La dynamique des changements dans le nombre de cellules formant des colonies fibroblastes en corrélation avec l'intensité des processus ostéogenèse résorption osseuse trabéculaire subséquente et la formation stroma réticulaire qui peuplent les cellules hématopoïétiques. La plupart des cellules progénitrices stromales forment un tissu osseux grossier-fibreux et un stroma réticulaire aux temps de régénération indiqués. Pour les fractures du fémur dans des conditions d'ostéosynthèse prolongée au 5ème jour dans la zone de régénération augmente la concentration des cellules et le nombre de fibroblastes formant des colonies, et la formation d'os dans intensive leur nombre augmente de 6 fois. On sait que les cellules de moelle osseuse formant des colonies de fibroblastes possèdent des propriétés ostéogéniques. Le nombre de cellules progénitrices stromales augmente avant la colonisation de la zone de la moelle osseuse cortex par des cellules hématopoïétiques. Ceci est en bon accord avec la preuve que les cellules stromales fournissent la formation d'un microenvironnement hématopoïétique. De toute évidence, la création d'microenvironnement hématopoïétique correspond à un certain niveau de régénération du tissu de stroma, et augmente le nombre de cellules hématopoïétiques lors de stroma de dilatation de pont adapté pour hématopoïèse.

Les données des auteurs montrent que le nombre de cellules progénitrices stromales dans les parties éloignées du squelette augmente immédiatement après le curetage. A partir de la sixième heure, et le vingtième jour inclus du tibia controlatéral est observée dans plus de deux fois l'augmentation des concentrations et le nombre de cellules formant des colonies de fibroblastes. Le mécanisme de ce phénomène est probablement lié au fait qu'une blessure de la moelle osseuse massif résultant en la formation d'un grand nombre de caillots de sang tout en détruisant simultanément un grand nombre de plaquettes et la libération dans le facteur de croissance dérivé des plaquettes du sang (EAHECCE), qui est connu pour provoquer la prolifération des cellules formant des colonies fibroblastes situés dans le corps en dehors de la piscine proliférative. Dans des expériences sur des lapins administration locale favorise la restauration des cellules souches mésenchymateuses du cartilage endommagé chirurgie du genou, ce qui peut être associée à la formation de chondrocytes dérivés de cellules souches mésenchymateuses introduites. Cependant, la régénération réparatrice des défauts osseux chez les rats de laboratoire est grandement améliorée par l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses enfermées dans un cadre en céramique. Par conséquent, on peut supposer que si vous ne RBOK, tout autre facteur, dérivé des cellules stromales endommagées, a un effet stimulant à distance sur la prolifération des cellules souches mésenchymateuses dans les zones intactes de la moelle osseuse et stimule leur migration dans la zone du défaut osseux du tissu de la moelle. À son tour, ce contrairement aux données de la littérature des années précédentes, ce qui indique que les cellules stromales sont responsables de la micro-environnement, à la différence des cellules hématopoïétiques ne sont pas capables de migrer et proviennent de sources locales.

Néanmoins, les résultats de l'étude Gerasimov Yu et al (2001) suggèrent que l'application d'un traumatisme mécanique entraîne non seulement une restructuration forte du tissu stromal dans les os de kyuretirovannoy, mais aussi des changements importants dans les stroma os à distance intacte, qui est, il y a une réponse systémique le tissu stromal pour un traumatisme local. Et lorsqu'il est appliqué polytraumatisé - plusieurs curetage - cette réaction est amplifiée et observée non seulement dans l'os utilisé et les parties éloignées du squelette, mais aussi dans les organes lymphoïdes, en particulier la rate. Le mécanisme d'une telle réponse systémique du tissu stromal de la moelle osseuse et de la rate au traumatisme local et au polytraumatisme reste inconnu. On suppose que ce processus est associé à l'action du facteur humoral libéré stroma mésenchymateux cavité de la moelle osseuse médullaire. Possibilité de faire des cellules stromales de moelle osseuse et la rate organonespetsificheskogo facteur humoral responsable de la prolifération des cellules, des colonies formant des fibroblastes indiquent les données au sujet de leur activité de stimulation des colonies dans des cultures monocouches de moelle osseuse.

