Cellules souches mésenchymateuses

Parmi les cellules souches régionales, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) occupent une place particulière, leurs dérivés constituant la matrice stromale de tous les organes et tissus du corps humain. La recherche sur les CSM est prioritaire pour les représentants de la biologie russe.

Au milieu du siècle dernier, une culture homogène de cellules souches stromales multipotentes de moelle osseuse a été isolée pour la première fois dans le laboratoire d'A. Friedenstein. Les cellules souches mésenchymateuses fixées au substrat ont maintenu une intensité de prolifération élevée pendant longtemps et, dans les cultures à faible densité d'ensemencement après fixation sur le substrat, elles ont formé des clones de cellules de type fibroblaste sans activité phagocytaire. L'arrêt de la prolifération des CSM a mis fin à leur différenciation spontanée in vitro en cellules osseuses, adipeuses, cartilagineuses, musculaires ou conjonctives. D'autres études ont permis d'établir le potentiel ostéogénique des cellules de type fibroblaste du stroma médullaire de diverses espèces de mammifères, ainsi que leur activité de formation de colonies. Des expériences in vivo ont montré que la transplantation hétérotopique et orthotopique de cellules de type fibroblaste formant des colonies entraîne la formation de tissu osseux, cartilagineux, fibreux et adipeux. Les cellules souches stromales de la moelle osseuse étant caractérisées par une grande capacité d’auto-renouvellement et de différenciation multiforme au sein d’une même lignée cellulaire, elles sont appelées cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes.

Il est à noter qu’au cours de plus de 45 années de recherche fondamentale sur les cellules souches mésenchymateuses, des conditions réelles ont été créées pour l’utilisation de leurs dérivés en pratique clinique.

Aujourd'hui, il ne fait aucun doute que tous les tissus du corps humain se forment à partir de cellules souches issues de diverses lignées cellulaires, résultant de processus de prolifération, de migration, de différenciation et de maturation. Cependant, jusqu'à récemment, on pensait que les cellules souches d'un organisme adulte étaient tissu-spécifiques, c'est-à-dire capables de produire des lignées de cellules spécialisées uniquement dans les tissus où elles se trouvent. Cette théorie a été réfutée par la transformation des cellules souches hématopoïétiques non seulement en éléments cellulaires du sang périphérique, mais aussi en cellules ovales du foie. De plus, les cellules souches neurales se sont révélées capables de donner naissance à des neurones et des éléments gliaux, ainsi qu'à des lignées précoces de cellules progénitrices hématopoïétiques. De leur côté, les cellules souches mésenchymateuses, qui produisent généralement des éléments cellulaires des os, du cartilage et du tissu adipeux, sont capables de se transformer en cellules souches neurales. On suppose qu'au cours du processus de croissance, de régénération physiologique et réparatrice des tissus, des cellules progénitrices non engagées sont générées à partir de réserves souches non tissu-spécifiques. Par exemple, la réparation du tissu musculaire peut être réalisée grâce à la migration des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse vers les muscles squelettiques.

Bien que cette interchangeabilité croisée des cellules souches ne soit pas reconnue par tous les chercheurs, la possibilité d'une utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses comme source de transplantation cellulaire et vecteur cellulaire d'information génétique n'est plus contestée, tout comme la multipotence des cellules souches stromales de moelle osseuse, qui peuvent être relativement facilement isolées et multipliées en culture in vitro. Parallèlement, des rapports sur la pluripotence potentielle des cellules souches stromales de moelle osseuse continuent de paraître dans la littérature scientifique. À titre de preuve, des protocoles de recherche sont cités dans lesquels, sous l'influence d'inducteurs de transdifférenciation spécifiques, les CSM se transforment en cellules nerveuses, cardiomyocytes et hépatocytes. Cependant, certains scientifiques émettent de sérieux doutes quant à la possibilité d'une activation et d'une expression répétées de gènes dès le début de l'embryogenèse. Parallèlement, chacun comprend que si les conditions permettant d'étendre la multipotence des cellules souches mésenchymateuses à la pluripotence des CSE sont réunies, de nombreux problèmes éthiques, moraux, religieux et juridiques liés à la médecine plastique régénérative seront automatiquement résolus. De plus, comme dans ce cas, la source du potentiel régénérateur de la cellule souche devient les cellules stromales autologues du patient, le problème du rejet immunitaire de la greffe cellulaire est également résolu. L'avenir proche démontrera le réalisme de ces perspectives.

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Utilisation des cellules souches mésenchymateuses en médecine

En clinique, l'utilisation de dérivés de cellules souches mésenchymateuses est principalement associée à la restauration des lésions tissulaires associées aux lésions cutanées thermiques étendues et profondes. Au stade préclinique, une évaluation expérimentale de la faisabilité de l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de type fibroblaste pour le traitement des brûlures profondes a été réalisée. Il a été démontré que les cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste de moelle osseuse forment une monocouche en culture, ce qui permet leur transplantation pour optimiser les processus de régénération des brûlures profondes. Les auteurs soulignent que les fibroblastes embryonnaires présentent des propriétés similaires, mais que leur utilisation clinique est limitée par des problèmes éthiques et juridiques existants. Une brûlure thermique profonde avec atteinte de toutes les couches cutanées a été modélisée sur des rats Wistar. La zone brûlée représentait 18 à 20 % de la surface cutanée totale. Le premier groupe expérimental comprenait des rats présentant une brûlure thermique profonde et ayant reçu une greffe de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de type fibroblaste. Le second groupe était composé d'animaux présentant une brûlure thermique profonde et ayant reçu une greffe de fibroblastes embryonnaires allogéniques. Le troisième groupe était constitué de rats témoins présentant une brûlure thermique profonde, n'ayant pas subi de thérapie cellulaire. Une suspension de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste et de fibroblastes embryonnaires a été appliquée à la surface de la brûlure à l'aide d'une pipette, à raison de 2 x 10 ^4.cellules le deuxième jour après le modelage de la brûlure et l'excision de la croûte nécrotique résultante. Après la transplantation cellulaire, la surface de la brûlure a été recouverte d'une compresse de gaze humidifiée avec une solution isotonique de chlorure de sodium avec de la gentamicine. Des cellules de moelle osseuse ont été collectées pour obtenir des CSM, puis induites dans une lignée de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste à partir de fémurs de rats Wistar adultes. Des fibroblastes embryonnaires ont été obtenus à partir de poumons d'embryons âgés de 14 à 17 jours. Les fibroblastes embryonnaires et les cellules de moelle osseuse pour l'obtention de CSM ont été préalablement cultivés dans des boîtes de Petri à une température de 37 °C dans un incubateur à CO2, dans une atmosphère à 5 % de CO2 et à 95 % d'humidité. Les fibroblastes embryonnaires ont été cultivés pendant 4 à 6 jours, tandis que la formation d'une monocouche de CSM a nécessité de 14 à 17 jours. Par la suite, les CSM ont été cryoconservées comme matériau source pour les cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste, obtenues par décongélation et culture des CSM pendant 4 jours. Le nombre de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste formées était plus de 3 fois supérieur au nombre de fibroblastes embryonnaires formés pendant la même période de culture. Pour identifier les cellules transplantées dans les plaies de brûlure au stade de la culture, leur génome a été marqué à l'aide d'un vecteur navette viral basé sur l'adénovirus recombinant de type V porteur du gène 1ac-2 codant pour la ß-galactosidase d'E. coli. Les cellules vivantes à différents moments après la transplantation ont été détectées par immunohistochimie dans des cryosections avec ajout de substrat X-Gal, ce qui donne une coloration bleu-vert caractéristique. Suite à une évaluation visuelle, planimétrique et histologique dynamique de l'état de la plaie de brûlure, il a été établi que dès le 3e jour après la transplantation cellulaire, des différences significatives dans l'évolution du processus de cicatrisation apparaissent dans les groupes sélectionnés. Cette différence est devenue particulièrement nette au 7e jour après la transplantation cellulaire. Chez les animaux du premier groupe, transplantés de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste, la plaie a pris une couleur rose intense et uniforme, du tissu de granulation s'est développé sur toute sa surface jusqu'au niveau de l'épiderme et la surface de la brûlure a significativement diminué. Le film de collagène formé à la surface de la plaie s'est légèrement aminci, mais a continué à recouvrir toute la zone brûlée. Chez les animaux du deuxième groupe, transplantés de fibroblastes embryonnaires, le tissu de granulation a atteint le niveau de l'épiderme des bords de la plaie, mais seulement par endroits, tandis que la plasmorrhée de la plaie était plus intense que dans le premier groupe et le film de collagène initialement formé a pratiquement disparu. Chez les animaux n'ayant pas reçu de thérapie cellulaire, au 7e jour, la plaie était pâle, piquée et nécrotique, recouverte de fibrine. Une plasmorée a été observée sur toute la surface brûlée. Histologiquement, les animaux des 1er et 2ème groupes ont montré une diminution de l'infiltration cellulaire et du développement du réseau vasculaire,Français et ces signes du processus de régénération naissant étaient plus prononcés chez les rats du premier groupe. Dans le groupe témoin, des signes d'infiltration cellulaire de la plaie ont été observés, le profil histologique des vaisseaux néoformés était absent. Du 15e au 30e jour d'observation, la surface de la brûlure chez les animaux du premier groupe était significativement plus petite que chez les rats des autres groupes, et la surface de granulation était plus développée. Chez les animaux du deuxième groupe, la surface de la brûlure a également diminué par rapport à la taille des plaies de brûlure chez les rats du groupe témoin, ce qui s'est produit en raison de l'épithélialisation marginale. Dans le groupe témoin, la surface de la brûlure est restée pâle par endroits avec des granulations rares, des astérisques vasculaires sont apparus dessus, il y avait des îlots de plaque fibrineuse, une plasmorrhée modérée a persisté sur toute la surface de la brûlure, et une croûte difficile à séparer est restée à certains endroits. En général, chez les animaux du 3ème groupe, la taille de la plaie a également diminué, mais les bords de la plaie sont restés minés.

Ainsi, lors d'une étude comparative du taux de cicatrisation des plaies avec des cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste et des fibroblastes embryonnaires, ainsi qu'en l'absence de thérapie cellulaire, une accélération du taux de cicatrisation de la surface brûlée a été constatée suite à la transplantation de ces deux types de cellules. Cependant, avec l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de type fibroblaste, le taux de cicatrisation était supérieur à celui obtenu avec la transplantation de fibroblastes embryonnaires. Cela s'est traduit par une accélération du changement de phase du processus de régénération: l'infiltration cellulaire a diminué, le taux de croissance du réseau vasculaire a augmenté et la formation de tissu de granulation s'est accélérée.

Les résultats de la planimétrie dynamique indiquent que le taux de cicatrisation spontanée des brûlures (sans thérapie cellulaire) était le plus faible. Aux 15e et 30e jours suivant la transplantation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques de type fibroblaste, le taux de cicatrisation était plus élevé qu'avec la transplantation de fibroblastes embryonnaires. La méthode histochimique de détection de la bêta-galactosidase a montré qu'après transplantation de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste et de fibroblastes embryonnaires, les cellules transplantées restent viables à la surface et en profondeur des plaies en régénération pendant toute la période d'observation. Les auteurs pensent que le taux plus élevé de régénération des brûlures avec l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste est dû à la libération de facteurs de croissance biologiquement actifs par ces cellules pendant le processus de maturation.

La transplantation de kératinocytes et de fibroblastes allogéniques auto- ou allogéniques pour le traitement des brûlures est également utilisée en pratique clinique. Il convient de noter que le traitement chirurgical des enfants présentant des brûlures profondes et étendues est complexe en raison de son caractère traumatique élevé, des multiples interventions chirurgicales, des pertes sanguines importantes et des diverses réactions aux milieux de perfusion utilisés. Les principales difficultés rencontrées lors de la chirurgie plastique cutanée pour les brûlures profondes et étendues, dont la surface dépasse 40 % de la surface corporelle, sont liées à la gravité de l'état des victimes et au manque de peau donneuse. L'utilisation de greffes de filets à fort coefficient de perforation ne résout pas le problème, car les cellules formées après la perforation s'épithélialisent très lentement et les lambeaux cutanés eux-mêmes se lysent ou se dessèchent souvent. Les pansements des brûlures tels que le xénoskin, les allogreffes cadavériques et les films synthétiques ne sont pas toujours efficaces. C'est pourquoi de nouvelles méthodes de recouvrement des surfaces brûlées par des couches de kératinocytes et de fibroblastes cultivés sont en cours de développement. Français En particulier, une méthode de recouvrement des surfaces brûlées à l'aide d'allofibroblastes cultivés a été proposée. Ces allofibroblastes, une fois transplantés, ont un effet stimulant prononcé sur la prolifération des épidermocytes conservés dans la plaie chez les brûlures limites, ainsi que des kératinocytes dans les septa des greffes de filet. Les travaux de L. Budkevich et co-auteurs (2000) présentent les résultats de l'utilisation de cette méthode pour le traitement des brûlures chez les enfants. L'étude a porté sur 31 enfants atteints de traumatisme thermique, âgés de 1 à 14 ans. Chez trois enfants, la surface totale des brûlures de grades IIIA-B - IV était de 40 %, chez 25 de 50 à 70 %, chez trois autres de 71 à 85 % de la surface corporelle. Une nécrectomie chirurgicale précoce a été associée à une transplantation d'allofibroblastes cultivés et à une autodermoplastie. Français La première étape du traitement impliquait l'excision des tissus nécrotiques, la deuxième étape impliquait la transplantation d'allofibroblastes en culture sur des films porteurs, et la troisième étape (48 heures après la transplantation d'allofibroblastes en culture) impliquait le retrait de la matrice et une autodermoplastie avec des lambeaux cutanés avec un rapport de perforation de 1:4. Trois patients admis à la clinique avec une maladie grave de brûlure ont eu des allofibroblastes en culture transplantés sur des plaies granuleuses. La transplantation d'allofibroblastes en culture a été réalisée une fois chez 18 enfants, deux fois chez 11 enfants et trois fois chez deux patients. La surface de la plaie recouverte de culture cellulaire variait de 30 à 3500 cm². L'efficacité des allofibroblastes en culture a été évaluée par le pourcentage global de greffe cutanée, les délais de cicatrisation des brûlures et le nombre de décès par traumatisme thermique grave. La greffe était complète chez 86 % des patients. Une non-greffe partielle de greffes cutanées a été notée dans 14 % des cas. Malgré le traitement, six enfants (19,3 %) sont décédés. La surface totale des lésions cutanées chez ces enfants variait de 40 à 70 % de la surface corporelle.La transplantation d'allofibroblastes cultivés n'a été associée à aucune mortalité due aux brûlures chez aucun patient.

