Cellules souches embryonnaires

La découverte de cellules souches embryonnaires - il n'y avait pas un hasard, et est apparu sur la recherche de sol préparé dans le domaine de la recherche sur la biologie du développement. Le terme «cellule souche» a été introduit en médecine dès 1908 au congrès de la société hématologique de Berlin par Alexander Maksimov en relation avec les cellules hématopoïétiques. Bien avant l'isolement et à la préparation de lignées stables de cellules souches embryonnaires pluripotentes dans le développement précoce du processus de recherche a utilisé terato- souches (cellules-carcinome embryonnaire qui a étudié les mécanismes inconnus de l'embryogenèse, y compris la séquence de l'expression des gènes précoces et produits protéiques de leur travail.

Mais la totipotence du génome humain est-elle irrémédiablement perdue dans le processus de l'évolution? Non, et l'embryogenèse est la preuve. Si tel est le cas, alors quand, en principe, la deuxième voie du développement évolutif sera-t-elle réalisée? Probablement, quand une personne quitte le Cosmos, où les conditions environnementales seront relativement constantes pendant assez longtemps. La perte osseuse (déminéralisation osseuse dans un état d'apesanteur) remodelage très lentement prête et la régénération peuvent être considérés comme la première étape pour processus d'adaptation humaine comme une espèce d'existence dans l'espace. Cependant, le paiement de la deuxième voie du développement évolutif sera différent - la stérilité sera le prix à payer à toutes les cellules de la totipotence et de la plasticité absolue. Alors multipliez-vous dans ce monde de "caméléons évolutionnaires" n'aura pas de méiose, otpochkovaniem. Mais nous vivrons longtemps. L'immortalité de la télomérase est l'immortalité de l'amibe. Dans un organisme multicellulaire, les cellules souches sont le substrat de la longévité quantitative et qualitative.

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Sources de cellules souches embryonnaires

Aujourd'hui, les sources de cellules souches embryonnaires pour des tests de laboratoire sont tératocarcinome murin ligne (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) et tératocarcinome humain (Ntera-2, TERA-2 , clone H-9), ainsi que HESS Trauneona. Cependant, la présence détaillée passeport cellulaire indiquant phénotype immunitaire, des résultats d'analyse des chromosomes de profils d'expression d'ARNm exposés des récepteurs et des protéines de signalisation intracellulaire ne compense pas des inconvénients importants lignes teratokartsinomnyh ESC - perte rapide de totipotence et impossibilité d'application dans les essais cliniques, et la différenciation mixte dans la culture est très difficile d'isoler propre ligne dédiée à partir d'une population hétérogène de cellules. Par conséquent, le plus souvent une source de lignes ESC produits à des fins cliniques, sert de la masse cellulaire interne du blastocyste, des embryons blastomères individuels de stade 8 cellules de développement, les cellules morula étapes ultérieures, et germinale primaire.

Il convient de noter que les cellules de tératocarcinome, bien qu'elles aient la propriété de la pluripotence, ont un potentiel pluripotent significativement inférieur à celui de l'ESC. Leur intégration avec les cellules embryonnaires conduit rarement à la formation de chimères, dans lesquelles, en outre, des gamètes avec un génotype de cellules de tératocarcinome ne se forment jamais. On pense que cela est dû à l'apparition fréquente d'anomalies chromosomiques dans la culture des cellules tératocarcines: une perte du chromosome Y, une variété de trisomie, des délétions ou des translocations.

Des tentatives de distinguer la ligne ESC humaine ont été entreprises à plusieurs reprises, mais cette tâche n'a pas pu être résolue, puisque les blastocystes humains normaux sont difficiles d'accès aux objets. De plus, chez l'homme, la fréquence des anomalies chromosomiques est plus élevée que dans l'embryogenèse des animaux. La majorité prédominante d'embryons humains précoces obtenus après fécondation in vitro présente un mosaïcisme chromosomique chaotique et souvent des aberrations numériques et structurelles. Même plus tard, au stade du blastocyste, seulement 20-25% des embryons humains sont constitués de cellules avec un caryotype normal. Il était presque impossible d'utiliser de tels embryons pour créer un ESC, puisque les zygotes étaient habituellement cultivés aux stades de deux ou quatre blastomères, puis transplantés dans l'utérus. Ce n'est que récemment qu'une technique fiable a été mise au point pour la culture d'ovules humains fécondés au stade du blastocyste. L'introduction de cette technique dans la pratique de la fécondation in vitro a non seulement augmenté la fréquence de succès de l'implantation, mais a également fait des blastocystes normaux un objet plus accessible.