À cet égard, il convient de noter que lors de l'administration systémique multipotentes cellules précurseurs mésenchymateuses repeupler leurs dérivés non seulement la moelle osseuse, mais aussi d'autres tissus, qui est utilisé, en particulier pour la thérapie génique. Il est montré que, après administration intraveineuse de grandes quantités de cellules souches mésenchymateuses avec le génome de souris de type sauvage avec des cellules gène du collagène mutant I donateurs remplacer jusqu'à 30% des cellules dans le tissu osseux et le cartilage du receveur, et les cellules de souris souches mésenchymateuses transfectées sécrétant de l'IL-3 humaine, pendant 9 mois soutenir efficacement l'hématopoïèse en cas de leur administration simultanée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines dans des souris immunodéficientes.

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Modification génétique des cellules souches mésenchymateuses

Succès expérimental supplémentaire de la modification génétique doit être noté transfection gène du facteur IX MSCs dans MSCs humaines suivie par le transfert de cellules TRANSFECTANTS souris immunodéficientes, ce qui conduit à l'apparition dans le sang facteur antihémophilique B pendant 8 semaines après la transplantation. Dans cette expérience, une modification post-traductionnelle du facteur IX avec la y-glutamyl carboxylase a été réalisée dans des cellules transfectées. Transduction de cellules souches mésenchymateuses avec un vecteur codant pour le facteur IX humain rétroviral, a eu moins de succès - l'introduction ultérieure de ces cellules avec le chien de l'hémophilie dans un niveau thérapeutique du facteur IX, qui prend en charge hémostatique normale de coagulation d'intensité, seulement 12 jours.

La transplantation de cellules souches mésenchymateuses dans le parenchyme cérébral des animaux a montré que les cellules immatures donneuses sont transformées à la fois dans la population des neurones et des cellules gliales. Dérivés neuronaux tissus greffe mésenchymateuses donneur sain rend théoriquement possible la correction des anomalies génétiques du métabolisme du cerveau chez les patients atteints de la maladie de Gaucher et d'autres troubles du métabolisme des lipides, des glucides ou gangliosides.

Poursuivant des conditions de recherche expérimentale transdifférenciation des cellules souches en cellules précurseurs stromales de moelle osseuse dans le tissu nerveux et le foie. L'attention des chercheurs est concentrée sur les combinaisons d'inducteurs de différenciation et de milieux de conditionnement spéciaux. En particulier, pour l'isolement de la culture primaire avec 10% de sérum de veau foetal, les cellules stromales de la moelle osseuse lavées et remises en suspension dans du milieu de culture DMEM / F12 (1/1) sont ensemencées à une densité de 200 000 / cm2. Après 24 heures, les cellules non adhérentes sont retirées et des cellules de type fibroblaste attachées au plastique sont cultivées pendant une semaine. Pour la différenciation de cellules stromales de moelle osseuse à neuroblastes utilisées milieu conditionné obtenu en cultivant la culture de trois jours de fibroblastes embryonnaires de souris primaire, ainsi que parmi DMEM / F12 (1/1) avec 2% de sérum de veau foetal et supplémenté avec 20 ng / ml ou 10-6 M LiF l'acide rétinoïque (neuro-inducteurs, qui sont utilisés pour la différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires humaines et murines). La différenciation des cellules stromales de moelle osseuse en cellules progénitrices dans les hépatocytes est induite environnement conditionné créé à la suite de trois jours, la culture d'une culture primaire de cellules de foie de souris embryonnaires dans du DMEM / F12 (1/1) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal.