Français En analysant les résultats du traitement, les auteurs notent que les lésions cutanées thermiques profondes couvrant 35 à 40 % de la surface corporelle étaient auparavant considérées comme incompatibles avec la vie (pour les jeunes enfants – jusqu'à 3 ans – les brûlures profondes couvrant 30 % de la surface corporelle sont critiques, pour les enfants plus âgés – plus de 40 % de la surface corporelle). Lors de la réalisation d'une nécrectomie chirurgicale avec transplantation d'allofibroblastes en culture et d'une autodermoplastie ultérieure avec des lambeaux cutanés à coefficient de perforation élevé, les brûlures de degré IIIB à IV restent critiques, mais à l'heure actuelle, il existe des perspectives de sauver la vie même de telles victimes dans de nombreux cas. La nécrectomie chirurgicale associée à la transplantation d'allofibroblastes en culture et à l'autodermoplastie chez les enfants atteints de brûlures profondes s'est avérée particulièrement efficace chez les patients présentant des lésions cutanées étendues avec une pénurie de sites donneurs. Les tactiques chirurgicales actives et la transplantation d'allofibroblastes cultivés contribuent à une stabilisation rapide de l'état général de ces patients, à une diminution du nombre de complications infectieuses liées aux brûlures, à la création de conditions favorables à la prise de greffes, à une réduction du temps de restauration de la peau perdue et de la durée d'hospitalisation, ainsi qu'à une diminution de la fréquence des décès chez les victimes de brûlures étendues. Ainsi, la transplantation d'allofibroblastes cultivés, suivie d'une autodermoplastie avec lambeaux cutanés, permet la guérison d'enfants gravement brûlés, auparavant considérés comme condamnés.

Il est généralement admis que l'objectif principal du traitement des brûlures est la restauration la plus complète et la plus rapide possible de la peau lésée afin de prévenir les effets toxiques, les complications infectieuses et la déshydratation. Les résultats de l'utilisation de cellules en culture dépendent en grande partie de l'aptitude de la plaie à la transplantation. Après une nécrectomie chirurgicale, la greffe de kératinocytes en culture sur la plaie permet de récupérer en moyenne 55 % (par zone) des cellules transplantées, tandis qu'en cas de plaies granuleuses, ce taux tombe à 15 %. Par conséquent, le succès du traitement des brûlures cutanées profondes et étendues nécessite avant tout une intervention chirurgicale active. En cas de brûlures de degré IIIB à IV, la surface brûlée est immédiatement débarrassée des tissus nécrotiques afin de réduire l'intoxication et le nombre de complications. L'utilisation de telles techniques est essentielle pour réduire le délai entre la brûlure et la cicatrisation, ainsi que la durée d'hospitalisation des patients atteints de brûlures étendues, et pour réduire significativement le nombre d'issues fatales.

Les premiers rapports sur l'utilisation réussie de kératinocytes cultivés pour recouvrir les surfaces brûlées sont apparus au début des années 1980. Par la suite, cette manipulation a été réalisée à partir de couches de kératinocytes cultivés, le plus souvent obtenues à partir d'autocellules, beaucoup moins souvent à partir d'allokératinocytes. Cependant, la technologie d'autokératinocytoplastie ne permet pas la création d'une banque cellulaire, et le temps nécessaire à la production d'une greffe de kératinocytes d'une surface suffisante est long, atteignant 3 à 4 semaines. Durant cette période, le risque de développer des complications infectieuses et autres complications liées aux brûlures augmente fortement, ce qui prolonge considérablement la durée totale d'hospitalisation des patients. De plus, les autokératinocytes ne prennent pratiquement pas racine lorsqu'ils sont transplantés sur des brûlures granuleuses, et le coût élevé des milieux de croissance spéciaux et des stimulateurs biologiquement actifs de la croissance des kératinocytes limite considérablement leur utilisation clinique. D'autres méthodes biotechnologiques, telles que la collagénoplastie, la transplantation de xénoskin cryoconservé et l'utilisation de divers revêtements biopolymères, augmentent l'efficacité du traitement des brûlures superficielles étendues, mais non profondes. La méthode de recouvrement de la surface de la plaie par des fibroblastes cultivés est fondamentalement différente: ce sont les fibroblastes, plutôt que les kératinocytes, qui sont utilisés comme composant principal de la couche cellulaire cultivée.

Le développement de cette méthode reposait sur l'hypothèse que les péricytes entourant les petits vaisseaux sont des cellules mésenchymateuses progénitrices capables de se transformer en fibroblastes, producteurs de nombreux facteurs de croissance et garants de la cicatrisation grâce à un puissant effet stimulant sur la prolifération et l'adhésion des kératinocytes. L'utilisation de fibroblastes cultivés pour refermer les plaies a immédiatement révélé plusieurs avantages significatifs de cette méthode par rapport à l'utilisation de kératinocytes cultivés. En particulier, l'obtention de fibroblastes en culture ne nécessite pas de milieux nutritifs ni de stimulants de croissance spécifiques, ce qui réduit le coût de la greffe de plus de dix fois celui des kératinocytes. Les fibroblastes sont facilement passivés, ce qui leur permet de perdre partiellement les antigènes d'histocompatibilité de surface, ce qui ouvre la possibilité d'utiliser des cellules allogéniques pour la fabrication de greffes et la création de leurs banques. Le délai d'obtention de greffes prêtes à l'emploi en clinique est réduit de 3 semaines (pour les kératinocytes) à 1 à 2 jours (pour les fibroblastes). Une culture primaire de fibroblastes peut être obtenue en cultivant des cellules à partir de fragments de peau prélevés lors d'une autodermoplastie, et la densité d'ensemencement cellulaire pour obtenir des sous-cultures de fibroblastes humains est de seulement 20 x 10 ³ par cm ².

Afin d'étudier l'effet des fibroblastes et de leurs protéines régulatrices sur la prolifération et la différenciation des kératinocytes, une analyse comparative de la morphologie et de la prolifération des kératinocytes sur des substrats de collagène de types I et III, ainsi que sur la fibronectine dans une culture conjointe avec des fibroblastes humains a été réalisée. Les kératinocytes humains ont été isolés de fragments de peau de patients brûlés, prélevés lors d'une autodermoplastie. La densité d'ensemencement des kératinocytes était de 50 x 103 cellules par cm². L'efficacité clinique de la transplantation de fibroblastes en culture a été évaluée chez 517 patients. Tous les patients ont été divisés en deux groupes: Groupe 1 - victimes adultes présentant des brûlures de degrés IIA, B à IV; Groupe 2 - enfants présentant des brûlures profondes de degrés IIIB à IV. L'évaluation de la dynamique de l'organisation structurale et fonctionnelle des fibroblastes en culture monocouche, prenant en compte le rôle des glycosaminoglycanes, de la fibronectine et du collagène dans les processus de régénération, a permis aux auteurs de déterminer le 3e jour comme la période la plus favorable à l'utilisation des cultures de fibroblastes pour la réalisation de greffes. Une étude de l'effet des fibroblastes sur la prolifération et la différenciation des kératinocytes a montré qu'in vitro, les fibroblastes exercent un effet stimulant prononcé, principalement sur les processus d'adhésion des kératinocytes, multipliant par plus de 2 le nombre de cellules attachées et leur taux de fixation. La stimulation des processus d'adhésion s'accompagne d'une augmentation de l'intensité de la synthèse d'ADN et du niveau de prolifération des kératinocytes. De plus, il s'est avéré que la présence de fibroblastes et de la matrice extracellulaire qu'ils forment est une condition nécessaire à la formation de l'appareil tonofibrillaire des kératinocytes, des connexions intercellulaires et, in fine, à la différenciation des kératinocytes et à la formation de la membrane basale. Dans le traitement des enfants atteints de brûlures profondes, la transplantation de cultures d'allofibroblastes a démontré une efficacité clinique élevée, notamment chez les patients présentant des lésions cutanées étendues et présentant une déficience du site donneur. Une étude morphofonctionnelle approfondie a montré que les fibroblastes transplantés se caractérisent par une synthèse active d'ADN, de collagène, de fibronectine et de glycosaminoglycanes, qui font partie de la matrice extracellulaire formée par les cellules. Les auteurs soulignent un taux élevé de prise de greffe de fibroblastes transplantés (jusqu'à 96 %), une forte réduction du délai de réception (en 24 à 48 heures au lieu de 2 à 3 semaines avec les kératinocytes), une accélération significative de l'épithélialisation de la surface brûlée, ainsi qu'une réduction significative (dix fois) du coût de la technologie de culture d'un transplant à partir de fibroblastes par rapport à la transplantation de kératinocytes. L'utilisation de la transplantation d'allofibroblastes cultivés permet de sauver la vie d'enfants souffrant de brûlures graves - lésions thermiques sur plus de 50 % de la surface corporelle,Ce qui était auparavant considéré comme incompatible avec la vie. Il convient de noter que la transplantation de fibroblastes embryonnaires allogéniques a permis non seulement d'accélérer la régénération des plaies et la convalescence des patients présentant des degrés et des zones de brûlures variables, mais aussi de réduire significativement leur mortalité.

Les fibroblastes autologues sont également utilisés dans un domaine complexe de la chirurgie plastique, comme la correction reconstructive des lésions des cordes vocales. Le collagène bovin est généralement utilisé à cette fin, dont la durée d'action est limitée par son immunogénicité. Protéine étrangère, le collagène bovin est sensible à la collagénase du receveur et peut provoquer des réactions immunitaires. Afin de réduire ce risque, des technologies d'obtention de préparations de collagène réticulé au glutaraldéhyde ont été développées. Leur avantage réside dans une plus grande stabilité et une immunogénicité plus faible, ce qui a trouvé une application pratique dans l'élimination des anomalies et de l'atrophie des cordes vocales. Les injections de collagène autologue ont été utilisées pour la première fois en 1995. Cette technique a permis de préserver la structure primaire des fibres de collagène autologue, y compris les réticulations intramoléculaires catalysées par voie enzymatique. En effet, les fibres de collagène naturel sont plus résistantes à la destruction par les protéases que le collagène reconstitué, dont les télopeptides sont coupés. L'intégrité des télopeptides est essentielle à la structure quaternaire des fibres de collagène et à la formation de liaisons croisées entre les molécules de collagène adjacentes. Contrairement aux préparations de collagène bovin, le collagène autologue n'induit pas de réactions immunitaires chez le receveur, mais son efficacité comme agent régénérateur est insuffisante. Une correction stable peut être obtenue par la production locale de collagène par transplantation de fibroblastes autologues. Cependant, certaines difficultés ont été identifiées lors de l'étude de l'efficacité de la transplantation de fibroblastes autologues en clinique. Au début de la transplantation de fibroblastes, l'effet clinique était plus faible qu'après l'introduction de collagène bovin. Lors de la culture de fibroblastes autologues, la possibilité d'une transformation de fibroblastes normaux en fibroblastes pathologiques, appelés myofibroblastes, responsables du développement de la fibrose et de la cicatrisation, comme en témoigne la contraction du gel de collagène provoquée par l'interaction spécifique des fibroblastes et des fibrilles de collagène, ne peut être exclue. De plus, après des passages en série in vitro, les fibroblastes perdent la capacité de synthétiser des protéines de la matrice extracellulaire.

Cependant, une méthode de culture de fibroblastes humains autologues a maintenant été développée expérimentalement. Elle élimine les inconvénients mentionnés ci-dessus et n'entraîne pas de transformation oncogène des fibroblastes normaux. Les fibroblastes autologues obtenus par cette méthode sont utilisés pour restaurer les défauts des tissus mous du visage. Dans une étude de G. Keller et al. (2000), 20 patients âgés de 37 à 61 ans présentant des rides et des cicatrices atrophiques ont été traités. Des biopsies cutanées (4 mm) de la région rétroauriculaire ont été transportées au laboratoire dans des tubes à essai stériles contenant 10 ml de milieu de culture (milieu d'Eagle avec antibiotique, mycoseptique, pyruvate et sérum de veau fœtal). Le matériel a été placé dans 3 à 5 boîtes de culture de 60 mm de diamètre et incubé dans un thermostat avec une atmosphère contenant 5 % de CO2. Après 1 semaine, les cellules ont été retirées des boîtes par trypsinisation et placées dans des flacons de 25 cm2. Les cellules ont été injectées aux patients à raison de 4 x 107. Un effet clinique significatif et persistant a été observé chez les patients lors de la correction des sillons nasogéniens, ainsi que chez les patients présentant des cicatrices 7 et 12 mois après la troisième transplantation de fibroblastes autologues. D'après la cytométrie de flux, les fibroblastes cultivés ont produit une grande quantité de collagène de type I. Des études in vitro ont montré une contractilité normale des fibroblastes injectés. Deux mois après l'administration sous-cutanée de fibroblastes cultivés à une dose de 4 x 107 cellules, aucune tumeur n'a été détectée chez la souris nude. Les fibroblastes injectés n'ont pas provoqué de cicatrices ni de fibrose diffuse chez les patients. Selon l'auteur, les fibroblastes autologues greffés sont capables de produire constamment du collagène, ce qui procure un effet de rajeunissement esthétique. Parallèlement, la durée de vie des cellules différenciées étant limitée, les fibroblastes prélevés sur un patient jeune sont plus efficaces que ceux obtenus sur des personnes âgées. À l'avenir, on suppose qu'il sera possible de cryoconserver une culture de fibroblastes prélevés sur un jeune donneur afin de transplanter ultérieurement ses propres jeunes cellules chez un patient âgé. En conclusion, il est inexact de conclure que les fibroblastes autologues, à condition qu'ils soient fonctionnellement préservés, constituent un moyen idéal de corriger les défauts des tissus mous du visage. Parallèlement, l'auteur lui-même note que l'utilisation du système fibroblastes-collagène autologue a posé des problèmes au cours de l'étude. L'effet clinique était souvent plus faible qu'avec le collagène bovin, ce qui a suscité la déception des patients.