Une autre source de cellules souches pluripotentes est les cellules sexuelles primaires, qui, contrairement aux populations progénitrices plus avancées germenativnogo épithélium, ne sont pas sur la surface de la bêta-intégrine, mais expriment la phosphatase shelochnoy haute activité. Il convient de noter que dans l'expérience, la population de cellules souches, qui ont été formés à partir de cellules sexuelles primaires, ont été étudiés depuis les années 80 du siècle dernier. En même temps, une technique pour isoler les cellules germinales primaires du rudiment de la gonade d'embryon de souris a été développée. Les premiers résultats infructueux de la culture de cellules germinales primordiales in vitro suggère la futilité de ces efforts, comme les cellules, mais a survécu, mais ne prolifèrent pas et est mort dans le premier jour. Plus tard, il a été trouvé que les cellules germinales primaires de souris se reproduisent in vitro seulement en présence de facteurs de croissance polypeptidiques spécifiques liés à la membrane et solubles dans le milieu de culture. De nombreuses études ont indiqué qu'il est nécessaire de la présence dans le milieu de culture non seulement FRV, mais membrannosvyazannyh et facteur soluble dans l'acier (SIF) pour la survie et la prolifération des cellules germinales primordiales. Ces peptides sont produits par des cellules somatiques d'embryons homozygotes pour la mutation Steel, et l'un d'entre eux est un ligand du proto-oncogène cKit.

Les cellules germinales primaires des mammifères et des humains sont d'origine extragonadale et sont à l'origine du développement clonal de la lignée cellulaire sexuelle. Ligne à partir de cellules germinales primordiales, ainsi que tous les tissus de l'embryon et mésoderme extra-embryonnaire donne épiblaste (ectoderme primaire) des embryons précoces ayant l'organisation structurelle de la mosaïque. L'ablation microchirurgicale de diverses parties de l'embryon précoce a établi une zone de localisation dans l'épiblaste d'un clone de précurseurs engagés de cellules germinales primaires. À l'aide du rhodamine dextran, qui a été utilisé comme marqueur cellulaire, il a été établi que les précurseurs des cellules sexuelles primaires sont situés dans la région de l'épiblaste proximal, à côté de l'ectoderme extra-embryonnaire. La lignée cellulaire primaire sexuelle émerge du clone à 45 cellules, dont l'attribution se fait au tout début de la gastrulation. Ensuite, la ségrégation des clones se produit, et pendant la gastrulation, les cellules sexuelles primaires entrent dans le mésoderme extra-embryonnaire et se trouvent à la base du bourgeon d'allantoïde, derrière la bande primaire. De là, les cellules germinales primaires migrent vers l'extrémité ventrale de l'endoderme endocervical et se déplacent ensuite activement le long du mésentère, peuplant les rouleaux génitaux à la fin de la migration. Dans le processus de migration, ainsi que dans les premiers 2-3 jours de localisation dans le rudiment des gonades, les cellules sexuelles primaires prolifèrent activement et subissent huit cycles réplicatifs. Si au début de la migration il y a environ 50 cellules germinales primaires, dans les kystes reproducteurs d'embryons de souris d'un développement de 12 jours, le nombre de cellules sexuelles primaires dépasse 25 000.

La similitude fonctionnelle des cellules et des CES germinales primordiales démontre une pleine intégration de ce dernier dans le blastocyste de remplacement de masse cellulaire interne et le développement ultérieur complet de l'embryon, les tissus qui sont constitués uniquement des descendants des cellules germinales primordiales. Selon d'autres caractéristiques des cellules germinales primaires murins PGC étaient également identiques, montrant la capacité de se différencier en des directions différentes, pour former des corps embryoïdes in vitro, une forme tératomes in vivo lorsqu'ils sont injectés par voie sous- cutanée dans des souris immunodéficientes ressemblant tératomes spontanée des souris testiculaires ligne 129 / ter.

Il a été trouvé que lorsque LIF, membranaire et SIF soluble sont ajoutés aux cellules germinales primaires isolées, des embryons de souris âgées de 8 jours survivent et se reproduisent en culture pendant 4 jours, mais meurent ensuite. De plus, la période où la culture de la mort observé des cellules germinales primordiales coïncide avec le stade de développement des embryons de souris (12,5-13,5 jours), lorsque les bourgeons primaires cellules germinales femelles gonadiques entrent en méiose, et dans les cellules germinales mâles primordiales sont bloqués mitotique division. Toutefois, si vous ajoutez à l'environnement non seulement les facteurs de croissance LIF et de SIF, mais aussi de FGF2, les cellules germinales primaires continuent proliferirovat et subcultures sont formées des colonies de cellules peuvent se reproduire même après avoir été retiré de l'environnement des facteurs de croissance (SIF et FGF). De telles cellules peuvent être cultivées pendant longtemps sur le substrat fibroblastique embryonnaire sans l'addition de facteur de croissance soluble LIF. Ce sont ces lignées cellulaires stables dérivées de cellules germinales primaires qui ont été suggérées pour être appelées cellules germinales embryonnaires. Ce terme ne peut pas être considéré comme réussi, car il est impossible de produire des cellules germinales embryonnaires lorsque des cellules EG sont cultivées, ce qui peut conduire à des étapes ultérieures d'ovogenèse ou de spermatogenèse. Cela est dû au fait que les lignées de cellules EG, bien que dérivées de cellules germinales primordiales, mais dans la culture de l'acquisition des propriétés des cellules souches embryonnaires pluripotentes perdent leur capacité à commettre la ligne de germenativnye. En d'autres termes, les cellules sexuelles primaires perdent les propriétés des précurseurs de gamètes lors de la culture et sont transformées en cellules pluripotentes de type ESC.