Ici, il convient de noter à nouveau que les cellules formant des colonies du stroma de la moelle osseuse sont hétéromorphes et peuvent être divisées en deux types. Le premier type comprend des cellules de type fibroblaste qui forment des cellules filopodia avec de gros noyaux et un ou deux nucléoles. Le second type est représenté par de petites cellules de forme fusiforme. Dans les deux types de culture cellulaire dans le milieu conditionné obtenu sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires de souris primaire, et sur le Z-4-ème jour de cellules de culture semblent similaires à neuroblastes. A ce stade, ils ont souvent une forme fusiforme avec un ou deux longs processus se terminant par des filopodes. Les cellules pyramidales ou stellaires à dendrites courtes sont moins fréquentes. Dendrites un neuroblastes ont dilatation typique (croissance des reins) et la ramification dans sa partie distale, l'autre - avec un cône de croissance distincts filopodes, à travers laquelle se produit la croissance de dendrites. Caractéristiques morphologiques similaires (cônes de croissance du rein et une filopodia) neuroblastome inhérente, les neurones, se différencier en sont décrits en détail dans les documents par neurogenèse. Sur cette base, certains auteurs concluent que les cellules qu'ils détectent en culture sont des neuroblastes. En particulier, Schegelskaya E. Et al (2002), après une culture primaire de cellules stromales cultivées pendant deux semaines dans une remplaçable à chaque Z-et-4ème jours le milieu conditionné a constaté qu'une partie des cellules en prolifération, en conservant l'état indifférencié. Extérieurement, ces cellules ressemblaient à des fibroblastes et ont été identifiées en culture avec des neuroblastes différenciants. La plupart des cellules (environ 80%) étaient à différents stades de différenciation dans les cellules du tissu nerveux, principalement dans les neurones. Les procédés dendritiques de ces cellules en contact étroit les uns avec les autres, de sorte que, progressivement, les cellules formées sur les parties de substrat réseau de neurones sous la forme de brins longs multicellulaires. Les processus dendritiques des neuroblastes se sont développés beaucoup plus longtemps, certains d'entre eux 8-10 fois plus haut que la longueur du corps du neurone lui-même. Progressivement, la proportion de cellules pyramidales et étoilées augmente. Dendrites de cellules étoilées ramifiées. Selon les auteurs, la différenciation ultérieure des cellules pyramidales et étoilées par rapport aux cellules fusiformes correspond à la séquence des stades de la neurogenèse normale chez les animaux. En conséquence, les auteurs concluent que les cellules souches de cellules stromales de la moelle osseuse sont Exposed induites neurogenèse dans lequel procédé in vitro générés neuroblastes de trois grands types de neurones. Des prédécesseurs de cellules nerveuses ont également été détectés pendant la culture de cellules de stroma de moelle osseuse pendant 3-4 jours dans un milieu avec 2% de sérum fœtal et 20 ng / ml LIF. Mais dans ce cas les cellules souches ont été divisées très lentement, la différenciation des neuroblastes est survenue seulement dans 30% des cas et ils n'ont pas formé de réseaux neuronaux. En utilisant comme inducteurs de différenciation des cellules nerveuses acide rétinoïque, les auteurs ont obtenu dans la culture à 25-30% des cellules nerveuses avec une prédominance des cellules gliales - astrocytes et oligodendrocytes. Les neurones ne représentaient qu'un tiers de toutes les cellules nerveuses, bien qu'elles soient représentées par les trois types: cellules fusiformes, pyramidales et stellaires. Le 6ème jour de la culture de cellules stromales dans les cellules nerveuses moyennes d'acide rétinoïque est devenu plus différencié, tandis que les axones individuels de neurones pyramidaux ont été constaté que dans la formation normale semble neuroontogenesis ultérieure des processus dendritiques. Selon les auteurs, malgré le faible rendement des cellules nerveuses, la méthode d'induction de l'acide rétinoïque présente des avantages: astrocytes et oligodendrocytes et myélinisation utiliser les fonctions d'alimentation pendant la croissance des axones et dendrites et sont nécessaires pour la formation normale du tissu nerveux. Par conséquent, pour réparer ses sites endommagés in vivo, il est préférable d'utiliser une suspension de neurones enrichis en cellules gliales.

Dans la deuxième série d'expériences, les auteurs ont tenté d'induire la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse en cellules hépatiques. Après la culture de trois jours de la moelle osseuse des cellules souches stromales dans le milieu conditionné obtenu par incubation d'hépatocytes embryonnaires de souris, grandes cellules de forme sphérique ont été trouvés, souvent des inclusions de deux nucléaires, cytoplasmiques de différentes tailles. Ces cellules étaient à différents stades de différenciation et différaient par la taille, le nombre de noyaux et les inclusions dans le cytoplasme. Dans la plupart de ces cellules, le glycogène a été détecté, sur la base de laquelle les auteurs les ont identifiés comme cellules progénitrices des hépatocytes. Etant donné que la culture sans cellules ont été détectées similaires à neuroblastes, suivie d'une conclusion que dans le milieu conditionné obtenu par culture d'hépatocytes embryonnaires, il n'y a pas de facteurs de différenciation des cellules nerveuses et, inversement, il existe des facteurs qui induisent la différenciation des cellules stromales de moelle osseuse en cellules progénitrices d'hépatocytes . Les auteurs suggèrent la présence de cellules pluripotentes de stroma de moelle osseuse, car ils se différencient in vitro en cellules de tissu hépatique ou neuronal en fonction des milieux conditionnés de particuliers, et inductances.