De manière générale, les données de la littérature concernant les perspectives d'utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses semblent plutôt optimistes. Des tentatives sont en cours pour utiliser des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes issues de moelle osseuse autologue pour traiter les lésions articulaires dégénératives. Les premiers essais cliniques sur l'utilisation de cellules progénitrices mésenchymateuses cultivées dans le traitement des fractures osseuses complexes sont en cours. Des cellules stromales mésenchymateuses auto- et allogéniques issues de moelle osseuse sont utilisées pour créer du tissu cartilagineux destiné à la transplantation afin de corriger les lésions cartilagineuses articulaires dues à un traumatisme ou à des lésions auto-immunes. Des méthodes sont en cours de développement pour l'utilisation clinique de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes afin d'éliminer les lésions osseuses chez les enfants atteints d'une forme sévère d'ostéogenèse incomplète causée par des mutations du gène du collagène de type I. Après myéloablation, les enfants receveurs reçoivent une greffe de moelle osseuse provenant de donneurs sains HLA compatibles, car la moelle osseuse non fractionnée peut contenir un nombre suffisant de cellules souches mésenchymateuses pour compenser une lésion osseuse sévère. Après une greffe de moelle osseuse allogénique, ces enfants ont présenté des modifications histologiques positives des os trabéculaires, une augmentation de la croissance et une diminution de l'incidence des fractures osseuses. Dans certains cas, un résultat clinique positif est obtenu par greffe de moelle osseuse allogénique et d'ostéoblastes étroitement apparentés. La greffe de CSM est également utilisée pour traiter la fragilité osseuse congénitale causée par un déséquilibre entre les ostéoblastes et les ostéoclastes dans le tissu osseux. Dans ce cas, la restauration de la formation osseuse est obtenue par chimérisation du pool de cellules souches et progénitrices stromales du tissu osseux des patients.

L'amélioration des méthodes de modification génétique des cellules souches mésenchymateuses du donneur en vue de corriger les anomalies génétiques des tissus stromaux se poursuit. On suppose que, dans un avenir proche, les cellules souches mésenchymateuses seront utilisées en neurologie pour la chimérisation ciblée des cellules cérébrales et la création d'un pool de cellules saines capables de générer l'enzyme ou le facteur déficient responsable des manifestations cliniques de la maladie. La transplantation de cellules souches mésenchymateuses peut être utilisée pour restaurer le stroma de la moelle osseuse chez les patients cancéreux après radiothérapie et chimiothérapie, et, en association avec des cellules de moelle osseuse, pour restaurer l'hématopoïèse. Le développement de thérapies substitutives visant à corriger les anomalies du système musculo-squelettique à l'aide de CSM est favorisé par les avancées techniques dans le domaine de la conception de biomatériaux matriciels ou de biomimétiques formant des structures peuplées de cellules souches mésenchymateuses.

Sources de cellules souches mésenchymateuses

La principale source de cellules souches mésenchymateuses est la moelle osseuse, dont les cellules souches hématopoïétiques chez les mammifères se différencient constamment en cellules sanguines et immunitaires. Les cellules souches mésenchymateuses sont quant à elles représentées par une petite population de cellules fibroblastiques du stroma médullaire et contribuent au maintien de l'état indifférencié des cellules souches hématopoïétiques. Dans certaines conditions, les cellules souches mésenchymateuses se différencient en cellules cartilagineuses et osseuses. Ensemencees sur un milieu de culture à faible densité, les cellules stromales mononucléaires de la moelle osseuse forment des colonies de cellules adhésives, qui sont en fait des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes fibroblastiques. Certains auteurs pensent que les cellules souches mésenchymateuses non engagées se déposent dans la moelle osseuse et, grâce à leur capacité d'auto-renouvellement et à leur fort potentiel de différenciation, fournissent à tous les tissus de l'organisme des précurseurs mésenchymateux des éléments stromaux tout au long de la vie de l'organisme mammifère.

Dans la moelle osseuse, les éléments cellulaires stromaux forment un réseau remplissant l'espace entre les sinusoïdes et le tissu osseux. La teneur en CSM dormantes dans la moelle osseuse d'un adulte est comparable à celle des cellules souches hématopoïétiques et ne dépasse pas 0,01 à 0,001 %. Les cellules souches mésenchymateuses isolées de la moelle osseuse et non cultivées sont dépourvues de molécules d'adhésion. Ces CSM n'expriment pas CD34, ICAM, VCAM, les collagènes de types I et III, CD44 et CD29. Par conséquent, in vitro, ce ne sont pas les cellules souches mésenchymateuses qui se fixent sur le substrat de culture, mais des dérivés progéniteurs plus avancés de cellules souches mésenchymateuses ayant déjà formé les composants du cytosquelette et l'appareil récepteur des molécules d'adhésion cellulaire. Les cellules stromales présentant le phénotype CD34 sont présentes même dans le sang périphérique, bien que dans la moelle osseuse, leur nombre soit nettement inférieur à celui des cellules mononucléées CD34-positives. Les cellules CD34 isolées du sang et transférées en culture se fixent au substrat et forment des colonies de cellules de type fibroblaste.

Il est connu qu'à la période embryonnaire, la base stromale de tous les organes et tissus des mammifères et des humains se forme à partir d'un pool commun de cellules souches mésenchymateuses, avant et pendant l'organogenèse. Par conséquent, on estime que, dans un organisme mature, la majorité des cellules souches mésenchymateuses devraient se trouver dans le tissu conjonctif et osseux. Il a été établi que la majeure partie des éléments cellulaires du stroma du tissu conjonctif et osseux lâche est constituée de cellules progénitrices engagées, qui conservent toutefois la capacité de proliférer et de former des clones in vitro. Lorsque ces cellules sont introduites dans la circulation sanguine, plus de 20 % des cellules progénitrices mésenchymateuses s'implantent parmi les éléments stromaux du tissu hématopoïétique et des organes parenchymateux.

Le tissu adipeux constitue une source potentielle de cellules souches mésenchymateuses. Parmi ces cellules souches, des précurseurs adipocytaires, plus ou moins impliqués, ont été identifiés. Les éléments progéniteurs les moins matures du tissu adipeux sont les cellules stromales-vasculaires. Celles-ci, comme les cellules précurseurs mésenchymateuses multipotentes de la moelle osseuse, sont capables de se différencier en adipocytes sous l'influence des glucocorticoïdes, du facteur de croissance analogue à l'insuline et de l'insuline. En culture, les cellules stromales-vasculaires se différencient en adipocytes et en chondrocytes, tandis que le tissu adipeux d'origine médullaire contient des cellules qui forment des adipocytes et des ostéoblastes.

Des cellules souches stromales ont également été détectées dans les muscles. Dans la culture primaire de cellules isolées du muscle squelettique humain, des cellules étoilées et des myotubes multinucléés sont détectés. En présence de sérum de cheval, les cellules étoilées prolifèrent in vitro sans signe de cytodifférenciation. Après ajout de dexaméthasone au milieu nutritif, leur différenciation est caractérisée par l'apparition d'éléments cellulaires présentant le phénotype des cellules musculaires squelettiques et lisses, de l'os, du cartilage et du tissu adipeux. Par conséquent, des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes, engagées et non engagées, sont présentes dans le tissu musculaire humain. Il a été démontré que la population de cellules progénitrices présente dans le muscle squelettique provient des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes non engagées de la moelle osseuse et diffère des cellules satellites myogéniques.

Des cellules étoilées adhésives correspondant à des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes en potentiel de différenciation ont également été trouvées dans le myocarde de rats nouveau-nés, car sous l'influence de la dexaméthasone, elles se différencient en adipocytes, ostéoblastes, chondrocytes, cellules musculaires lisses, myotubes musculaires squelettiques et cardiomyocytes. Il a été démontré que les cellules musculaires lisses vasculaires (péricytes) sont des dérivés de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes périvasculaires indifférenciées. En culture, les cellules souches mésenchymateuses périvasculaires expriment l'α-actine du muscle lisse et le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes et sont capables de se différencier au moins en cellules musculaires lisses.

Du point de vue des réserves souches, le tissu cartilagineux occupe une place particulière. Son potentiel réparateur extrêmement faible serait dû à un déficit en cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes ou en facteurs de différenciation et de croissance. On suppose que les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes, pré-engagées dans la chondro- et l'ostéogenèse, pénètrent dans le tissu cartilagineux à partir d'autres sources tissulaires.

L'origine tissulaire et les conditions d'engagement des cellules progénitrices mésenchymateuses dans les tendons n'ont pas non plus été établies. Des observations expérimentales indiquent qu'au début de la période postnatale, les cellules du tendon d'Achille de lapin en cultures primaires et lors du premier passage conservent l'expression du collagène de type I et de la décorine, mais qu'avec des cultures ultérieures, elles perdent les marqueurs de différenciation des ténocytes.

Il convient de noter que la réponse à la question de savoir si les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes localisées dans divers tissus sont réellement présentes en permanence dans leur stroma, ou si le pool tissulaire de cellules souches mésenchymateuses est reconstitué par la migration des cellules souches stromales de la moelle osseuse, n'a pas encore été reçue.

Outre la moelle osseuse et d'autres tissus mésenchymateux d'un organisme adulte, le sang de cordon peut être une autre source de CSM. Il a été démontré que le sang veineux du cordon ombilical contient des cellules présentant des caractéristiques morphologiques et antigéniques similaires à celles des cellules souches mésenchymateuses multipotentes, qu'elles sont capables d'adhésion et que leur potentiel de différenciation n'est pas inférieur à celui des cellules souches mésenchymateuses multipotentes issues de la moelle osseuse. Des cultures de cellules souches mésenchymateuses issues du sang de cordon ombilical ont permis de détecter 5 à 10 % de cellules souches mésenchymateuses multipotentes non impliquées. Leur nombre dans le sang de cordon est inversement proportionnel à l'âge gestationnel, ce qui indique indirectement la migration des cellules souches mésenchymateuses multipotentes vers divers tissus au cours du développement fœtal. Les premières informations sont apparues sur l'utilisation clinique des cellules souches mésenchymateuses isolées du sang du cordon ombilical, ainsi que celles obtenues à partir de biomatériaux embryonnaires, qui reposent sur la capacité connue des cellules souches fœtales à s'intégrer, à se greffer et à fonctionner dans les organes et les systèmes tissulaires des receveurs adultes.

Recherche de nouvelles sources de cellules souches mésenchymateuses

L'utilisation de cellules souches mésenchymateuses d'origine embryonnaire, ainsi que d'autres cellules fœtales, pose de nombreux problèmes éthiques, juridiques, judiciaires et législatifs. Par conséquent, la recherche de matériel cellulaire extraembryonnaire se poursuit. Une tentative d'utilisation clinique de fibroblastes cutanés humains a échoué, ce qui était dû non seulement au potentiel financier élevé de la technologie, mais aussi à la différenciation rapide des fibroblastes en fibrocytes, dont le potentiel de prolifération est nettement plus faible et la production d'un nombre limité de facteurs de croissance. Les progrès réalisés dans l'étude de la biologie des CSM et des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes de la moelle osseuse nous ont permis d'élaborer une stratégie pour l'utilisation clinique de cellules souches mésenchymateuses autologues. La technologie de leur isolement, de leur culture, de leur reproduction ex vivo et de leur différenciation ciblée a nécessité, en premier lieu, l'étude du spectre des marqueurs moléculaires des CSM. Leur analyse a montré que les cultures primaires de tissu osseux humain contiennent plusieurs types de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Le phénotype proostéoblastique a été détecté dans des cellules exprimant le marqueur des cellules progénitrices stromales STRO-1, mais ne portant pas le marqueur ostéoblastique – la phosphatase alcaline. Ces cellules se caractérisent par une faible capacité à former une matrice osseuse minéralisée, ainsi que par l'absence d'expression de l'ostéopontine et du récepteur de l'hormone parathyroïdienne. Les dérivés de cellules STRO-1 positives qui n'expriment pas la phosphatase alcaline sont représentés par des ostéoblastes intermédiairement et complètement différenciés. Il a été constaté que des éléments cellulaires de lignées clonées de cellules osseuses trabéculaires humaines STRO-1 positives sont capables de se différencier en ostéocytes et adipocytes matures. La direction de la différenciation de ces cellules dépend de l'effet des acides gras polyinsaturés, des cytokines pro-inflammatoires – IL-1b et facteur de nécrose tumorale a (TNF-a), ainsi que du TGF-b anti-inflammatoire et immunosuppresseur.

Il a été découvert ultérieurement que les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes sont dépourvues de phénotype spécifique qui leur est propre, mais expriment un complexe de marqueurs caractéristiques des cellules mésenchymateuses, endothéliales, épithéliales et musculaires en l'absence d'expression des antigènes immunophénotypiques des cellules hématopoïétiques: CD45, CD34 et CD14. De plus, les cellules souches mésenchymateuses produisent de manière constitutive et inductible des facteurs de croissance hématopoïétiques et non hématopoïétiques, des interleukines et des chimiokines, et des récepteurs de certaines cytokines et facteurs de croissance sont exprimés sur ces cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Des cellules dormantes, ou au repos, présentant un immunophénotype presque identique au profil antigénique des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes non traitées au 5-fluorouracile ont été trouvées parmi les cellules de la matrice stromale du corps humain; ces deux cellules expriment le gène CD117, qui marque les cellules souches « adultes ».

Ainsi, aucun marqueur cellulaire propre aux cellules souches mésenchymateuses n'a encore été identifié. On suppose que les cellules quiescentes représentent une population de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes non engagées, car elles n'expriment pas les marqueurs des cellules engagées dans l'ostéo- (Cbfa-1) ou l'adipogenèse (PPAR-y-2). L'exposition prolongée de cellules quiescentes à prolifération lente au sérum bovin fœtal conduit à la formation de progéniteurs engagés à différenciation terminale caractérisés par une croissance rapide. L'expansion clonale de ces cellules souches mésenchymateuses est soutenue par FGF2. Il semble que le génome des cellules souches stromales soit assez étroitement « fermé ». Des rapports font état de l'absence de différenciation spontanée dans les CSM; sans conditions particulières d'engagement, elles ne se transforment même pas en cellules de la lignée mésenchymateuse.