Il est à noter que lorsque des souris EG immunodéficientes sont administrées, les tératomes n'apparaissent pas. On suppose que la perte de la capacité des cellules EG humaines à initier des tératomes est due au fait que ces lignées n'ont pas été créées directement à partir de cellules germinales primaires cultivées mais ont été obtenues à partir de cellules isolées de corps embryoïdes. Par conséquent, il est possible qu'ils soient des descendants de cellules pluripotentes mais déjà engagées.

Il convient de noter qu'il existe des différences fondamentales entre les cellules EG et les cellules germinales primaires. Ces derniers ne permettent pas d'obtenir des embryons de souris chimères, ce qui indique le manque de capacité des cellules germinales primaires à s'intégrer dans la masse cellulaire interne ou le trophectoderme. Les caractéristiques de la population des cellules sexuelles primaires sont plus proches des lignées de cellules somatiques des embryons tardifs, dont l'introduction dans le blastocyste ne conduit pas non plus à la formation d'embryons chimères.

Techniques de modification de la culture de la corps embryoïdes obtenus avec EG-agrégation de cellules autorisées par sélection sur des milieux sélectifs pour recevoir une autre population de cellules pluripotentes, appelées « cellules dérivées de corps embryoïdes (corps embryoïdes cellules dérivées des cellules - EBD)-. EBD-capacité des cellules à proliférer en culture pendant longtemps a permis de créer des lignées cellulaires stables cellules engagées. Les clones cellulaires ont été obtenus en exprimant l'ARNm et une large gamme de protéines marqueurs de cellules spécialisées. Cette approche à la suite a prouvé que le sexe primaire des cellules pluripotentes humaines, et se différencier in vitro en différents types de cellules: les neurones, les cellules gliales, endothélium vasculaire, les cellules hématopoïétiques, les muscles et les cellules endodermiques.

Sources alternatives de cellules souches embryonnaires

Une autre source de lignes ESC humaines peuvent être des cellules hybrides. L'implantation dans l'utérus de la structure de vaches pseudogestantes obtenu lors de la fusion par électroporation fetusa cellules somatiques humaines avec les vaches d'oeuf, qui avait été préalablement retirées de la pronucleus, permet de recevoir la masse cellulaire interne de stades de développement d'embryons de pré-implantation artificiels. A cet effet, on obtient dans la première étape d'une vache d'oeuf blastocyste avec un noyau de cellules humaines transplantées.

Dans la deuxième étape, l'embryoblaste est extrait du blastocyste, et de lui - l'ESC selon la méthode de Thomson. Il est à noter que les meilleurs résultats sur l'isolement des lignées ESC en utilisant cette méthode ont été obtenus en utilisant des noyaux de cellules folliculaires ou des cellules germinales primaires qui persistent dans le corps humain en état d'hibernation. Cela est dû au fait que neukorochennye noyau des cellules humaines transplantées l'ovule d'une vache doit avoir une forte activité et télomères telomeazy qui évite les clones de vieillissement de l'ESC précoce dérivés de l'œuf hybride (Repin, 2001). On sait que les protéines EGF marqueurs intracellulaires les plus importantes sont Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, qui appartiennent aux protéines dites de silencieux de chromatine. Les silencieux procurent une garniture d'hétérochromatine particulièrement compacte, ce qui empêche la formation de boucles d'euchromatine. Le paquet de la chromatine médiée par ces protéines est en corrélation avec la totipotence du génome ESC. À ce jour, il a été établi que les ovules matures des bovins et des humains sont le seul type de cellules spécialisées contenant des concentrations élevées de protéines silencieuses dans le cytoplasme. Sur cette base, une méthode a été développée pour la production de CES hybrides en transférant des noyaux de cellules somatiques à des ovules non nucléaires de vaches. Des études préliminaires in vitro ont montré que le cytoplasme des ovocytes des vaches restaure la totipotence du génome du noyau cellulaire somatique humain en 12-24 heures de culture.

Les données sur les caractéristiques du développement préimplantatoire des embryons humains, qui indiquent un remplacement ultérieur des cellules totipotentes par une population de cellules pluripotentes, sont particulièrement intéressantes par rapport aux souris. L'étude des transformations cellulaires a montré que les cellules de la masse cellulaire interne du blastocyste humain, en plus des CES, génèrent également des cellules trophoblastiques, ce qui indique leur puissance totale.

On sait qu'au stade du blastocyste, il existe deux populations de cellules différentes. L'un d'eux est la couche externe du blastocyste, le trofectoderme, dérivé de cellules trophoblastiques et d'autres composants du placenta embryonnaire. La deuxième population de cellules est regroupée en une masse dense, qui entre en contact avec la surface interne du trophectoderme. La population cellulaire de la masse cellulaire interne est dérivée de tous les tissus et germes des organes embryonnaires. Au stade du blastocyste tardif, un endoderme extra-embryonnaire est formé à partir de la masse cellulaire interne et un épiblaste est formé (ectoderme primaire). Dans le même temps, les cellules épiblastiques conservent la pluripotence, tandis que la capacité à différencier les cellules de l'endoderme extra-germinal est limitée.