Dans certains travaux, la différenciation des cellules du stroma de la moelle osseuse en cardiomyocytes, cartilage, os et cellules du tissu nerveux est en effet correctement représentée. Il y a des informations selon lesquelles parmi les cellules de la moelle osseuse il y a des populations de cellules souches qui peuvent se différencier en hépatocytes. À la lumière de ces résultats ci-dessus l'expérimentation chez la souris peut encore être considéré comme une autre confirmation de la présence dans la moelle osseuse des cellules souches mésenchymateuses pluripotentes ayant la capacité de se différencier en cellules de différents tissus de l'organisme adulte.

Transplantation de cellules souches mésenchymateuses

Dans la transplantation clinique des cellules souches mésenchymateuses humaines peuvent être utilisés pour l'expansion des cellules souches hématopoïétiques et leurs premiers descendants prekommitirovannyh. En particulier, l'introduction de cellules souches hématopoïétiques et les patients atteints de cancer après une chimiothérapie par MSCs haute accélère la récupération des neutrophiles et des plaquettes dans le sang périphérique. Autologue et allogénique de transplantation des cellules souches mésenchymateuses utilisés pour traiter le myélome multiple, l'anémie aplasique, la thrombocytopénie spontanée - maladies associées à un tissu de stroma hématopoïétique primaire de défauts. L'efficacité de la thérapie cellulaire dans les pathologies hématologiques dans de nombreux cas ci-dessus, alors que l'introduction de cellules souches stromales et hématopoiétiques, qui manifeste une réduction de la période de récupération post-opératoire, le sang, diminution du nombre de décès dus à la destruction non sélective des cellules cancéreuses régionales et circulant dans lequel la filière et de ses propres cellules du patient hématopoïétique progénitrices. MSCs prometteuses applications et d'autres cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes dans la pratique clinique en raison de leur relative facilité d'obtention d'aspirats de moelle osseuse, l'expansion de la culture et la transfection du gène thérapeutique. Ainsi, pour compenser les défauts des tissus locaux peuvent utiliser une implantation locale des cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes et un dysfonctionnement systémique des tissus d'origine mésenchymateuse est pas exclue de leur introduction dans la circulation générale.

Plus prudents dans leurs arguments les auteurs des œuvres où les perspectives de transplantation locale MSCS, systémique et la thérapie génique sont analysés du point de vue des cellules stromales de la biologie. La moelle osseuse postnatale est traditionnellement considérée comme un organe constitué de deux systèmes principaux de lignées cellulaires clairement exprimées - le tissu hématopoïétique actuel et le stroma de soutien associé. Par conséquent, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse étaient initialement considérées exclusivement comme une source de base stromale pour la production de facteurs régulateurs du microenvironnement hématopoïétique. Puis l'attention des chercheurs est passée à l'étude du rôle du CSM en tant que source de racine des tissus squelettiques. Les dernières données indiquent un potentiel inattendu de différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse avec la formation d'un tissu neural ou musculaire. En d'autres termes, les cellules souches mésenchymateuses présentent la plasticité transgermalnuyu - la capacité de se différencier en différents types cellulaires que les cellules des tissus phénotypiquement non originales. Cependant, certains aspects de la biologie des cellules stromales de la moelle osseuse restent peu claires et non résolues dans le plan biologique général, et en détail, y compris l'identification, la nature, l'origine et le développement et la fonction in vivo les cellules stromales de la moelle osseuse ainsi que la différenciation potentiel admissible ex vivo et la possibilité utilisation thérapeutique in vivo. Les données obtenues sur les capacités potentielles des CSM, ainsi que les résultats de la recherche sur le potentiel de régénération d'autres cellules souches, sont en contradiction flagrante avec les dogmes établis en biologie.

Lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions de faible densité, les cellules stromales de la tige de la moelle osseuse forment des colonies distinctes, dont chacune est un dérivé d'une seule cellule précurseur. Le pourcentage de précurseurs de cellules stromales dans la moelle osseuse des cellules nucléées définies par leur capacité à former des colonies dépend fortement des conditions de culture et les espèces des cellules souches mésenchymateuses appartenant. Par exemple, chez le rongeur pour obtenir la quantité maximale de cellules souches stromales est absolument nécessaire, en présence de la culture d'alimentation irradiée de cellules de la moelle osseuse et le sérum, tandis que la formation de colonies efficacité des cellules souches mésenchymateuses humaines est indépendant du dispositif d'alimentation, ou à partir du milieu de culture. Le nombre de facteurs mitogènes connus stimulant la prolifération des cellules progénitrices stromales est limité. Ceux-ci comprennent PDGF, EGF, FGF, TGF-b, et aussi IGF1. Dans des conditions optimales, la culture de lignées polyclonales MSCs maintenues in vitro pendant plus de 50 divisions cellulaires, ce qui permet de recevoir les milliards de cellules stromales de moelle osseuse à partir de 1 ml d'aspiration lui.

Cependant, la population de cellules stromales de la moelle osseuse est hétérogène, qui se manifeste comme la variabilité des tailles des colonies, taux différents de leur formation et une variété de la morphologie des cellules, qui comprend une gamme de broche de fibroblaste à grandes cellules plates. Avec le développement de telles cultures après 20 jours, l'hétérogénéité phénotypique est également notée. Certaines colonies sont fortement exprimées par la phosphatase alcaline, d'autres ne l'expriment pas du tout, et le troisième type de colonies est positif à la phosphatase dans la région centrale et négatif à la phosphatase à la périphérie. Des colonies séparées forment des nodules de tissu osseux (le début de la minéralisation de la matrice est marqué lorsqu'il est coloré au rouge d'alizarine ou sur du calcium par Van-Koss). Dans d'autres colonies, une accumulation de graisse a lieu, identifiée par coloration G avec de l'huile rouge. Moins souvent, les colonies des cellules souches mésenchymateuses forment des cartilages colorés en bleu d'alcyan.

Après la transplantation extra-utérine chez les animaux de laboratoire lignes MGK polyclonaux forment stroma osseuse extra-utérine avec setchatoobraznoy associée à myélopoïèse et adipocytes, aussi, mais rarement, avec le tissu du cartilage. Dans la transplantation de lignes monoclonal de cellules stromales de la moelle osseuse dans certains cas, un chimérisme, dans lequel le tissu osseux formé de novo est composé de cellules osseuses, les adipocytes comprend l'origine de stroma et de donneur, tandis que les lignées de cellules de système hématopoïétique et vasculaire sont dérivés du destinataire.

Les résultats de ces études confirment la nature de la tige du précurseur de la moelle osseuse stromale, à partir duquel la lignée clonale a été obtenue. Ils montrent également simultanément que tous les clones dans les cultures ne sont pas des cellules souches multipotentes. Certains chercheurs croient, et nous partageons leur avis, les informations les plus précises sur le potentiel réel de la différenciation des clones individuels ne peuvent être obtenus in vivo après la transplantation, plutôt que par la détermination du phénotype de leurs dérivés in vitro. L'expression des marqueurs phénotypiques de culture ostéo hondro- ou adipogenèse (déterminée par l'ARNm ou par des techniques histochimiques), et même la production de matrice minéralisée ne reflète pas le degré de clone unique de pluripotence in vivo. Par conséquent, l'identification des cellules souches dans le groupe de cellules stromales n'est possible que postérieurement, dans les conditions appropriées d'un test de transplantation biologique. En particulier, la chondrogenèse très rarement observés dans les greffes systèmes ouverts, alors que la formation du cartilage est pas rare dans des systèmes fermés tels que des chambres de diffusion ou dans des cultures mikromassnyh de cellules stromales in vitro, dans lequel atteint localement faible tension en oxygène, contribuent à la formation du cartilage. Par conséquent, même la technique de transplantation, ainsi que les conditions de culture in vitro non spécifiques, affectent significativement la gamme de différenciation MSC.