Pour étudier la structure de la population de dérivés de cellules souches mésenchymateuses, une recherche de protéines marqueurs de différenciation est effectuée sur des lignées de cellules stromales et dans des cultures primaires. L'analyse clonale in vitro de cellules formant des colonies de moelle osseuse a montré que l'EGF augmente la taille moyenne des colonies et diminue l'expression clonale de la phosphatase alcaline lorsqu'il est appliqué aux cultures primaires, tandis que l'ajout d'hydrocortisone active l'expression de la phosphatase alcaline, qui est un marqueur de la direction ostéogénique de la différenciation des CSM. Des anticorps monoclonaux anti-STRO-1 ont permis de séparer et d'étudier la population de cellules adhésives positives pour STRO-1 dans un système hétérogène de cultures Dexter. Un spectre de cytokines a été déterminé qui régule non seulement la prolifération et la différenciation des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes, mais participe également à la formation, à la formation et à la résorption des tissus squelettiques par des mécanismes para-, auto- et endocriniens. La libération, médiée par les récepteurs, de messagers secondaires tels que l'AMPc, le diacylglycérol, l'inositol triphosphate et le Ca2+ est également utilisée pour l'analyse des marqueurs de diverses catégories de cellules du tissu stromal exprimant les récepteurs correspondants. L'utilisation d'anticorps monoclonaux comme marqueurs a permis d'établir l'appartenance des cellules réticulaires du stroma des organes lymphoïdes aux zones T et B dépendantes.

Depuis un certain temps, les débats scientifiques se poursuivent autour de la possibilité que les CSM proviennent d'une cellule souche hématopoïétique. En effet, lorsque des suspensions de cellules de moelle osseuse sont explantées en cultures monocouches, des colonies distinctes de fibroblastes s'y développent. Cependant, il a été démontré que la présence de précurseurs de colonies de fibroblastes et de divers germes de différenciation tissulaire hématopoïétique dans la moelle osseuse ne prouve pas leur origine commune à partir d'une cellule souche hématopoïétique. Grâce à l'analyse discriminante des cellules souches de moelle osseuse, il a été établi que le microenvironnement lors d'une greffe hétérotopique de moelle osseuse n'est pas transféré par les cellules hématopoïétiques, ce qui prouve l'existence d'une population de CSM dans la moelle osseuse, histogénétiquement indépendante des cellules hématopoïétiques.

De plus, la méthode de clonage sélectif a permis d'identifier une nouvelle catégorie de cellules progénitrices stromales dans des cultures monocouches de cellules de moelle osseuse, de déterminer leur nombre et d'étudier leurs propriétés et leurs potentiels de prolifération et de différenciation. Il s'est avéré que les cellules stromales de type fibroblaste prolifèrent in vitro et forment des colonies diploïdes qui, une fois transplantées dans l'organisme, permettent la formation de nouveaux organes hématopoïétiques. Les résultats de l'étude de clones individuels indiquent que parmi les cellules progénitrices stromales, il existe une population de cellules qui, de par leur potentiel de prolifération et de différenciation, peuvent prétendre au rôle de cellules souches du tissu stromal, histogénétiquement indépendantes des cellules souches hématopoïétiques. Les cellules de cette population se caractérisent par une croissance autonome et se différencient en éléments cellulaires progéniteurs de l'os, du cartilage et du tissu réticulaire de la moelle osseuse.

Français Les résultats des études de R. Chailakhyan et ses co-auteurs (1997-2001), qui ont cultivé des cellules progénitrices stromales de moelle osseuse de lapins, de cobayes et de souris sur le milieu nutritif a-MEM avec ajout de sérum de veau fœtal, sont d'un grand intérêt. Les auteurs ont réalisé l'explantation avec une densité initiale de 2-4 x 103 cellules de moelle osseuse par 1 cm². Des cellules de moelle osseuse homologues ou hétérologues inactivées par radiation ont été utilisées comme nourricier à une dose qui a conservé l'effet nourricier mais a complètement bloqué leur prolifération. Des colonies distinctes primaires de fibroblastes âgées de deux semaines ont été trypsinisées pour obtenir des souches monoclonales. La preuve de l'origine clonale des colonies a été obtenue à l'aide d'un marqueur chromosomique dans des cultures mixtes de moelle osseuse de cobayes mâles et femelles, de photographies accélérées de cultures vivantes et dans des cultures mixtes de moelle osseuse syngénique de souris CBA et CBAT6T6. La transplantation d'une suspension de cellules de moelle osseuse fraîchement isolées ou de fibroblastes stromaux cultivés in vitro sous la capsule rénale a été réalisée dans des échafaudages poreux en ivalon ou en gélatine, ainsi que dans une matrice osseuse spongieuse de lapin inactivée. Pour la transplantation de clones dans une gaine osseuse, des fémurs de cobaye ont été débarrassés de leurs tissus mous et de leur périoste, les épiphyses ont été parées et la moelle osseuse a été soigneusement lavée. L'os a été découpé en fragments (3-5 mm), séché et irradié à une dose de 60 Gy. Des colonies individuelles de fibroblastes ont été placées dans des gaines osseuses et implantées par voie intramusculaire. Pour la transplantation intrapéritonéale de fibroblastes stromaux cultivés in vitro, des chambres de diffusion de types A (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) et O (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) ont été utilisées.

En étudiant la dynamique de croissance des souches clonales, R. Chailakhyan et al. (2001) ont découvert que les cellules individuelles formant des colonies de fibroblastes, ainsi que leurs descendants, possèdent un potentiel prolifératif énorme. Au dixième passage, le nombre de fibroblastes dans certaines souches était de 1,2 à 7,2 x 10 ^cellules. Au cours de leur développement, elles ont réalisé jusqu'à 31 à 34 doublements cellulaires. Dans ce cas, la transplantation hétérotopique de souches dérivées de la moelle osseuse formées par des précurseurs stromaux de plusieurs dizaines de clones a entraîné le transfert du microenvironnement médullaire et la formation d'un nouvel organe hématopoïétique dans la zone de transplantation. Les auteurs se sont demandé si des clones individuels sont capables de transférer le microenvironnement médullaire des cellules stromales ou si la coopération de plusieurs précurseurs stromaux clonogéniques différents est nécessaire pour cela. Et si des clones individuels sont capables de transférer le microenvironnement, celui-ci sera-t-il complet pour les trois germes hématopoïétiques, ou des clones différents assurent-ils la formation du microenvironnement pour différents germes hématopoïétiques? Pour résoudre ces problèmes, une technologie a été développée pour la culture de cellules progénitrices stromales sur gel de collagène, permettant de prélever les colonies de fibroblastes cultivées à la surface pour une transplantation hétérotopique ultérieure. Des clones individuels de fibroblastes stromaux cultivés à partir de cellules de moelle osseuse de souris CBA et de cobayes ont été excisés avec un fragment du revêtement de gel et transplantés hétérotopiquement – sous la capsule rénale de souris syngéniques ou dans le muscle abdominal de cobayes autologues. Une fois transplantées dans le muscle, les colonies sur le gel ont été placées dans des gaines osseuses.

Les auteurs ont constaté que 50 à 90 jours après la transplantation de colonies de fibroblastes de moelle osseuse, le développement d'os ou de tissu osseux et hématopoïétique était observé dans la zone de transplantation dans 20 % des cas. Chez 5 % des animaux receveurs, les foyers de tissu osseux formés contenaient une cavité remplie de moelle osseuse. À l'intérieur des cylindres osseux, ces foyers avaient une forme arrondie et une capsule constituée de tissu osseux avec des ostéocytes et une couche ostéoblastique bien développée. La cavité médullaire contenait du tissu réticulaire avec des cellules myéloïdes et érythroïdes, dont la proportion ne différait pas de celle de la moelle osseuse normale. Dans le rein, le transplant était un organe médullaire typique formé lors d'une transplantation de moelle osseuse native, la capsule osseuse recouvrant la cavité médullaire uniquement du côté de la capsule rénale. Le tissu hématopoïétique comprenait des éléments myéloïdes, érythroïdes et mégacaryocytaires. Le stroma de la cavité médullaire présentait un système sinusal bien développé et contenait des cellules adipeuses typiques. Français Dans le même temps, du tissu osseux sans signes d'hématopoïèse a été trouvé dans la zone de transplantation de certaines colonies sous la capsule rénale. L'étude des potentiels de prolifération et de différenciation de clones individuels a été poursuivie sur des souches monoclonales de moelle osseuse de lapin, dont les cellules ont été remises en suspension dans un milieu nutritif et dans une éponge d'Ivalon séparée d'une masse de 1 à 2 mg ont été transplantées sous la capsule rénale d'un donneur de moelle osseuse de lapin. Les cellules de 21 souches monoclonales ont été soumises à une telle autotransplantation. Les résultats ont été pris en compte après 2 à 3 mois. Les auteurs ont constaté que dans 14 % des cas, les souches monoclonales transplantées formaient un organe de moelle osseuse constitué de tissu osseux et d'une cavité médullaire remplie de cellules hématopoïétiques. Dans 33 % des cas, les souches transplantées formaient un os compact de taille variable avec des ostéocytes immergés dans les cavités et une couche ostéoblastique développée. Dans certains cas, du tissu réticulaire sans os ni éléments hématopoïétiques s'est développé dans les éponges contenant des clones transplantés. Parfois, un stroma réticulaire avec un réseau bien développé de sinusoïdes s'est formé, mais non peuplé de cellules hématopoïétiques. Ainsi, les résultats obtenus étaient similaires à ceux obtenus lors de la transplantation de clones sur gel de collagène. Cependant, si la transplantation de clones cultivés sur un substrat a entraîné la formation de tissu médullaire dans 5 % des cas, de tissu osseux dans 15 % des cas et de tissu réticulaire dans 80 % des cas, alors avec la transplantation de souches monoclonales, la formation d'éléments médullaires a été observée dans 14 % des cas, de tissu osseux dans 53 % des cas et de tissu réticulaire dans 53 % des cas. Selon les auteurs, cela indique que les conditions de mise en œuvre du potentiel prolifératif et différenciateur des fibroblastes stromaux lors de la transplantation sur échafaudages poreux étaient plus optimales que lors de leur transplantation dans des gaines osseuses et sur un substrat de collagène.Il est possible que l'utilisation de méthodes plus avancées de culture et de transplantation inverse de clones puisse améliorer les conditions de réalisation de leur potentiel de différenciation par les clones et modifier ces ratios. Quoi qu'il en soit, l'intérêt principal des études menées réside dans le fait que certains clones de cellules stromales sont capables de former du tissu osseux et de fournir simultanément un microenvironnement hématopoïétique stromal pour trois germes d'hématopoïèse médullaire simultanément: érythroïde, myéloïde et mégacaryocytaire, créant ainsi de vastes plateformes de tissu hématopoïétique et une certaine masse osseuse.

Français Les auteurs ont ensuite abordé la question de la capacité des cellules progénitrices stromales clonogènes individuelles à subir ces types de différenciation cellulaire dans un système fermé de chambres de diffusion. De plus, il était nécessaire de déterminer si les clones individuels possèdent une polypotence ou si la manifestation du potentiel de différenciation nécessite une interaction coopérative de plusieurs clones avec un trait de cytodifférenciation fixe, dont les différents rapports déterminent la formation préférentielle de tissu osseux, réticulaire ou cartilagineux. En combinant deux approches méthodologiques – l'obtention de souches monoclonales de cellules progénitrices stromales de moelle osseuse et leur transplantation dans des chambres de diffusion – R. Chailakhyan et ses co-auteurs (2001) ont obtenu des résultats qui leur ont permis de se rapprocher de la compréhension de l'organisation structurale du stroma de moelle osseuse. La transplantation de souches monoclonales de cellules progénitrices stromales dans des chambres de type O a entraîné la formation de tissu osseux et cartilagineux, indiquant la capacité des descendants d'une seule cellule formant une colonie stromale à former simultanément du tissu osseux et cartilagineux. L'hypothèse selon laquelle les tissus osseux et cartilagineux proviendraient d'une cellule progénitrice stromale commune a été maintes fois avancée. Cependant, cette hypothèse n'a pas été confirmée expérimentalement. La formation d'os et de cartilage dans des chambres de diffusion constituait la preuve nécessaire de l'existence d'une cellule progénitrice commune à ces deux types de tissus parmi les cellules souches stromales de la moelle osseuse.

Français Ensuite, 29 souches clonales des deuxième et troisième passages obtenues à partir de cultures primaires de moelle osseuse de lapin ont été placées dans des chambres de diffusion et implantées par voie intrapéritonéale chez des animaux homologues. Les études ont montré que 45 % des souches monoclonales de moelle osseuse possèdent un potentiel ostéogénique. Neuf chambres contenaient exclusivement du tissu réticulaire, mais celui-ci était présent avec du tissu osseux et cartilagineux dans 13 autres chambres, ce qui constituait 76 % de toutes les souches. Dans les chambres de type O, où la différenciation du tissu osseux et cartilagineux était possible, 16 souches ont été étudiées. Dans quatre chambres (25 %), du tissu osseux et cartilagineux était formé. Il convient de noter une fois de plus que dans les études de R. Chailakhyan et al. (2001), les cellules progénitrices individuelles ont subi 31 à 34 doublements au sein d'une souche cellulaire, et leur progéniture comprenait 0,9 à 2,0 x 10 ⁹ cellules. Français Le nombre de mitoses subies par les cellules progénitrices des souches polyclonales était pratiquement identique à celui des souches monoclonales. Le taux de développement des souches polyclonales, en particulier dans la première phase de leur formation, dépendait dans une large mesure du nombre de colonies utilisées pour initier les souches. Les souches diploïdes de fibroblastes embryonnaires humains (WI-38), lorsqu'elles étaient reclonées aux niveaux de 12-15e doublement, formaient également des colonies qui différaient en diamètre et en contenu cellulaire. Les grandes colonies contenant plus de 103 cellules ne constituaient que 5 à 10 %. Avec l'augmentation du nombre de divisions, le pourcentage de grandes colonies diminuait. Les souches mono- et polyclonales de fibroblastes stromaux de moelle osseuse conservaient un ensemble diploïde de chromosomes après 20 doublements ou plus, et la tendance de leur développement était comparable à la dynamique de développement des souches diploïdes de fibroblastes embryonnaires. L'analyse du potentiel de différenciation des cellules progénitrices stromales de moelle osseuse, réalisée par transplantation de souches monoclonales dans des chambres de diffusion, a montré que la moitié d'entre elles étaient ostéogéniques. Les grandes colonies représentaient 10 % de leur nombre total. Par conséquent, le nombre de cellules formant des colonies ostéogéniques correspondait à environ 5 % de leur population totale. La masse totale de cellules progénitrices ostéogéniques identifiées par les auteurs comprenait des cellules capables de former simultanément du tissu osseux et cartilagineux. De plus, il a été établi pour la première fois que ces deux types de tissu chez un organisme adulte ont une cellule progénitrice commune: 25 % des clones testés ont été créés par de telles cellules, et leur nombre parmi la population totale de cellules progénitrices était d'au moins 2,5 %.