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Obtention de cellules souches embryonnaires humaines

Jusqu'à récemment, on croyait que trophoblaste obtenu à partir de CSEh impossible. Cependant les cellules souches diploïdes ligne du trophectoderme isolées du blastocyste dans un milieu qui contient, au lieu de LIF et de l'héparine de FGF2, prolifère et se transforme en cellules souches. Si vous retirez du milieu de FGF2, les cellules trophectoderme arrêter la reproduction, ils commencent endoréduplication des chromosomes et des éléments cellulaires trofektodermalnye progressivement transformé en un trophoblastes géant. Probablement, le LIF ne stimule pas la prolifération de cellules trophectoderme en raison du fait que le FGF2 déclenche un mécanisme de transsignalizatsii que FGF2, la liaison au récepteur cytoplasmique (FGFR2), activer la MAP kinase dans le cytoplasme - ERK1 et ERK2. Par conséquent, lorsqu'il est incorporé dans les cellules du blastocyste d'une voie de signalisation (LIF - gpl30 - JAK-Kinase - STAT3) des cellules de la masse cellulaire interne se transforment en cellules hES pluripotentes, tout en activant le deuxième mécanisme de signalisation transmembranaire (FGF2 - FGFR2 - kinases MAP ERK1 / ERK2) les cellules souches dans le trophectoderme blastocyste formé. Le choix de la voie de signalisation, à son tour, dépend de l'activité du gène Oct4 de. Ce gène appartenant domaine POU, situé au niveau du locus t 17 autosomes et est exprimé au cours de l'ovogenèse, en période de broyage, ainsi que dans les cellules de la masse cellulaire interne du blastocyste, et dans les cellules germinales primordiales. Gène fonctionnel de Oct4 rôle est codant pour un facteur de transcription nécessaire à l'apparition de cellules pluripotentes, leur différenciation et dédifférenciation.

L'expression du gène oct4 dans l'ESC varie en fonction de l'interaction de ce facteur de transcription avec les cofacteurs. Une régulation directionnelle de l'expression de l'oct4 dans les blastocystes a montré que lorsque son activité diminue, la moitié des cellules forment un trophectoderme, alors qu'avec une augmentation de l'expression induite de l'oct4, l'ESC survient principalement.

Dans l'expérience, ESC ne peut pas être converti en une ligne lors de la culture des blastomères totipotents au stade de l'écrasement, ainsi qu'au stade de la gastrulation et des stades ultérieurs du développement embryonnaire. Souris CES alloue habituellement à 03/05 à 04/05 jours de gestation, qui correspond à la sixième (couche unique du blastocyste) et septième étapes (deux couches du blastocyste - un cylindre d'oeuf précoce) embryogenèse normale. De toute évidence, seulement dans la période préimplantatoire, les embryons de souris contiennent des populations cellulaires qui peuvent être transformées en ESC. Par conséquent, l'isolement des lignées ESC n'est possible qu'à certains stades de l'embryogenèse. Totitipotent, du point de vue de la possibilité de développer un embryon viable avec des membranes embryonnaires et le placenta, sont les zygotes et les blastomères qui apparaissent lors du broyage. La perte de la puissance totale des cellules germinales commence au stade tardif de la morula, lorsque la fragmentation ultérieure des blastomères dépend de leur localisation. Les blaetomères primitifs de Morula conservent la totipotence, car des manipulations expérimentales avec des changements dans leur localisation, par exemple, l'inversion de leur localisation, n'empêchent pas le développement d'un embryon complet.

Il a été constaté que l'efficacité de la libération de ESC dans la ligne est affectée par l'état des blastocystes au moment de leur explantation. L'utilisation de blastocystes après une simulation de sept jours de diapause dans l'appareil génital de la souris, ovariectomie à 3,5 jours de gestation et traités avec de la progestérone, contribue à une séparation plus efficace des lignées de cellules souches embryonnaires. On suppose que dans de telles conditions, le nombre de blastomères formant la masse cellulaire interne augmente. Il est également possible que le cycle cellulaire s'étende et la plupart des blastomères entrent dans la phase G0.

De plus, la création de lignées de CSEh pluripotentes stables dépend des embryons de génotype: assez facilement distingué de la ligne de blastocystes CES murine 129, est beaucoup plus difficile de les obtenir en utilisant des souris CS7BL / 6 et pratiquement impossible d'isoler la ligne de CSEh blastocystes souris CBA / Ca. De toute évidence, les embryons précoces possèdent certaines caractéristiques génétiques qui affectent le développement de la lignée ESC pluripotente. Néanmoins, dans la culture de l'épiblaste isolé, et également avec la sélection sélective des cellules différenciées, les lignées ESC des embryons précoces de souris CBA / Ca étaient encore isolées.

Une technique standard éprouvée pour obtenir des lignées ESK à partir de blastocystes est donnée dans des manuels de laboratoire sur la technique d'expérimentation avec des embryons précoces. Des lignées ESK expérimentales peuvent également être obtenues en cultivant un épiblaste isolé (ectoderme primaire) d'embryons de souris de 4,5 jours avec une technique microchirurgicale plutôt complexe et des conditions de culture modifiées. La complexité de cette procédure est justifiée, car la fréquence de formation des lignes ESC était beaucoup plus élevée que dans le travail avec la masse cellulaire interne du blastocyste.