La transplantation expérimentale avec l'observance de conditions expérimentales données est la norme d'or pour déterminer le potentiel de différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et l'élément clé de leur identification correcte. Historiquement, les études de transplantation de moelle osseuse stromale de moelle osseuse sont associées à un problème commun de transplantation de moelle osseuse. Il a été établi que le microenvironnement hématopoïétique est créé par la transplantation de cellules stromales de la moelle osseuse et assure le développement ectopique du tissu hématopoïétique dans la zone de transplantation. L'origine du microenvironnement du donneur, et le tissu hématopoïétique - de l'hôte nous permet de traiter l'os ectopique comme une véritable greffe de moelle osseuse «inversée». La transplantation locale de cellules stromales de la moelle osseuse favorise une correction efficace des défauts osseux, plus prononcée que dans la régénération réparatrice spontanée. Dans plusieurs études précliniques dans des modèles animaux prouvé de façon convaincante la possibilité de greffes de cellules stromales de la moelle osseuse en orthopédie, bien que pour optimiser ces méthodes, même dans les cas les plus simples, exigent le travail le plus grand soin et l'analyse. En particulier, les conditions optimales pour l'expansion des cellules stromales ostéogéniques ex vivo n'ont pas encore été établies, la structure et la composition du vecteur idéal restent inutilisées, ainsi que le nombre de cellules nécessaires à la régénération osseuse en masse.

En plus d'appliquer propagées ex vivo des cellules stromales de moelle osseuse pour la régénération des tissus d'origine mésenchymateuse peu orthodoxe ductilité MSC ouvre l'utilisation potentielle pour la régénération des cellules nerveuses, ou la fourniture de produits de gène dans le SNC. En principe, cela simplifie la thérapie cellulaire dans la défaite du système nerveux, car il n'est pas nécessaire d'obtenir des cellules souches neurales autologues de l'homme. Il est rapporté sur les possibilités d'utiliser des cellules de moelle osseuse pour la génération de cardiomyocytes et de cellules myogéniques précurseurs comme une véritable origine stromale et extrinsèque.

Des expériences sont en cours sur la transplantation systémique de cellules stromales de la moelle osseuse pour le traitement de maladies squelettiques communes. Nul doute que les cellules stromales de la moelle osseuse sont une population responsable de troubles génétiques dans les maladies du squelette, ce qui est bien illustré par le transfert de vecteur en utilisant l'information génétique des cellules, ce qui conduit à la formation de tissu osseux pathologique chez les animaux expérimentaux. Cependant, la capacité des cellules stromales à s'implanter, croître, se multiplier et se différencier dans les os du squelette après l'introduction dans la circulation sanguine générale n'a pas encore été prouvée.

Cela est dû en partie au fait que la procédure standard de stroma de moelle osseuse ne sont pas transplanté avec le tissu hématopoïétique, des critères si stricts pour évaluer l'administration de prise de greffe réussie systémique cellules stromales doivent encore être mis au point. Il faut se rappeler que la présence de gènes marqueurs dans les extraits tissulaires ou l'isolement dans la culture des cellules d'origine donneuse n'indique pas la prise de greffe de cellules, mais seulement leur survie. Même l'injection intra-artérielle des cellules stromales de la moelle osseuse dans le membre de la souris peut conduire à pratiquement nul résultat la prise de greffe, en dépit du fait que les cellules provenant de donneurs se trouvent en grand nombre au sein du réseau de moelle osseuse microvasculaire. Malheureusement, de telles cellules sont habituellement décrites comme "greffées" uniquement sur la base des résultats de la détermination des gènes donneurs de marqueurs dans des conditions de culture ex vivo. En outre, il est nécessaire de fournir des preuves convaincantes de l'intégration à long terme dans les tissus de cellules différenciées et fonctionnellement actives d'origine donneuse. Dans de nombreux travaux publiés, où il est rapporté sur la prise de greffe de cellules stromales de la moelle osseuse dans le squelette, le manque de données claires de ce type est frappante. Néanmoins, il convient de noter que dans certaines expériences correctes sur les animaux, cependant, une greffe limitée mais réelle des cellules progénitrices stromales après leur administration systémique a été établie.