Ainsi, la transplantation hétérotopique de clones individuels de fibroblastes de moelle osseuse a révélé de nouveaux aspects de l'organisation structurale de la population de cellules progénitrices mésenchymateuses. Des cellules progénitrices stromales ont été identifiées comme capables de transférer un microenvironnement spécifique à tous les bourgeons hématopoïétiques simultanément. Leur nombre parmi les grands clones étudiés dans différents modèles varie de 5 à 15 % (0,5 à 1,5 % du nombre total de cellules progénitrices détectées). Outre les clones transférant l'intégralité du microenvironnement médullaire, il existe des cellules progénitrices déterminées uniquement à l'ostéogenèse qui, transférées en système ouvert, forment du tissu osseux ne favorisant pas le développement de l'hématopoïèse. Leur nombre par rapport au nombre total de cellules progénitrices est de 1,5 à 3 %. Certaines de ces cellules sont capables de former du tissu osseux avec une période d'auto-entretien limitée. Par conséquent, la population de cellules progénitrices stromales présente un potentiel de différenciation hétérogène. Parmi elles, une catégorie de cellules se présente comme des cellules souches stromales, capables de se différencier dans les trois directions caractéristiques du tissu stromal de la moelle osseuse, formant ainsi de l'os, du cartilage et du tissu réticulaire. Les données présentées nous permettent d'espérer qu'à l'aide de divers marqueurs cellulaires, il sera possible de déterminer la contribution de chaque type de cellules stromales à l'organisation d'un microenvironnement spécifique et au soutien de l'hématopoïèse dans les cultures de Dexter.

Caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses

Ces dernières années, il a été établi que dans les cultures de moelle osseuse stationnaires, les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes sont représentées par une population limitée de petites cellules agranulaires (cellules RS-1) caractérisées par une faible capacité de formation de colonies et l'absence d'expression de l'antigène Ki-67 spécifique des cellules proliférantes. Les paramètres antigéniques des cellules RS-1 dormantes diffèrent du spectre antigénique des cellules progénitrices stromales engagées à prolifération rapide. Il a été établi qu'un taux de prolifération élevé des cellules progénitrices engagées n'est observé qu'en présence de cellules RS-1. À leur tour, les cellules RS-1 augmentent leur taux de croissance sous l'influence de facteurs sécrétés par les dérivés les plus matures des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Il semble que les cellules RS-1 constituent une sous-classe de MSC non engagées capables de recyclage. In vitro, les cellules progénitrices stromales de moelle osseuse résistantes au 5-fluorouracile sont caractérisées par une faible teneur en ARN et une expression élevée du gène de l'ornithine décarboxylase, un marqueur des cellules non prolifératives.

La prolifération intensive des cellules progénitrices stromales débute après leur fixation sur le substrat. Dans ce cas, le profil des marqueurs des cellules peu différenciées est exprimé: SH2 (récepteur du TGF-(3)), SH3 (domaine de la protéine de signalisation), collagènes de types I et III, fibronectine, récepteurs d'adhésion VCAM-1 (CD106) et ICAM (CD54), cadhérine-11, CD44, CD71 (récepteur de la transferrine), CD90, CD120a et CD124, mais sans expression des marqueurs caractéristiques des cellules souches hématopoïétiques (CD34, CD14, CD45). La croissance clonale permet le passage répété des cellules souches mésenchymateuses avec formation de nombreuses cellules progénitrices stromales pluripotentes génétiquement homogènes en culture. Après 2 à 3 passages, leur nombre atteint 50 à 300 millions. Dans une culture suffisamment dense, après l'arrêt de la prolifération, les cellules progénitrices du stroma, contrairement aux fibroblastes du tissu hématopoïétique, se différencient en adipocytes, myocytes, cartilages et cellules osseuses. L'association de trois signaux régulateurs de différenciation, dont la 1-méthyl-isobutylxanthine (un inducteur de la formation d'AMPc intracellulaire), la dexaméthasone (un inhibiteur des phospholipases A et C) et l'indométacine (un inhibiteur de la cyclooxygénase, qui réduit également l'activité de la thromboxane synthase), convertit jusqu'à 95 % des cellules mésenchymateuses progénitrices en adipocytes. La formation d'adipocytes à partir d'éléments stromaux immatures est confirmée par l'expression du gène de la lipoprotéine lipase, la détection histochimique des apolipoprotéines et des récepteurs peroxysomaux. Des cellules du même clone, sous l'influence du TGF-β en milieu sans sérum, créent une population homogène de chondrocytes. La culture cellulaire multicouche de ce tissu cartilagineux est caractérisée par une matrice intercellulaire développée composée de protéoglycanes et de collagène de type II. Dans un milieu nutritif à 10 %, l'effet d'un complexe signal de différenciation composé de β-glycérophosphate (un donneur de phosphate inorganique), d'acide ascorbique et de dexaméthasone dans la même culture de cellules progénitrices stromales conduit à la formation d'agrégats cellulaires. Dans ces cellules, on observe une augmentation progressive de l'activité de la phosphatase alcaline et des taux d'ostéopontine, indiquant la formation de tissu osseux, dont la minéralisation est confirmée par une augmentation progressive de la teneur en calcium intracellulaire.

Selon certaines données, la capacité des cellules souches mésenchymateuses à se diviser et à se reproduire sans limite parmi divers types de cellules de la lignée de différenciation mésenchymateuse s'accompagne d'une grande plasticité. Introduites dans les ventricules ou la substance blanche du cerveau, les cellules souches mésenchymateuses migrent vers le parenchyme nerveux et se différencient en dérivés de la lignée cellulaire gliale ou neuronale. De plus, des informations existent sur la transdifférenciation des CSM en cellules souches hématopoïétiques in vitro et in vivo. Une analyse plus approfondie, réalisée dans le cadre de certaines études, a mis en évidence une plasticité exceptionnellement élevée des CSM, qui se manifeste par leur capacité à se différencier en astrocytes, oligodendrocytes, neurones, cardiomyocytes, cellules musculaires lisses et cellules musculaires squelettiques. Un certain nombre d'études sur le potentiel de transdifférenciation des MSC in vitro et in vivo ont établi que les cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes issues de la moelle osseuse se différencient de manière terminale en lignées cellulaires qui forment les os, le cartilage, les muscles, les nerfs et le tissu adipeux, ainsi que les tendons et le stroma qui soutiennent l'hématopoïèse.

Cependant, d'autres études n'ont révélé aucun signe de restriction de la pluripotence du génome des cellules souches mésenchymateuses et des populations progénitrices de cellules stromales, bien que plus de 200 clones de CSM isolés d'une culture primaire aient été étudiés pour tester une éventuelle pluripotence des cellules stromales. L'écrasante majorité des clones in vitro ont conservé la capacité de se différencier dans les directions ostéogénique, chondrogénique et adipogène. En excluant la probabilité de migration des cellules réceptrices par transplantation de cellules souches mésenchymateuses sous la capsule rénale ou dans des chambres de diffusion, il s'est avéré que les cellules progénitrices stromales in situ conservent un phénotype hétérogène, ce qui indique soit l'absence de facteurs de restriction dans la zone de transplantation, soit l'absence de pluripotence des CSM en tant que telle. Dans le même temps, l'existence d'un type rare de cellules souches pluripotentes somatiques, qui sont des précurseurs communs de toutes les cellules souches adultes, est admise.

La multipotence, mais non la pluripotence, des véritables cellules souches mésenchymateuses, qui constituent une très faible proportion des cellules de la moelle osseuse et sont capables de proliférer dans certaines conditions lors de la culture in vitro sans se différencier, est démontrée par leur engagement induit dans les cellules osseuses, cartilagineuses, adipeuses et musculaires, ainsi que dans les ténocytes et les éléments stromaux qui soutiennent l'hématopoïèse. En règle générale, une exposition prolongée à un milieu de culture contenant du sérum de veau fœtal provoque la libération de CSM dans les cellules progénitrices stromales engagées, dont la descendance subit une différenciation terminale spontanée. In vitro, il est possible d'obtenir une formation ciblée d'ostéoblastes en ajoutant de la dexaméthasone, du ß-glycérophosphate et de l'acide ascorbique au milieu de conditionnement, tandis qu'une combinaison de signaux de différenciation de dexaméthasone et d'insuline induit la formation d'adipocytes.

Il a été établi qu'avant d'entrer dans la phase de différenciation terminale, les CSM de la moelle osseuse se différencient initialement en cellules souches mésenchymateuses de type fibroblaste dans certaines conditions de culture. Des dérivés de ces cellules participent in vivo à la formation des os, du cartilage, des tendons, des tissus adipeux et musculaires, ainsi que du stroma qui soutient l'hématopoïèse. De nombreux auteurs comprennent le terme « cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes » comme désignant à la fois les CSM elles-mêmes et les cellules progénitrices stromales engagées de la moelle osseuse et des tissus mésenchymateux. L'analyse clonale de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes issues de la moelle osseuse a montré qu'un peu plus d'un tiers de tous les clones se différencient en ostéo-, chondro- et adipocytes, tandis que les cellules des clones restants n'ont qu'un potentiel ostéogénique et ne forment que des chondro- et des ostéocytes. Un clone de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes telles que BMC-9, dans des conditions microenvironnementales appropriées, se différencie en cellules présentant le phénotype et les caractéristiques fonctionnelles non seulement des ostéoblastes, des chondrocytes et des adipocytes, mais aussi des cellules stromales responsables de l'hématopoïèse. Un clone de cellules RCJ3.1 isolé de moelle osseuse fœtale de rat se différencie en cellules mésenchymateuses de différents phénotypes. Sous l'action combinée de l'acide ascorbique, du β-glycérophosphate et de la dexaméthasone, les éléments cellulaires de ce clone forment d'abord des myocytes multinucléaires, puis, séquentiellement, des adipocytes, des chondrocytes et des îlots de tissu osseux minéralisé. La population de cellules granulaires du périoste des fœtus de rat correspond à des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes non engagées, car elle est caractérisée par un faible taux de prolifération, n'exprime pas de marqueurs de différenciation et, dans des conditions de culture, se différencie pour former des chondro-, des ostéo- et des adipocytes, ainsi que des cellules musculaires lisses.

Il faut donc reconnaître que la question de la pluri- ou multipotence du génome des cellules souches mésenchymateuses reste ouverte, ce qui affecte également les idées sur le potentiel de différenciation des cellules progénitrices stromales, qui n'a pas non plus été définitivement établi.

Une caractéristique importante et expérimentalement prouvée des cellules souches mésenchymateuses est leur capacité à quitter la niche tissulaire et à circuler dans la circulation sanguine générale. Pour activer le programme de différenciation génétique, ces cellules souches circulantes doivent pénétrer dans le microenvironnement approprié. Il a été démontré qu'avec l'introduction systématique de CSM dans la circulation sanguine des animaux receveurs, des cellules immatures s'implantent dans divers organes et tissus, puis se différencient en cellules sanguines, myocytes, adipocytes, chondrocytes et fibroblastes. Par conséquent, dans les zones tissulaires locales, des interactions de régulation du signal se produisent entre les cellules progénitrices stromales engagées et non engagées, ainsi qu'entre elles et les cellules matures environnantes. On suppose que la différenciation est induite par des facteurs de régulation paracrines d'origine mésenchymateuse et non mésenchymateuse (facteurs de croissance, eicosanoïdes, molécules de la matrice extracellulaire), qui assurent les connexions spatiales et temporelles dans le microenvironnement des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes. Par conséquent, les lésions locales du tissu mésenchymateux devraient entraîner la formation de zones du microenvironnement de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes, qualitativement différentes du complexe de signaux régulateurs des tissus intacts, dans lesquelles se produisent des processus de régénération physiologiques plutôt que réparatrices. Cette différence est extrêmement importante en termes de spécialisation du phénotype cellulaire dans le microenvironnement normal et induit par les lésions.

Selon les concepts, c'est ici que s'inscrivent les mécanismes de la différence fondamentale entre les deux processus connus – régénération physiologique et prolifération inflammatoire. Le premier aboutit à la restauration de la composition cellulaire spécialisée du tissu et de sa fonction, tandis que la mise en œuvre du processus de prolifération entraîne la formation d'éléments conjonctifs matures et la perte de fonction de la zone tissulaire endommagée. Ainsi, pour développer des programmes optimaux d'utilisation des cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes en médecine régénérative et plastique, une étude approfondie des caractéristiques de l'impact des facteurs microenvironnementaux sur la différenciation des CSM est nécessaire.

La dépendance de la structure du compartiment des cellules souches à l'égard des régulateurs para- et autocrines cellulaires, dont l'expression est modulée par des signaux externes, ne fait aucun doute. Parmi les fonctions de ces facteurs régulateurs, les plus importantes sont le contrôle de la division asymétrique des CSM et l'expression des gènes déterminant les stades d'engagement et le nombre de divisions cellulaires. Les signaux externes, dont dépend le développement ultérieur des CSM, sont fournis par leur microenvironnement. À l'état immature, les CSM prolifèrent longtemps, tout en conservant leur capacité à se différencier en lignées d'adipocytes, de myofibroblastes, de stroma tissulaire hématogène, de cartilage et de cellules osseuses. Il a été établi qu'une population limitée d'éléments cellulaires stromaux CD34-négatifs circulant dans le sang retourne de la circulation sanguine vers le stroma médullaire, où elle est transformée en lignées de cellules souches hématopoïétiques CD34-positives. Ces observations suggèrent que la recirculation des cellules mésenchymateuses progénitrices dans la circulation sanguine maintient l'équilibre tissulaire des cellules souches stromales dans différents organes en mobilisant un pool commun d'éléments stromaux immatures de la moelle osseuse. La différenciation des CSM en cellules à phénotypes mésenchymateux multiples et leur participation à la régénération ou à la réparation des os, du cartilage, du tissu adipeux et des tendons in vivo ont été démontrées à l'aide de modèles de transfert adoptif chez l'animal de laboratoire. Selon d'autres auteurs, la migration à distance des CSM le long du lit vasculaire est associée à un mouvement à courte distance ou local de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes au sein du tissu lors de la réparation du cartilage, de la régénération musculaire et d'autres processus de restauration.

Les réserves locales de cellules souches du tissu stromal constituent une source de cellules dans les processus de régénération tissulaire physiologique et sont reconstituées par le transport à distance des CSM à mesure que les ressources souches du tissu stromal sont consommées. Cependant, en cas de mobilisation d'urgence du potentiel cellulaire réparateur, par exemple en cas de polytraumatisme, l'ensemble des CSM participe aux processus de régénération réparatrice, et les cellules progénitrices mésenchymateuses de la moelle osseuse sont recrutées vers la périphérie par la circulation sanguine générale.