Pour isoler les lignées ESC, chaque clone est transféré dans un micro-puits, un agrégat de 40-60 cellules est cultivé, il est à nouveau dispersé. Répétitions multiples de cette procédure permet d'obtenir la ligne ESK immortalisée avec des taux maximaux de prolifération des cellules normokariotipnyh attachés à la matière plastique, à travers des passages 50-100 conservent totipotence et de haute activité télomérase. Dans le processus de soutien des lignes ESC le plus grand danger est la pollution ou de sérum endotoxines bactériennes - même des traces de concentration en endotoxines dans le milieu de culture a causé la mort de masse de cellules germinales immatures. Avec un contrôle minutieux de la croissance linéaire et la dispersion rapide des CES dans la culture sont capables de fission symétrique, dans lequel les deux cellules filles restent pluripotentes et en mesure d'effectuer un nombre illimité de cycles cellulaires, le maintien d'un caryotype diploïde et la puissance totale.

La sélection d'une population propre de CES humaines peut être réalisée après transfection dans leur génome de molécules d'ADN recombinant contenant un gène codant pour la synthèse d'une protéine fluorescente verte (GFP). L'expression de la GFP augmente avec la croissance d'ESC dans des conditions qui favorisent leur prolifération, alors qu'avec le début de la différenciation, le niveau d'expression de ce gène est réduit, ce qui permet la sélection de lignées cellulaires pluripotentes stables stables sur un milieu sélectif. Cultivé avec la sélection GFP des CES, la fréquence des colonies est fortement augmentée, puisque dans les conditions des cultures de sélection, le puissant effet antiprolifératif des cellules différenciées est éliminé.

Traduction des cellules souches embryonnaires humaines en ligne au moyen de leur procédé d'isolement d'embryons de pré-implantation (étape 80-120 cellules), qui restent après la procédure de fécondation in vitro. Pour cela, les embryons surnuméraires artificiellement obtenus sont dispersés mécaniquement dans l'environnement Delbecco-Needle. Après marquage des cellules avec des anticorps monoclonaux sélectifs avec un marqueur fluorescent, les cellules de l'embryoblaste sont isolées. L'embryoblaste est dispersé dans des cellules individuelles en utilisant un mélange de désaspase-collagénase. Les cellules dissociées ont été cultivées dans un milieu spécial (80% Delbekko moyen + 20% de sérum de veau foetal en présence de 500 ug / ml d'IL-6, LIF et SCF) sur la monocouche de fibroblastes embryonnaires alimentation 3 premiers passages. Dans ce cas, la survie et la prolifération des cellules souches et progénitrices sont supportées par l'exposition à IL-6, LIF et SCF. Dans un tel environnement, les CES se développent par des clones de suspension de cellules raclées non attachées, qui doivent être dissociées par un pipetage multiple doux. De nouveaux clones apparaissent dans la culture suspendue du 5 au 7ème jour. Le taux maximum de croissance de ESC est atteint par la dissociation répétée des clones au stade de 10-15 cellules. Ensuite, chaque clone est transféré dans une microcellule et développé jusqu'à un agrégat de 40-50 cellules. La procédure est répétée plusieurs fois dans les passages, ce qui augmente le volume de la culture à une densité de 5-10 millions de cellules par tasse de 6 centimètres. En utilisant un tel Thomson repiquage, il a été isolé de 10 clones CES humaines immortelles qui, à travers des passages 100 conservent une activité télomérase élevée, la capacité de prolifération intense et les caractéristiques phénotypiques puissance totale minimale, avec une différenciation dans l'une des 350 lignes de cellules spécialisées qui sont dérivés ecto-, méso- - et endoderme. Différenciation des ESC humaine a commencé (au changement de milieu, l'addition et l'élimination du LIF de sérum) avec la fixation des cellules sur le substrat, ce qui indique le développement du cytosquelette et l'expression des récepteurs d'adhésion. Il est important qu'avec la prolifération non restreinte des CES humains, un caryotype normal soit préservé.

La deuxième méthode d'isolement des lignées ESC humaines repose sur l'utilisation de cellules sexuelles primaires. Des études expérimentales ont montré que des lignées de cellules Eu peuvent être obtenues à partir des plaques génitales d'embryons de souris de 12,5 jours. Cependant, dans ces cas, la fréquence de formation des lignées de cellules progénitrices était significativement plus faible que dans les expériences avec des embryons plus tôt. Dans le même temps, les cellules sexuelles primaires provenant des gonades d'embryons de souris d'âge gestationnel de 13,5 jours sont généralement incapables de se transformer en lignées.