Ces données sont en accord avec les résultats de l'étude de la possibilité de délivrer des cellules myogéniques précurseurs de la moelle osseuse aux muscles à travers le système vasculaire. Cependant, il ne faut pas oublier que les tissus squelettiques et musculaires se forment au cours du développement et de la croissance sur la base de mouvements cellulaires extravasculaires qui utilisent des processus de migration n'impliquant pas de circulation dans le sang. S'il existe réellement une voie circulatoire indépendante pour la livraison des cellules précurseurs aux tissus en phase solide, est-il possible de permettre l'existence de cellules progénitrices mésenchymateuses circulant physiologiquement? Quelle est l'origine de ces cellules dans les organismes en développement et postnatal, et comment pénètrent-elles la paroi vasculaire? La solution de ces problèmes est absolument nécessaire et nécessite l'analyse préclinique la plus complète. Même après avoir trouvé les réponses à ces questions, les aspects cinétiques problématiques associés à la croissance squelettique et au remodelage du tissu conjonctif demeurent non résolus. Dans le même temps, le traitement des troubles de l'ostéogenèse en remplaçant toute la population de cellules progénitrices squelettiques mutées par des cellules stromales saines semble être une perspective clinique réelle. Dans ce cas, les zones locales de fracture ou de déformation dues à l'ostéogenèse pathologique, ainsi que les modifications destructives du tissu osseux, peuvent être corrigées par des cellules souches stromales cultivées in vitro. Par conséquent, la direction de la recherche future devrait être axée sur les problèmes de transformation ou de la correction génétique des cellules progénitrices ostéogéniques mutées autologues ex vivo.

Le génie génétique des cellules, à court terme ou permanent, est devenu la base de la biologie cellulaire et moléculaire, source de nombreuses découvertes scientifiques concernant le rôle des protéines individuelles dans le métabolisme cellulaire in vitro et in vivo. L'utilisation de techniques moléculaires pour corriger les maladies héréditaires et des maladies humaines est très prometteuse pour la médecine pratique, étant donné que les propriétés des cellules souches de moelle osseuse stromales ont permis de développer la transplantation de circuits uniques pour la correction de maladies génétiques du squelette. Dans ce cas, les cellules progénitrices mésenchymateuses peuvent être facilement obtenues à partir du futur receveur, elles sont sujettes à une manipulation génétique et sont capables de se multiplier en grand nombre sur une courte période de temps. L'utilisation de cellules souches mésenchymateuses évite les limitations et les risques associés à la distribution de matériel d'information génétique directement au patient par le biais de structures vectrices vectrices. Une telle stratégie est applicable aux cellules souches embryonnaires, cependant les cellules stromales de moelle osseuse postnatale autologues sont le matériau préféré, car leur administration exclut d'éventuelles complications immunologiques post-transplantation. Afin d'obtenir un effet à court terme, par exemple afin d'accélérer la régénération osseuse, la méthode optimale est la modification génétique des cellules souches mésenchymateuses en utilisant elektroporatsrsh, fusion chimique, lipofection, des plasmides et des constructions adénoviraux. En particulier, la transfection virale dans les cellules BMP-2 stromales de la moelle osseuse était efficace pour accélérer la régénération des os dans le polytraumatisme expérimental. La création de structures de vecteurs adénoviraux est préférable en raison de l'absence de toxicité. Cependant, la modification génétique des cellules stromales de la moelle osseuse dans ce cas est caractérisée par une stabilité extrêmement faible. De plus, les cellules stromales de la moelle osseuse transformées normales nécessitent l'utilisation de vecteurs porteurs d'informations génétiques 10 fois plus infectieuses que les autres types de cellules, ce qui augmente significativement le pourcentage de mort des cellules transfectées.

Pour le traitement des maladies récessives causées par une activité faible ou biologique zéro de certains gènes nécessaires de modification prolongée ou permanente des cellules souches mésenchymateuses, qui nécessite l'utilisation de virus adéno-associés, et rétrovirus, les lentivirus Chimère adéno-rétroviraux. Les sites de transport de ces virus sont capables de transporter de grands transects d'ADN (jusqu'à 8 kb). La littérature scientifique est déjà apparu informations sur l'activité biologique des cellules stromales exogènes de la moelle osseuse transfectées avec des constructions rétrovirales codant pour la synthèse de molécules de régulation, et les marqueurs - IL-3, CD2, le facteur VIII, et les enzymes impliquées dans la synthèse de la L-DOPA. Mais dans ces travaux, les auteurs soulignent un certain nombre de limites qui doivent être surmontées avant que l'application pratique de cette technologie ne commence. Le premier problème est d'optimiser le processus de modification ex vivo de MCK. On sait qu'une prolifération prolongée (3-4 semaines) de cellules stromales de moelle osseuse in vitro réduit leur transfection. Dans le même temps, plusieurs cycles de transfusion sont nécessaires pour atteindre un niveau élevé de modification génétique des CSM. Le second problème est lié à la durée d'expression du gène thérapeutique, qui ne dépasse pas encore quatre mois. Une diminution naturelle de l'expression génique efficace est due à l'inactivation des promoteurs et à la mort des cellules modifiées. Dans les perspectives générales de transfert de l'information génétique en utilisant des cellules souches mésenchymateuses résultats des études préliminaires indiquent la nécessité d'une optimisation plus poussée des méthodes de transfection ex vivo, la sélection d'un promoteur adéquat de régulation de l'activité biologique dans la bonne direction, et d'améliorer la capacité des cellules stromales de la moelle osseuse modifiées autorenouvellement in vivo après transplantation. Il convient de noter que l'utilisation de modèles rétroviraux pour modifier les cellules stromales de la moelle osseuse dans la bonne direction ne nécessite pas toujours leur prise obligatoire. Les cellules souches mésenchymateuses transfectées peuvent effectuer une fonction corrective sur fond de résidence stable et sans incorporation physique active et fonctionnement dans le tissu conjonctif. Dans ce cas, ils doivent être considérés comme une mini-pompe biologique produisant un facteur in vivo dont le déficit détermine la manifestation de la pathologie génétique.