Greffe de cellules souches mésenchymateuses

Certains parallèles peuvent être établis entre les processus de régénération tissulaire physiologique et leur formation au cours du développement intra-utérin. Dans l'embryogenèse humaine et mammifère, la formation de divers types de cellules spécialisées se produit à partir du pool ecto-, méso- et endodermique des feuillets germinaux, mais avec la participation obligatoire du mésenchyme. Le réseau cellulaire lâche du tissu mésenchymateux embryonnaire assure de nombreuses fonctions régulatrices, métaboliques, structurales et morphogénétiques. La ponte des organes provisoires n'a lieu qu'après la condensation du mésenchyme, due à la croissance clonogénique des cellules progénitrices, qui génèrent les signaux morphogénétiques primaires de l'organogenèse. Les dérivés stromaux du mésenchyme embryonnaire créent la structure cellulaire des organes provisoires et constituent la base de leur futur approvisionnement énergétique et plastique grâce à la croissance des vaisseaux sanguins et lymphatiques primaires. En d'autres termes, les éléments stromaux de l'unité microcirculatoire des organes fœtaux apparaissent avant la formation de leurs unités structurelles et fonctionnelles. De plus, la migration active des cellules mésenchymateuses pendant l'organogenèse assure l'orientation spatiale des organes en développement en marquant leurs limites volumiques par la restriction des types Hox homéotiques. La structure stromale sert également de base à l'assemblage des unités structurelles et fonctionnelles des organes parenchymateux, qui comprennent souvent des cellules morphogénétiquement et fonctionnellement complètement différentes. Par conséquent, pendant l'embryogenèse, les fonctions du mésenchyme sont primordiales et s'exercent par la génération de signaux régulateurs qui activent la prolifération et la différenciation régionales des cellules épithéliales progénitrices. Les cellules mésenchymateuses embryonnaires produisent des facteurs de croissance tels que HGF-β, HGF-β et CSF, pour lesquels les cellules progénitrices parenchymateuses possèdent des récepteurs correspondants. Dans les tissus matures différenciés d'un organisme adulte, le réseau cellulaire stromal génère également des signaux pour maintenir la viabilité et la prolifération des cellules progénitrices d'origine non mésenchymateuse. Cependant, le spectre des signaux de régulation stromale dans l'ontogenèse postnatale est différent (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) et vise à assurer la régénération physiologique ou la réparation des zones tissulaires endommagées. De plus, les caractéristiques spectrales des facteurs de régulation stromale dans chaque type de tissu et même au sein d'un même organe sont différentes. En particulier, l'hématopoïèse et la lymphopoïèse avec prolifération et différenciation des cellules hématopoïétiques et immunocompétentes ne se produisent que dans certains organes, au sein desquels le microenvironnement stromal opère, fournissant les conditions pour la maturation des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes. La capacité des cellules hématopoïétiques et lymphoïdes à repeupler un organe donné, à proliférer et à mûrir dans ses niches microstructurales dépend des facteurs de régulation du microenvironnement.

Parmi les composants de la matrice extracellulaire produits par les cellules souches mésenchymateuses multipotentes, il convient de noter la fibronectine, la laminine, le collagène et les protéoglycanes, ainsi que le CD44 (récepteur de l'acide hyaluronique et de l'ostéopontine), qui jouent un rôle majeur dans l'organisation des interactions intercellulaires et la formation de la matrice extracellulaire dans la moelle osseuse et le tissu osseux. Il a été démontré que les cellules souches mésenchymateuses multipotentes de la moelle osseuse créent un microenvironnement stromal qui fournit des signaux inducteurs et régulateurs non seulement aux CSM, mais aussi aux progéniteurs hématopoïétiques et aux autres cellules souches non mésenchymateuses de la moelle osseuse. Il est connu que la participation des CSM à l'hématopoïèse est déterminée par leur capacité à se différencier en cellules stromales qui soutiennent l'hématopoïèse, et ce signal instructif est reçu par les CSM directement des cellules souches hématopoïétiques. C'est pourquoi, en culture, le réseau de cellules progénitrices stromales sert de base nourricière au développement de tous les clones de cellules hématopoïétiques.

Dans un organisme mature, l'intensité de l'hémo- et de la lymphopoïèse est en équilibre dynamique avec la « dépense » des cellules sanguines matures et des cellules du système immunitaire en périphérie. Le renouvellement des cellules stromales de la moelle osseuse et des organes lymphoïdes étant extrêmement rare, aucune restructuration significative de leurs structures stromales n'a lieu. Le système peut être déséquilibré par une lésion mécanique de l'un des organes de l'hémo- ou de la lymphopoïèse, ce qui entraîne des modifications séquentielles uniformes qui affectent non seulement les éléments hématopoïétiques ou lymphoïdes, mais aussi les structures stromales de l'organe endommagé. Lors du processus de régénération réparatrice, la base stromale se forme en premier, puis est repeuplée par des cellules hématopoïétiques ou immunocompétentes. Ce fait, bien connu, fait de la régénération post-traumatique un modèle pertinent pour l'étude du microenvironnement stromal des organes hématopoïétiques. En particulier, la vidange mécanique de la cavité médullaire des os tubulaires est utilisée pour étudier la régénération réparatrice de la moelle osseuse (curetage), qui permet de retirer rapidement et efficacement le tissu hématopoïétique de son état d'équilibre dynamique. L'étude des processus de régénération réparatrice des composants hématopoïétiques et stromaux de la moelle osseuse après vidange mécanique de la cavité médullaire du tibia chez le cobaye a révélé l'absence de corrélation directe entre les indices de régénération des cellules hématopoïétiques et stromales (nombre de cellules hématopoïétiques, concentration et nombre de cellules progénitrices stromales). De plus, il s'est avéré qu'une augmentation de la population de cellules progénitrices stromales se produit plus tôt après le curetage, et que les fibroblastes stromaux eux-mêmes deviennent phosphatase-positifs, ce qui est typique du tissu ostéogène. Il a également été établi que le curetage de 3 à 5 os tubulaires conduit à la croissance de cette population cellulaire dans la moelle osseuse des os non opérés et même dans la rate, qui chez les cobayes est un organe exclusivement lymphopoïétique.

Le tableau morphologique des processus de réparation dans la moelle osseuse des tibias curés de cobayes correspond globalement aux données décrites dans la littérature, obtenues lors d'expériences sur des animaux d'autres espèces. La dynamique des changements survenant après l'ablation du tissu hématopoïétique est identique pour toutes les espèces animales, la différence ne concernant que les paramètres temporels. Morphologiquement, l'ordre des phases de restauration de l'hématopoïèse dans la cavité médullaire vidée comprend des processus successifs d'organisation du caillot sanguin, de formation de tissu osseux fibreux grossier, de sa résorption, de développement de sinusoïdes et de formation d'un stroma réticulaire, qui est ensuite repeuplé par des éléments hématopoïétiques. Dans ce cas, le nombre de cellules hématopoïétiques progénitrices lors du processus de régénération du tissu médullaire augmente parallèlement à l'augmentation du contenu en cellules souches hématopoïétiques.

Yu. Gerasimov et ses co-auteurs (2001) ont comparé l'évolution du nombre de cellules hématopoïétiques et de cellules progénitrices stromales au cours des différentes phases du processus de régénération. Il s'est avéré que les variations quantitatives des cellules de la moelle osseuse dans l'os cureté correspondent à la dynamique des caractéristiques morphologiques de la régénération. Les auteurs associent la diminution du contenu cellulaire du régénéré au cours des trois premiers jours à la mort des cellules hématopoïétiques due à l'effet défavorable du microenvironnement créé par la prolifération du tissu réticulaire dans la moelle osseuse préservée au niveau de l'épiphyse, ainsi qu'à la formation de foyers de tissu ostéoïde dans cette dernière et aux lésions vasculaires lors du curetage. Du 7e au 12e jour, une augmentation du taux de cellules nucléées coïncide avec l'apparition de foyers individuels d'hématopoïèse myéloïde dans les zones de prolifération des éléments stromaux. Au 20e jour, des zones importantes de moelle osseuse régénérée et des sinus bien développés apparaissent, ce qui s'accompagne d'une augmentation significative du nombre total de cellules. Cependant, le nombre d'éléments hématopoïétiques durant cette période représente 68 % du niveau témoin. Cela concorde avec les données publiées précédemment selon lesquelles le nombre de cellules hématopoïétiques après curetage n'atteint la normale qu'entre le 35e et le 40e jour postopératoire.

Au début de la période post-traumatique, la principale source de restauration de l'hématopoïèse réside dans les éléments cellulaires locaux préservés lors du curetage. Aux stades ultérieurs, la principale source de régénération du tissu hématopoïétique de la moelle osseuse réside dans les cellules souches qui repeuplent les zones stromales libres. Quant aux différentes catégories de cellules stromales (endothéliales, réticulaires et ostéogéniques), les sources qui assurent leur formation lors de la réorganisation de la cavité médullaire restent floues. Les résultats de l'étude de Yu. V. Gerasimov et ses co-auteurs (2001) indiquent que dans la moelle osseuse préservée après curetage, la concentration de cellules formant des colonies de fibroblastes est significativement plus élevée que dans la moelle osseuse normale. Les auteurs pensent que le curetage entraîne un lavage sélectif plus intensif des cellules hématopoïétiques que les cellules stromales formant des colonies, qui participent à la formation du stroma et sont plus fortement associées à sa substance principale que les cellules hématopoïétiques.

La dynamique de variation du nombre de cellules formant des colonies de fibroblastes est corrélée à l'intensité des processus d'ostéogenèse, à la résorption ultérieure des travées osseuses et à la formation du stroma réticulaire, peuplé de cellules hématopoïétiques. La plupart des cellules progénitrices du stroma, dans les conditions de régénération spécifiées, forment du tissu osseux fibreux grossier et du stroma réticulaire. En cas de fractures fémorales sous ostéosynthèse prolongée, la concentration et le nombre de cellules formant des colonies de fibroblastes augmentent dès le cinquième jour dans la zone de régénération, et sont multipliés par six pendant la période de formation osseuse intensive. Il est connu que les cellules de la moelle osseuse formant des colonies de fibroblastes ont des propriétés ostéogéniques. Le nombre de cellules progénitrices du stroma augmente avant la colonisation du territoire de moelle osseuse curé par les cellules hématopoïétiques. Ceci concorde avec les données selon lesquelles les cellules stromales contribuent à la formation du microenvironnement hématopoïétique. Apparemment, la création d'un microenvironnement hématopoïétique correspond à un certain niveau de régénération du tissu stromal, et le nombre de cellules hématopoïétiques augmente avec l'expansion de la plate-forme stromale adaptée à l'hématopoïèse.

Les données des auteurs sont particulièrement intéressantes: immédiatement après le curetage, le nombre de cellules souches stromales augmente dans les parties éloignées du squelette. À partir de la sixième heure et jusqu'au vingtième jour inclus, on observe une multiplication par plus de deux de la concentration et du nombre de cellules formant des colonies de fibroblastes dans le tibia controlatéral. Le mécanisme de ce phénomène est probablement lié au fait qu'une lésion médullaire massive entraîne la formation d'un grand nombre de caillots sanguins, avec destruction simultanée d'un nombre important de plaquettes et libération dans le sang du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), connu pour favoriser la prolifération des cellules formant des colonies de fibroblastes situées dans l'organisme en dehors du pool prolifératif. Lors d'expériences sur des lapins, l'administration locale de CSM favorise la restauration du tissu cartilagineux de l'articulation du genou lésée chirurgicalement, ce qui peut être associé à la formation de chondrocytes provenant des CSM injectées. Cependant, la régénération réparatrice des lésions osseuses chez le rat de laboratoire est significativement améliorée par l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses enfermées dans une structure en céramique. Par conséquent, on peut supposer que, si ce n'est pas le RBOC, un autre facteur provenant de cellules stromales endommagées exerce un effet stimulant à distance sur la prolifération des cellules progénitrices mésenchymateuses dans les zones intactes de la moelle osseuse et stimule leur migration vers la zone affectée. Ceci est contredit par les données de la littérature des années précédentes indiquant que les cellules stromales responsables du microenvironnement, contrairement aux cellules hématopoïétiques, ne sont pas capables de migration et proviennent de sources locales.

Néanmoins, les résultats de l'étude de Yu. Gerasimov et ses co-auteurs (2001) indiquent que le traumatisme mécanique provoque non seulement une restructuration brutale du tissu stromal de l'os cureté, mais également des modifications significatives du stroma des os intacts distants, c'est-à-dire qu'il existe une réponse systémique du tissu stromal au traumatisme local. De plus, en cas de polytraumatisme (curetage multiple), cette réaction est renforcée et observée non seulement dans l'os opéré et les parties distantes du squelette, mais aussi dans les organes lymphoïdes, en particulier dans la rate. Le mécanisme d'une telle réponse systémique du tissu stromal de la moelle osseuse et de la rate au traumatisme local et au polytraumatisme reste inconnu. On suppose que ce processus est associé à l'action d'un facteur humoral sécrété par le stroma mésenchymateux de la cavité médullaire de la moelle osseuse. La possibilité de la production par les cellules stromales de la moelle osseuse et de la rate d'un facteur humoral non spécifique d'organe responsable de la prolifération des cellules qui forment des colonies de fibroblastes est démontrée par les données sur leur activité de stimulation des colonies dans les cultures monocouches de moelle osseuse.

À cet égard, il convient de noter qu'avec l'administration systémique de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes, leurs dérivés repeuplent non seulement la moelle osseuse, mais aussi d'autres tissus, ce qui est utilisé, notamment, en thérapie génique. Il a été démontré qu'avec l'administration intraveineuse de grandes quantités de CSM avec un génome de type sauvage à des souris présentant une mutation du gène du collagène I, les cellules du donneur remplacent jusqu'à 30 % des cellules du tissu osseux et cartilagineux des receveurs, et que les cellules souches mésenchymateuses de souris transfectées sécrétant de l'IL-3 humaine soutiennent efficacement l'hématopoïèse pendant 9 mois en cas de leur administration simultanée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris immunodéficientes.