Les premières lignées stables de cellules EG humaines pluripotentes ont été obtenues à partir de gonocytes primaires isolés à partir des bourgeons génitaux d'embryons âgés de 5 à 9 semaines. Les cellules isolées ont été cultivées sur un substrat de fibroblastes embryonnaires de souris inactivé dans un milieu DMEM avec du sérum fœtal, à laquelle on a ajouté du mercaptoéthanol, la forskoline, ainsi que des facteurs de croissance humaine recombinante (FGF et LIF). Après 7-12 jours, des colonies multicellulaires sont apparues en culture, en fonction des caractéristiques morphologiques et des marqueurs moléculaires correspondant aux cellules EG humaines. Après agrégation, ces cellules formaient des corps embryoïdes, avec le développement ultérieur duquel apparaissaient des cellules spécialisées, caractéristiques des dérivés des trois feuilles embryonnaires. Tout au long de 10 à 20 passages, les lignées cellulaires EG conservent le caryotype normal et ne perdent pas leur pluripotence.

Il est également démontré que l'effet combiné du LIF, des facteurs sidérurgiques membranaires et solubles, ainsi que du TGF-b, modifie le programme de développement des cellules germinales primaires. Au lieu d'arrêter les divisions mitotiques et de commencer à se différencier vers l'ovogenèse ou la spermatogenèse, les cellules sexuelles primaires continuent de proliférer. Après plusieurs cycles mitotiques supplémentaires, ils deviennent similaires aux cellules épiblastiques et, perdant les propriétés des précurseurs des cellules germinales, sont transformés en cellules souches embryonnaires pluripotentes.

Ainsi, en 1998, des lignées immortalisées de cellules sexuelles primaires ont d'abord été isolées du rudiment sexuel du tissu d'autopsie fœtale humaine. L'embryogenèse des cellules germinales humaines primaires apparaissent dans le sac jaune dans la troisième semaine de développement, et les semaines 4-5th, ces cellules migrent dans la zone de tubérosité sexuelle, où ils forment une population de gonocytes de dormantnye primaires. Dans l'état inactif, les cellules germinales primaires restent dans l'œuf jusqu'à la naissance. Des lignées de cellules germinales primaires ont été extraits de tubercule génital du fœtus âgés de 5-9 semaines d'embryons récupérés tissu ex tempore qui est traité avec un mélange de collagénase de type IV-V, hyaluronidase et DNase pour le rendement de la cellule augmentation quantitative et qualitative. Les cellules germinales primaires dans les tissus du tubercule génital du fœtus sont entourées de cellules stromales (mésenchymateuses) de Sertoli. But fonctionnel des cellules de Sertoli est la production de facteurs anti-apoptotiques (Fas-ligand), mitogènes et agents immunosuppresseurs qui protègent les cellules souches sexuelles contre une attaque immunitaire par le corps. De plus, le microenvironnement stromal du tubercule génital joue un rôle important dans la maturation des gamètes. Les cellules germinales primaires isolées sont plantées dans la culture sur la couche stromale nourricière constituée des fibroblastes fœtaux des trois premiers passages. La combinaison la plus efficace de mitogenes est un complexe constitué de LIF, FGF et de la forskoline (un stimulant pour la formation de l'AMPc). Prolifération des cellules germinales primordiales in vitro nécessitent l'addition de sérum foetal, en présence d'un gonocytes de reproduction primaires de clones de la culture accompagnées par la formation de globulaires, les cellules non adhérentes au substrat.

Les Instituts nationaux de la santé sur la base de résumer les informations existantes sur les méthodes d'attribution des lignes ESC humaines de blastocystes a été fait une conclusion préliminaire que l'allocation réussie du CES est le plus probable lorsque des blastocystes en culture avec la masse cellulaire interne bien formé (cellules souches: progrès scientifiques et les orientations futures de la recherche Nat. Inst, de Health USA). De ce point de vue, la meilleure source pour créer des lignes CES sont blastocyste humain 5ème jour du développement, dont l'attribution de la masse cellulaire interne doit être soigneusement enlever trophectoderme. Masse cellulaire interne isolé constitué à ce stade de 30-35 cellules doivent être cultivées sur un substrat fibroblastes embryonnaires murines, ce qui est une condition déterminante pour la formation de colonies dans la culture hESC.

L'analyse des caractéristiques phénotypiques des cellules souches embryonnaires

L'analyse comparative interspécifique des caractéristiques phénotypiques de l'ESC est particulièrement intéressante. Il a été constaté que les colonies CSE humaines - un amas dense de cellules épithéliales aplaties, alors que les souris de veau embryoïdes se composent de conglomérat lâche de cellules arrondies. Dans l'ESC humaine, l'indice du rapport nucléaire-plasma est inférieur à celui de l'ESK chez la souris. Les cellules souches embryonnaires des singes forment plus de colonies de cellules plates avec des bords irréguliers. Dans les clones précoces de primates ESC, des cellules uniques peuvent être facilement observées. L'ESC proliférante de toutes les espèces animales étudiées n'exprime pas les molécules du CMH des première et deuxième classes. Dans le même temps, les CES humains donnent une réponse positive aux anticorps TERA 1-60 et GCTM-2, ce qui indique la présence sur leurs protéoglycanes de sulfate de kératine / chondroïtine de surface, caractéristique de l'embryon (tératomes) des cellules souches -kartsinomnyh. Expression dans CSEh toutes sortes d'animaux gène Oct4 suggère que, malgré les différences phénotypiques dans l'homme et de la souris CES, apparemment activé par le même ensemble de gènes responsables du maintien de la pluripotence (Pérou, 2001). En outre, les lignées de CSE dérivées de rats embryonnaires, porcs, lapins, primates, et le bétail, ont des caractéristiques morphologiques similaires, un ensemble similaire d'identification moléculaire des marqueurs et un mécanisme moléculaire presque identique pour la mise en œuvre du programme de l'embryogenèse qui vous permet de jeter un nouveau regard sur la question de la xénotransplantation .