L'utilisation de cellules stromales de moelle osseuse transformées pour le traitement d'une maladie génétique dominante qui se caractérise par l'expression du gène ou de l'activité biologique pathologique anormal, est beaucoup plus problématique car dans ce cas il est nécessaire de bloquer le transfert ou la vente de l'information génétique déformée. L'une des méthodes de génie génétique est la recombinaison homologue des cellules souches embryonnaires afin de créer des animaux transgéniques. Cependant, le niveau extrêmement faible de recombinaison homologue, combinée avec les problèmes d'identification, la séparation et l'expansion de ces recombinés est peu susceptible de promouvoir l'utilisation généralisée de cette technique dans un proche avenir, même si le développement de nouvelles méthodes technologiques. La seconde approche pour la thérapie génique est basée sur la pathologie dominante correction automatique de l'ADN endommagé par des mutations génétiques peuvent être corrigées par l'introduction de l'ADN exogène avec la séquence désirée (oligonucleotides courts d'ADN, ou des oligonucleotides d'ARN / ADN chimériques) qui se lient à des homologues dans le génome endommagé. Le troisième mode de réalisation fournit verrouillage de transmission d'informations pathologique qui est réalisé par l'utilisation d'oligonucléotides conçus spécifiquement qui se lient à un gène particulier pour former la structure hélicoïdale ternaire, ce qui exclut la possibilité de transcription.

Bien que la correction de maladies génétiques au niveau du génome est procédé thérapeutique optimal et préféré, l'ARNm est également un vecteur prometteur (peut-être encore plus accessible) pour bloquer un gène dominant négatif. Afin d'inhiber la traduction et / ou augmenter la dégradation de l'ARNm ont longtemps été utilisés avec des molécules de protéines des séquences d'oligonucléotides antisens ou blocage complet de liaison de l'ARNm appareil biosynthétique de la cellule. En outre, l'ARN double brin induit une dégradation rapide de l'ARNm, dont le mécanisme reste incertain. Cependant, il est peu probable que la simple suppression de l'ARNm transcrit à partir d'un allèle mutant à des mutations courtes ou simples favorisera l'expression de l'ARNm de l'allèle normal. Une alternative est l'utilisation ribozinov et en épingle à cheveux hammerhead, ont la capacité de se lier à des sites très spécifiques de l'ARNm avec l'induction ultérieure de leur clivage et l'inactivation lors de la traduction. Actuellement, la possibilité d'utiliser cette méthode dans le traitement de l'ostéogenèse pathologique est à l'étude. Peu importe ce qui est exactement la cible - éléments génomiques ou cytoplasmiques succès de la nouvelle technologie de thérapie génique sera déterminé par l'efficacité de l'inclusion des réactifs dans les cellules stromales de la moelle osseuse ex vivo, le choix optimal d'un vecteur particulier et la capacité stable de cellules souches mésenchymateuses exprimant les facteurs souhaités in vivo.

Ainsi, la découverte de cellules souches mésenchymateuses avec leurs propriétés inattendues crée un nouveau schéma conceptuel pour le développement des lignées cellulaires. Mais pour comprendre le rôle biologique des cellules souches stromales, de leur nature, la capacité de transdifférenciation ou dédifférenciation, leur importance physiologique dans le processus de développement embryonnaire, la croissance post-natale, la maturation et le vieillissement, ainsi que dans les maladies humaines nécessitent des recherches interdisciplinaires.