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Modification génétique des cellules souches mésenchymateuses

Parmi les succès de la modification génétique expérimentale des CSM, il convient de noter la transfection du gène du facteur IX dans des CSM humaines, suivie du transfert des cellules transfectées à des souris immunodéficientes, ce qui a conduit à l'apparition de facteur B antihémophile dans le sang pendant 8 semaines après la transplantation. Dans cette expérience, une modification post-traductionnelle du facteur IX par la y-glutamyl carboxylase a été réalisée dans les cellules transfectées. La transduction des CSM par un vecteur rétroviral codant pour le facteur IX humain a été moins réussie: l'administration ultérieure de ces cellules à un chien atteint d'hémophilie B a permis d'obtenir un taux thérapeutique de facteur IX, maintenant une hémostase de coagulation normale, pendant seulement 12 jours.

La transplantation de cellules souches mésenchymateuses dans le parenchyme cérébral animal a montré que les cellules immatures du donneur se transforment en populations neuronales et gliales. La greffe de dérivés neuronaux de tissu mésenchymateux de donneur sain permet théoriquement de corriger les anomalies génétiques du métabolisme cérébral chez les patients atteints de la maladie de Gaucher et d'autres troubles du métabolisme des lipides, des gangliosides ou des glucides.

La recherche expérimentale des conditions de transdifférenciation des cellules souches stromales de moelle osseuse en cellules progénitrices des tissus nerveux et hépatiques est en cours. Les chercheurs se concentrent sur les combinaisons d'inducteurs de différenciation et de milieux conditionnés spéciaux. Plus précisément, pour isoler la culture primaire de cellules stromales, des cellules de moelle osseuse lavées et remises en suspension dans un milieu de culture DMEM/F12 (1/1) contenant 10 % de sérum de veau fœtal sont ensemencées à une densité de 200 000/cm². Après 24 heures, les cellules non adhérentes sont retirées et les cellules fibroblastiques fixées au plastique sont cultivées pendant une semaine. Pour la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse en neuroblastes, on utilise un milieu conditionné obtenu par culture pendant trois jours d'une culture primaire de fibroblastes embryonnaires de souris, ainsi qu'un milieu DMEM/F12 (1/1) additionné de 2 % de sérum de veau fœtal et de 20 ng/ml de NF ou de 10-6 M d'acide rétinoïque (neuroinducteurs utilisés pour la différenciation neurale des cellules souches embryonnaires de souris et humaines). La différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse en précurseurs hépatocytaires est induite dans un milieu conditionné créé suite à la culture pendant trois jours d'une culture primaire de cellules hépatiques embryonnaires de souris dans un milieu DMEM/F12 (1/1) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal.

Il convient de noter à nouveau que les cellules formant des colonies du stroma médullaire sont hétéromorphes et peuvent être divisées en deux types. Le premier type comprend des cellules de type fibroblaste qui forment des filopodes avec de gros noyaux et un ou deux nucléoles. Le second type est représenté par de petites cellules fusiformes. Lors de la culture de cellules des deux types dans un milieu conditionné obtenu sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires primaires de souris, des cellules similaires aux neuroblastes apparaissent en culture entre le 3e et le 4e jour. À ce stade, elles ont le plus souvent une forme fusiforme avec un ou deux longs prolongements se terminant par des filopodes. Les cellules pyramidales ou étoilées à de courtes dendrites sont moins fréquentes. Les dendrites de certains neuroblastes présentent des expansions caractéristiques (bourgeons de croissance) et des branches dans leur partie distale, tandis que d'autres présentent des cônes de croissance distincts avec des filopodes, à travers lesquels les dendrites se développent. Des caractéristiques morphologiques similaires (bourgeons et cônes de croissance avec filopodes) inhérentes aux neuroblastes se différenciant en neurones ont été décrites en détail dans des études sur la neurogenèse. Sur cette base, certains auteurs concluent que les cellules trouvées en culture sont des neuroblastes. En particulier, E. Shchegelskaya et ses coauteurs (2002), après avoir cultivé une culture primaire de cellules stromales pendant deux semaines dans un milieu conditionné changé tous les 3 à 4 jours, ont constaté que certaines cellules proliféraient tout en conservant un état indifférencié. Extérieurement, ces cellules ressemblaient à des fibroblastes et ont été détectées en culture avec des neuroblastes en cours de différenciation. La majorité des cellules (environ 80 %) étaient à différents stades de différenciation en cellules du tissu nerveux, principalement en neurones. Les prolongements dendritiques de ces cellules étaient en contact étroit les uns avec les autres, de sorte que les cellules formaient progressivement des sections du réseau nerveux sur le substrat sous la forme de longs brins multicellulaires. Les prolongements dendritiques des neuroblastes sont devenus significativement plus longs, certains d'entre eux dépassant de 8 à 10 fois la longueur du corps neuronal lui-même. La proportion de cellules pyramidales et étoilées a progressivement augmenté. Les dendrites des cellules étoilées se sont ramifiées. Selon les auteurs, la différenciation plus tardive des cellules pyramidales et étoilées par rapport aux cellules fusiformes correspond à la séquence des étapes de la neurogenèse normale chez l'animal. Par conséquent, les auteurs concluent que les cellules souches stromales de la moelle osseuse subissent une neurogenèse induite, au cours de laquelle les trois principaux types de neurones sont formés à partir de neuroblastes in vitro. Des précurseurs de cellules nerveuses ont également été détectés lors de la culture de cellules stromales de moelle osseuse pendant 3 à 4 jours dans un milieu contenant 2 % de sérum fœtal et 20 ng/ml de LIF. Cependant, dans ce cas, les cellules souches se sont divisées très lentement; la différenciation des neuroblastes n'a eu lieu que dans 30 % des cas et elles n'ont pas formé de réseaux neuronaux. En utilisant l'acide rétinoïque comme l'un des inducteurs de la différenciation des cellules nerveuses, les auteurs ont obtenu jusqu'à 25 à 30 % de cellules nerveuses dans la culture,Les éléments gliaux étant majoritaires: astrocytes et oligodendrocytes. Les neurones ne constituaient qu’un tiers de l’ensemble des cellules nerveuses, bien qu’ils fusiformes, pyramidaux et étoilés. Au sixième jour de culture des cellules stromales en milieu contenant de l’acide rétinoïque, les cellules nerveuses se sont différenciées et des axones ont été découverts dans les neurones pyramidaux individuels. Ces axones, qui apparaissent plus tard que les processus dendritiques lors de la neuroontogenèse normale, apparaissent plus tard que la formation des prolongements dendritiques. Selon les auteurs, malgré le faible rendement en cellules nerveuses, la méthode d’induction par l’acide rétinoïque présente des avantages: les oligodendrocytes et les astrocytes assurent des fonctions myélinisantes et nutritionnelles lors de la croissance des dendrites et des axones et sont nécessaires à la formation normale du tissu nerveux. Par conséquent, pour la réparation des zones endommagées in vivo, il est préférable d’utiliser une suspension de neurones enrichie en cellules gliales.

Dans la deuxième série d'expériences, les auteurs ont tenté d'induire la différenciation de cellules stromales de moelle osseuse en cellules hépatiques. Après trois jours de culture de cellules souches stromales de moelle osseuse dans un milieu conditionné obtenu par incubation d'hépatocytes embryonnaires de souris, de grandes cellules sphériques ont été trouvées, souvent binucléaires, avec des inclusions cytoplasmiques de tailles variables. Ces cellules étaient à différents stades de différenciation et différaient par leur taille, leur nombre de noyaux et leurs inclusions dans le cytoplasme. Du glycogène a été détecté dans la plupart de ces cellules, ce qui a permis aux auteurs de les identifier comme des cellules précurseurs d'hépatocytes. Aucune cellule similaire aux neuroblastes n'ayant été trouvée dans la culture, il a été conclu que le milieu conditionné obtenu par culture d'hépatocytes embryonnaires était dépourvu de facteurs de différenciation des cellules nerveuses et, à l'inverse, contenait des facteurs induisant la différenciation des cellules stromales de moelle osseuse en cellules précurseurs d'hépatocytes. En conclusion, les auteurs suggèrent la présence d'une pluripotence dans les cellules stromales de la moelle osseuse, puisqu'elles se différencient in vitro en cellules nerveuses ou hépatiques en fonction des milieux conditionnés et des inducteurs spécifiques utilisés.

Certaines études ont effectivement démontré la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse en cardiomyocytes, en cellules cartilagineuses, osseuses et nerveuses. Il est prouvé que, parmi les cellules de la moelle osseuse, il existe des populations de cellules souches capables de se différencier en hépatocytes. À la lumière de ces données, les résultats des expériences susmentionnées sur des souris peuvent encore être considérés comme une confirmation supplémentaire de la présence dans la moelle osseuse de cellules souches mésenchymateuses pluripotentes capables de se différencier en cellules de divers tissus d'un organisme adulte.

Greffe de cellules souches mésenchymateuses

En transplantation clinique, les cellules souches mésenchymateuses humaines peuvent être utilisées pour assurer l'expansion des cellules souches hématopoïétiques, ainsi que de leurs descendants précoces pré-engagés. En particulier, l'introduction de cellules souches hématopoïétiques autologues et de CSM chez les patients cancéreux après une chimiothérapie à haute dose accélère la restauration du nombre de neutrophiles et de plaquettes dans le sang périphérique. Les greffes allo- et autologues de cellules souches mésenchymateuses sont utilisées pour traiter le myélome multiple, l'anémie aplasique et la thrombopénie spontanée, maladies associées à une anomalie primaire du stroma du tissu hématopoïétique. L'efficacité de la thérapie cellulaire en pathologie oncohématologique est souvent supérieure grâce à l'introduction simultanée de cellules souches stromales et hématopoïétiques. Cela se traduit par une réduction de la période postopératoire de restauration de l'hématopoïèse et une diminution du nombre d'issues fatales dues à la destruction non sélective des cellules cancéreuses régionales et circulantes, entraînant la mort des cellules progénitrices hématopoïétiques du patient. Les perspectives d'utilisation des CSM et d'autres cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes en pratique clinique s'expliquent par leur relative facilité d'obtention à partir d'aspirats de moelle osseuse, leur expansion en culture et la transfection de gènes thérapeutiques. Parallèlement, l'implantation locale de cellules progénitrices mésenchymateuses multipotentes peut être utilisée pour compenser les défauts tissulaires locaux. En cas de dysfonctionnements systémiques des tissus d'origine mésenchymateuse, leur introduction dans la circulation sanguine n'est pas exclue.

Les auteurs des travaux analysant les perspectives d'utilisation des CSM pour la transplantation locale, systémique et la thérapie génique du point de vue de la biologie des cellules stromales sont plus prudents dans leur raisonnement. La moelle osseuse postnatale est traditionnellement considérée comme un organe composé de deux systèmes principaux de lignées cellulaires clairement définies: le tissu hématopoïétique lui-même et le stroma de soutien qui lui est associé. Par conséquent, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont d'abord été considérées exclusivement comme une source de base stromale pour la production de facteurs régulateurs du microenvironnement hématopoïétique. L'attention des chercheurs s'est ensuite portée sur l'étude du rôle des CSM comme source de cellules souches des tissus squelettiques. Les données les plus récentes indiquent un potentiel inattendu de différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse avec formation de tissu nerveux ou musculaire. En d'autres termes, les cellules souches mésenchymateuses présentent une plasticité transgermique, c'est-à-dire la capacité de se différencier en types cellulaires phénotypiquement différents des cellules du tissu d'origine. Parallèlement, certains aspects de la biologie des cellules stromales de la moelle osseuse demeurent flous et non résolus, tant sur le plan biologique général que sur le plan individuel, notamment l'identification, la nature, l'origine, le développement et la fonction in vivo des cellules stromales de la moelle osseuse, ainsi que le potentiel de différenciation admissible ex vivo et les possibilités d'utilisation thérapeutique in vivo. Les données obtenues sur le potentiel des CSM, ainsi que les résultats des études sur le potentiel régénérateur d'autres cellules souches, sont en contradiction flagrante avec les dogmes établis en biologie.

Cultivées à faible densité, les cellules souches stromales de moelle osseuse forment des colonies distinctes, chacune issue d'une seule cellule progénitrice. Le pourcentage de cellules progénitrices stromales dans les cellules nucléées de moelle osseuse, déterminé par leur capacité à former des colonies, dépend fortement des conditions de culture et de l'espèce de CSM. Par exemple, chez les rongeurs, la présence de cellules nourricières de moelle osseuse irradiées et de sérum dans la culture est absolument nécessaire pour obtenir le nombre maximal de cellules progénitrices stromales, tandis que chez l'homme, l'efficacité de formation de colonies des cellules souches mésenchymateuses est indépendante du milieu nourricier et du milieu de culture. Le nombre de facteurs mitogènes connus qui stimulent la prolifération des cellules progénitrices stromales est limité. Il s'agit notamment du PDGF, de l'EGF, du FGF, du TGF-β et de l'IGF-1. Dans des conditions de culture optimales, les lignées polyclonales de CSM peuvent supporter plus de 50 divisions cellulaires in vitro, ce qui permet d'obtenir des milliards de cellules stromales de moelle osseuse à partir de 1 ml de leur aspirat.

Cependant, la population de cellules stromales de la moelle osseuse est hétérogène, ce qui se manifeste par une variabilité de la taille des colonies, des taux de formation différents et une variété de morphologie cellulaire, allant des cellules fusiformes de type fibroblaste aux grandes cellules plates. Au cours du développement de ces cultures, une hétérogénéité phénotypique est également observée après 20 jours. Certaines colonies se caractérisent par une expression élevée de phosphatase alcaline, d'autres ne l'expriment pas du tout, et les colonies du troisième type sont phosphatase-positives dans la région centrale et phosphatase-négatives en périphérie. Les colonies individuelles forment des nodules de tissu osseux (le début de la minéralisation de la matrice est marqué par une coloration au rouge d'alizarine ou au calcium selon Van Koss). Dans d'autres colonies, une accumulation de graisse se produit, identifiée par une coloration G au rouge huile. Plus rarement, les colonies de cellules souches mésenchymateuses forment des cartilages colorés au bleu alcian.

Après transplantation ectopique chez l'animal de laboratoire, les lignées polyclonales de MGK forment un os ectopique avec un stroma réticulaire associé à la myélopoïèse et aux adipocytes, et, plus rarement, au tissu cartilagineux. Lors de la transplantation de lignées monoclonales de cellules stromales de moelle osseuse, un chimérisme est parfois observé: l'os de novo est constitué de cellules osseuses, contient le stroma et les adipocytes du donneur, tandis que les cellules de la lignée hématopoïétique et du système vasculaire proviennent du receveur.