Contrairement à l'embryogenèse normale in vivo, la prolifération in vitro de cellules hES est non accompagnée par la formation de couches germinales et passe à un bloc de fond homéotique Nohgenov, à savoir, sans l'organogenèse. Étant donné que les gènes de segmentation ne fonctionnent pas dans la culture CSEh impossible de reproduire de telles périodes embryogenèse que la segmentation onglet somites du noyau, la formation de sac jaune, Allantoïde et d'autres organes provisoires et les tissus. Les CES de culture ont été congelés au début de la formation de 350 lignées de restriction de cellules spécialisées. Ainsi, les cellules progénitrices subsidiaires clone et PGC central sont localisées seulement embryon de modèle au cours du développement dans lequel les différentes régions de tissu sont formées en une seule étape sont différents des cellules spécialisées dérivées, cependant, à partir de précurseurs communs. Bien que le niveau minimal de récepteurs à la surface des cellules hES, ils conservent la capacité à exécuter des processus morphogénétiques primitives simulant la plus grande partie de la structure de l'embryon précoce: hESC en suspension dans la culture et des agrégats formant une structure ressemblant à blastocyste ou même des embryons plus tard (cylindres d'oeufs). De tels agrégats de suspension ont été appelés de manière appropriée des corps embryoïdes simples et complexes.

En cas de mélange se différencient en diverses cellules du corps embryoïdes exprimées simultanément au début de gènes ectoderme (Oct3, FGF-5, nodal), l'endoderme (gata-4), mésoderme (brachyury), mésoderme cardiogénique (PKH-2,5), le tube neural (msx3 ) et l'hématopoïèse (elkf). En utilisant diverses combinaisons de cytokines et de facteurs de croissance pour cibler la formation de cellules de la couche de germes in vitro dans un certain nombre de cas, il était possible d'obtenir des corps embryoïdes, qui ont été les gènes de préférence exprimés ectoderme ou mésoderme, qui ouvre la voie à la modélisation de la gastrulation et au début de la phase d'organogénèse.

La croissance clonale de CSEh est la preuve de la division cellulaire asymétrique où seule une des CES dans le clone central conserve la capacité de reproduction non limitatif, tandis que l'autre cellule fille donne lieu à la production de cellules souches, la différenciation est déjà à venir dans. Par conséquent, la vitesse de propagation du clone à la périphérie du corps embryoïdes est plus élevé que dans le centre. Cellules Boundary croissance clone subissent Migrate désordonnées de différenciation spontanée ou meurent par des mécanismes d'apoptose. Ces événements déterminent le sort du clone si le taux de prolifération dépasse le taux de migration et la mort cellulaire apoptotique, la taille clone continuent d'augmenter, la stabilisation se produit avec une égale apoptose et le taux de formation de nouvelle vitesse cellulaire, la régression - le rapport inverse de ces processus. Les cellules progénitrices se divisent de façon symétrique, à savoir, les deux cellules filles se différencient par la suite dans des lignées cellulaires spécialisées matures. Le rapport des cellules ESC / progénitrices varie, mais est toujours le nombre de PSC est seulement une fraction d'un pour cent de la population de cellules progénitrices. Par conséquent, seuls les clones de pipetage complets de désagrégation et en temps opportun sont en mesure d'augmenter le nombre de la culture CES. Clones sont apparus à l'étape désagrégation 10-12 cellules la plus efficace pour obtenir un rendement maximal de CSEh. La direction et le degré de différenciation des cellules dans le corps embryoïdes en fonction de leur emplacement. Les cellules du corps embryoïdes extérieure n'expriment le gène Oct4 et subissent une différenciation dans les cellules de l'endoderme primaire à partir de laquelle ensuite formées cellules épithélioïdes et pariétal extraembryonnaire endoderme viscéral. Les cellules du corps embryoïdes internes expriment Oct4 conservent gène pluripotence et dans les 48 heures de culture. Mais la réorganisation morphologique se produit dans la culture monocouche épithéliale commence et l'expression des gènes qui contrôlent le développement de l'ectoderme primaire. En outre, le processus de cytodifferentiation désordonnée totale commence par l'apparition de différents types de cellules qui sont des dérivés de trois couches de germes. Dans le processus de différenciation spontanée des cellules du corps embryoïdes premier se poser des agrégats marqueurs endodermiques sous la forme de fragments (kystes) sac vitellin. De plus, des angioblastes et des cellules endothéliales de capillaires en croissance apparaissent dans ces structures. Dans les derniers stades de la différenciation spontanée des cellules internes du corps embryoïdes développe différentes cellules à différenciation terminale, y compris les neurones, les éléments gliales, des cardiomyocytes, des macrophages et érythrocytes. Dans certaine approximation (compte tenu de l'inversion spatiale des feuilles formant le tissu embryonnaire) par l'intermédiaire des corps embryoïdes in vitro peuvent explorer les processus morphogénétiques et d'analyser les mécanismes moléculaires de la période initiale de cytodifferentiation embryonnaire, et établir le rôle de gènes spécifiques dans la mise en oeuvre de ces procédés.