Les résultats de ces études confirment la nature souche de la cellule progénitrice stromale de moelle osseuse à partir de laquelle la lignée clonale est issue. Ils indiquent également que toutes les cellules clonogéniques en culture ne sont pas véritablement des cellules souches multipotentes. Certains chercheurs pensent, et nous partageons leur avis, que les informations les plus fiables sur le potentiel de différenciation réel des clones individuels ne peuvent être obtenues qu'in vivo après transplantation, et non en déterminant le phénotype de leurs dérivés in vitro. L'expression en culture de marqueurs phénotypiques de l'ostéo-, de la chondro- ou de l'adipogenèse (déterminés par l'ARNm ou par des techniques histochimiques), et même la production de matrice minéralisée, ne reflètent pas le degré de pluripotence d'un clone individuel in vivo. Par conséquent, l'identification de cellules souches dans un groupe de cellules stromales n'est possible qu'a posteriori, dans les conditions appropriées d'un test de transplantation biologique. En particulier, la chondrogenèse est très rarement observée dans les systèmes de transplantation ouverts, tandis que la formation de cartilage est loin d'être rare dans les systèmes fermés tels que les chambres de diffusion ou les cultures in vitro de micromasse de cellules stromales, où une faible tension locale en oxygène est obtenue, favorisant la formation de tissu cartilagineux. Par conséquent, même la technique de transplantation, ainsi que les conditions de culture in vitro non spécifiques, affectent significativement l'amplitude de différenciation des CSM.

La transplantation expérimentale dans des conditions expérimentales spécifiques constitue la référence pour déterminer le potentiel de différenciation des cellules stromales de moelle osseuse et un élément clé de leur identification. Historiquement, les études sur la transplantation de cellules stromales de moelle osseuse sont associées au problème général de la transplantation de moelle osseuse. Il a été établi que le microenvironnement hématopoïétique est créé par la transplantation de lignées de cellules stromales de moelle osseuse et permet le développement ectopique du tissu hématopoïétique dans la zone de transplantation. L'origine du microenvironnement chez le donneur et du tissu hématopoïétique chez l'hôte permet de considérer l'os ectopique comme une véritable transplantation de moelle osseuse « inversée ». La transplantation locale de cellules stromales de moelle osseuse favorise une correction efficace des défauts osseux, plus prononcée qu'avec la régénération réparatrice spontanée. Plusieurs études précliniques sur des modèles expérimentaux ont démontré de manière convaincante la possibilité d'utiliser les greffes de cellules stromales de moelle osseuse en orthopédie, bien que des travaux et des analyses plus approfondis soient nécessaires pour optimiser ces méthodes, même dans les cas les plus simples. En particulier, les conditions optimales pour l'expansion des cellules stromales ostéogéniques ex vivo n'ont pas encore été établies, la structure et la composition du support idéal, ainsi que le nombre de cellules nécessaires à la régénération osseuse volumétrique, restent sous-développés.

Outre l'utilisation de cellules stromales de moelle osseuse expansées ex vivo pour la régénération de tissus d'origine mésenchymateuse, la plasticité peu orthodoxe des CSM ouvre des perspectives d'application pour la régénération de cellules nerveuses ou l'acheminement de produits géniques vers le SNC. En principe, cela simplifie la thérapie cellulaire des lésions du système nerveux, puisqu'il n'est pas nécessaire d'obtenir des cellules souches neurales humaines autologues. Des applications potentielles des cellules de moelle osseuse pour la génération de cardiomyocytes et de cellules progénitrices myogéniques d'origine stromale véritable et extrastromale ont été décrites.

Des expériences sont menées sur la transplantation systémique de cellules stromales de moelle osseuse pour le traitement de maladies squelettiques courantes. Il ne fait aucun doute que les cellules stromales de moelle osseuse sont la population responsable des troubles génétiques associés à ces maladies, comme l'illustre bien le transfert vectoriel d'informations génétiques par ces cellules, conduisant à la formation de tissu osseux pathologique chez les animaux de laboratoire. Cependant, la capacité des cellules stromales à s'implanter, se greffer, proliférer et se différencier dans les os squelettiques après introduction dans la circulation sanguine générale n'a pas encore été démontrée.

Cela s'explique en partie par le fait que, lors d'une greffe de moelle osseuse standard, le stroma n'est pas transplanté avec le tissu hématopoïétique. Par conséquent, des critères stricts pour évaluer la réussite de la greffe de cellules stromales administrées par voie systémique restent à élaborer. Il convient de rappeler que la présence de gènes marqueurs dans des extraits tissulaires ou l'isolement de cellules provenant d'un donneur en culture n'indique pas la greffe des cellules, mais seulement leur survie. Même l'injection intra-artérielle de cellules stromales de moelle osseuse dans un membre de souris peut entraîner une greffe quasiment nulle, malgré la présence de cellules provenant d'un donneur en grand nombre dans la microvascularisation de la moelle osseuse. Malheureusement, ces cellules sont généralement qualifiées de « greffées » simplement sur la base de la détection de gènes marqueurs de cellules du donneur en culture ex vivo. De plus, des preuves convaincantes de l'intégration à long terme de cellules provenant d'un donneur différenciées et fonctionnellement actives dans les tissus étudiés doivent être fournies. Dans de nombreuses publications traitant de la greffe de cellules stromales de moelle osseuse dans le squelette, l'absence de données claires de ce type est frappante. Il convient toutefois de noter que certaines expériences animales rigoureuses ont effectivement établi une greffe limitée mais réelle de cellules progénitrices stromales après leur administration systémique.

Ces données concordent avec les résultats d'études sur la possibilité d'acheminer des cellules progénitrices myogéniques de la moelle osseuse vers le muscle via le système vasculaire. Cependant, il ne faut pas oublier que les tissus squelettiques et musculaires se forment au cours du développement et de la croissance grâce à des mouvements cellulaires extravasculaires utilisant des processus de migration n'impliquant pas la circulation sanguine. S'il existe une voie circulatoire indépendante pour acheminer les cellules progénitrices vers les tissus en phase solide, est-il possible de supposer l'existence de cellules progénitrices mésenchymateuses circulantes physiologiquement? Quelle est l'origine de ces cellules dans l'organisme en développement et postnatal, et comment pénètrent-elles la paroi vasculaire? La réponse à ces questions semble absolument nécessaire et requiert une analyse préclinique minutieuse. Même après avoir trouvé des réponses à ces questions, les aspects cinétiques problématiques associés à la croissance squelettique et au remodelage du tissu conjonctif resteront non résolus. Parallèlement, le traitement des troubles de l'ostéogenèse par le remplacement de la population entière de cellules progénitrices squelettiques mutées par des éléments stromaux sains semble constituer une réelle perspective clinique. Dans ce cas, les zones de fractures locales ou les déformations dues à l'ostéogenèse pathologique, ainsi que les modifications destructrices du tissu osseux, peuvent être corrigées grâce à des cellules souches stromales cultivées in vitro. Il est donc conseillé d'axer les recherches futures sur les problèmes de transformation ou de correction génétique des cellules progénitrices ostéogéniques mutées autologues ex vivo.

Le génie génétique cellulaire, à court terme ou permanent, est devenu la base de la biologie cellulaire et moléculaire, source de nombreuses découvertes scientifiques concernant le rôle des protéines individuelles dans le métabolisme cellulaire in vitro et in vivo. L'utilisation des technologies moléculaires pour la correction des pathologies héréditaires et des maladies humaines est très prometteuse pour la médecine pratique, car les propriétés des cellules souches stromales de moelle osseuse permettent de développer des schémas de transplantation uniques pour la correction des maladies génétiques du squelette. Parallèlement, les cellules précurseurs mésenchymateuses peuvent être facilement obtenues auprès du futur receveur; elles se prêtent à la manipulation génétique et sont capables de se multiplier en grande quantité et rapidement. L'utilisation de cellules souches mésenchymateuses permet d'éviter les limitations et les risques liés à l'administration directe de matériel génétique au patient par le biais de vecteurs intravasculaires. Une stratégie similaire est applicable aux cellules souches embryonnaires, mais les cellules stromales de moelle osseuse postnatales autologues constituent un matériel plus préférable, car leur introduction exclut d'éventuelles complications immunologiques post-transplantation. Pour obtenir un effet à court terme, par exemple pour accélérer la régénération osseuse, la méthode la plus optimale est la modification génétique des cellules souches mésenchymateuses par électroporation, fusion chimique, lipofection, plasmides et constructions adénovirales. En particulier, la transfection virale BMP-2 dans les cellules stromales de moelle osseuse s'est avérée efficace pour accélérer la régénération osseuse lors de polytraumatismes expérimentaux. La création de constructions de vecteurs adénoviraux est préférable en raison de son absence de toxicité. Cependant, la modification génétique des cellules stromales de moelle osseuse dans ce cas se caractérise par une stabilité extrêmement faible. De plus, les cellules stromales de moelle osseuse transformées normales nécessitent l'utilisation de vecteurs porteurs d'informations génétiques dix fois plus infectieux que les autres types cellulaires, ce qui augmente significativement le pourcentage de mortalité des cellules transfectées.

Le traitement des maladies récessives causées par une activité biologique faible ou nulle de certains gènes nécessite une modification à long terme ou permanente des cellules souches mésenchymateuses, ce qui nécessite l'utilisation de virus adéno-associés, de rétrovirus, de lentivirus ou de chimères adéno-rétrovirales. Les régions de transport de ces virus sont capables de transférer de grands transfects d'ADN (jusqu'à 8 kb). La littérature scientifique a déjà décrit l'activité biologique exogène de cellules stromales de moelle osseuse transfectées avec des constructions rétrovirales codant pour la synthèse de molécules régulatrices et marqueurs – IL-3, CD2, facteur VIII, ainsi que d'enzymes impliquées dans la synthèse de L-DOPA. Cependant, même dans ces études, les auteurs soulignent un certain nombre de limites qui doivent être surmontées avant l'application pratique de cette technologie. Le premier problème est d'optimiser le processus de modification des CSM ex vivo. Il est connu qu'une prolifération à long terme (3 à 4 semaines) des cellules stromales de moelle osseuse in vitro réduit leur transfection. Parallèlement, pour atteindre un niveau élevé de modification génétique des CSM, plusieurs cycles de transfection sont nécessaires. Le deuxième problème est lié à la durée d'expression génique thérapeutique, qui ne dépasse pas encore quatre mois. Une diminution naturelle de l'expression génique effective est due à l'inactivation du promoteur et à la mort des cellules modifiées. Compte tenu des perspectives générales de transfert d'information génétique par cellules souches mésenchymateuses, les résultats d'études préliminaires indiquent la nécessité d'optimiser davantage les méthodes de transfection ex vivo, de choisir un promoteur adéquat régulant l'activité biologique dans la direction souhaitée et d'accroître la capacité des cellules stromales médullaires modifiées à s'auto-entretenir in vivo après transplantation. Il convient de noter que l'utilisation de constructions rétrovirales pour modifier les cellules stromales médullaires dans la direction souhaitée ne nécessite pas toujours leur greffe obligatoire. Les cellules souches mésenchymateuses transfectées peuvent assurer une fonction corrective dans un contexte de résidence stable et sans incorporation physique active et fonctionnement obligatoires dans le tissu conjonctif. Dans ce cas, il faut les considérer comme une mini-pompe biologique produisant in vivo un facteur dont la déficience détermine la manifestation d'une pathologie génétique.

L'utilisation de cellules stromales de moelle osseuse transformées pour le traitement d'une pathologie génétique dominante, caractérisée par l'expression d'un gène présentant une activité biologique pathologique ou anormale, est beaucoup plus problématique, car il est alors nécessaire de bloquer le transfert ou la mise en œuvre d'informations génétiques altérées. L'une des méthodes de génie génétique est la recombinaison homologue de cellules souches embryonnaires afin de créer des animaux transgéniques. Cependant, le taux extrêmement faible de recombinaison homologue, combiné aux difficultés d'identification, de séparation et d'expansion de ces recombinants, ne devrait pas favoriser la généralisation de cette méthode dans un avenir proche, même si de nouvelles technologies sont développées. La deuxième approche en thérapie génique de la pathologie dominante repose sur la correction automatique de l'ADN endommagé. Les mutations génétiques peuvent être corrigées par l'introduction d'ADN exogène de la séquence souhaitée (oligonucléotides d'ADN courts ou oligonucléotides ARN/ADN chimériques), qui se lie aux homologues du génome endommagé. La troisième option consiste à bloquer la transmission d’informations pathologiques, ce qui est obtenu grâce à l’utilisation d’oligonucléotides spécialement conçus qui se lient à un gène spécifique pour former une structure hélicoïdale ternaire qui élimine la possibilité de transcription.

Bien que la correction d'une maladie génétique au niveau du génome reste la méthode thérapeutique la plus optimale et privilégiée, l'ARNm constitue également un vecteur prometteur (voire plus accessible) pour bloquer un gène dominant négatif. Les molécules protéiques contenant des oligonucléotides antisens ou des séquences complètes bloquant la liaison de l'ARNm à l'appareil de biosynthèse cellulaire sont utilisées depuis longtemps pour inhiber la traduction et/ou accélérer la dégradation de l'ARNm. De plus, l'ARN double brin induit une dégradation rapide de l'ARNm, dont le mécanisme reste flou. Cependant, il est peu probable que la simple élimination des ARNm transcrits à partir d'un allèle mutant présentant des mutations courtes ou uniques favorise l'expression de l'ARNm de l'allèle normal. Une alternative consiste à utiliser des ribosynthèses en tête de marteau et en épingle à cheveux, qui ont la capacité de se lier à des régions très spécifiques de l'ARNm, induisant ensuite leur clivage et leur inactivation pendant la traduction. L'utilisation de cette méthode dans le traitement de l'ostéogenèse pathologique est actuellement à l'étude. Quelle que soit la cible exacte – éléments génomiques ou cytoplasmiques – le succès des nouvelles technologies de thérapie génique sera déterminé par l’efficacité de l’inclusion des réactifs dans les cellules stromales de la moelle osseuse ex vivo, le choix optimal d’un vecteur spécifique et la capacité stable des cellules souches mésenchymateuses à exprimer les facteurs nécessaires in vivo.

Ainsi, la découverte de cellules souches mésenchymateuses aux propriétés inattendues ouvre un nouveau schéma conceptuel pour le développement de lignées cellulaires. Cependant, des recherches interdisciplinaires supplémentaires sont nécessaires pour comprendre le rôle biologique des cellules souches stromales, leur nature, leur capacité à se transdifférencier ou à se dédifférencier, leur importance physiologique au cours du développement embryonnaire, de la croissance postnatale, de la maturation et du vieillissement, ainsi que dans les maladies humaines.