Ainsi, au sein du clone se trouvent des cellules dans lesquelles différents programmes de développement génétique sont découverts - ESC, progéniteurs précoces et populations progénitrices différenciées. La culture de CES par les méthodes d'une goutte tombante ou d'une culture de masse sans couche nourricière et sans l'ajout de LIF dans le milieu conduit inévitablement à la formation de corps embryoïdes. La morphologie des cellules des couches externes et internes des corps embryoïdes est différente. La couche externe est constituée de grandes cellules de traitement. Leur surface, face à l'environnement, est couverte de nombreux microvillosités. La couche externe des cellules est séparée de la membrane basale interne ressemblant à la membrane de Reichert, tandis que les cellules de la couche interne des corps embryoïdes sont un épithélium cylindrique. Morphologiquement, la couche interne, bien que contenant de nombreuses cellules en division, ressemble davantage à des colonies ESC indifférenciées.

Caractéristiques des cellules souches embryonnaires humaines

L'absence d'interactions parenchymateuses-mésenchymateuse les gènes de blocage de signal d'arrière-plan homéosis provoque la croissance désordonnée de PGC dans la culture, étant donné que l'onglet est rompu et l'infrastructure de formation organes provisoires. La croissance inorganisée et la différenciation spontanée désordonnée des CSEh dans la culture en raison de l'absence de cadre stromale marquage mésenchymateuses des futurs organismes: in vitro, il est possible la formation de millions d'hépatocytes, mais vous ne pouvez pas obtenir tous les segments du foie, y compris les éléments structuraux et fonctionnels, tels que les sinus, l'espace des cellules Disse et Kupffer.

On croit que la pluripotence de réalisé exclusivement en CES embryogenèse pour former des tissus et des organes de l'embryon, alors que le cordon ombilical et le placenta sont dérivés trophoblaste. Enfermé dans une coquille trofektodermalnuyu ESK générer systématiquement des clones de cellules provisoire réaliser le programme de développement de l'ARNm combinatoires vrac Nohteyaov de matrice topographique, qui prédéterminent la disposition spatiale, de la forme, les dimensions, le nombre de cellules d'organes provisoires et définitives et de l'assemblage de parenchyme en unité structurale et fonctionnelle. En même temps, le CES sont le seul type de cellule dans laquelle le mécanisme moléculaire de la réalisation de leurs potentiels complètement dissocié du programme génétique du développement et ESCO se privaient de la possibilité d'une interaction avec d'autres cellules en raison d'un blocage des deux perceptions des récepteurs et des systèmes de transsignalizatsii. Cependant, ESCs d'activation adéquats entraîne la naissance de fin de programme embryogenèse de déploiement progressif est complètement formé et prêt à la vie extra-utérine d'un organisme composé de milliards de cellules. Dans ce court laps de temps, mais la dette inimaginable dans le chemin de l'espace cellulaire occurrence inévitable d'erreurs dans les mécanismes moléculaires qui fournissent des fonctions vitales des cellules et dans les programmes qui contrôlent la prolifération, la différenciation et la spécialisation. Par conséquent, en pharmacogénomique modernes considérés comme la maladie séparément des dispositifs moléculaires, et la programmation des cellules de la maladie. Et l'action de la majorité des nouveaux médicaments visant à corriger le nom du programme de différenciation, la prolifération et l'organogenèse, ainsi que la régénération des organes et des tissus. Dans l'organisme adulte via CES il devient possible de contrôler le comportement des cellules souches / progénitrices transplantées dans le cerveau, le foie, la rate, la moelle osseuse et d'autres organes de l'être humain pour réparer un destinataire endommagé les organes parenchymateux en raison de la différenciation et la spécialisation des cellules mésenchymateuses des donateurs matrice conservés. Pour l'essentiel, le programme de totipotence lance un autre niveau du génome de l'ovocyte, zygotes et blastomères, mais ces cellules n'est pas encore possible de cloner et dans les quantités à passage nécessaires pour les besoins de la médecine experiental et pratique. Par conséquent, la CES est une source unique d'information génétique contenant la carte de restriction linéaire en trois dimensions de l'embryon et des codes de lignées cellulaires spécialisées pendant la gastrulation.

Pratiquement possibilités illimitées de l'ESC de régénération en raison du fait que leur génome, contrairement à l'appareil génétique de cellules somatiques différenciées, maintient la pluripotence. Une manifestation de l'état dormant enraciné dans l'information génétique CES est le soi-disant phénotype minimum - sur la surface du CES d'exprimer un nombre limité de récepteurs, et donc déployé très peu de programmes pour interagir appareil nucléaire transsignalizatsii de la cellule avec son microenvironnement. Dans le contexte des gènes d'hibernation responsables de la restriction des lignées cellulaires spécialisées et la différenciation des cellules, activées seulement 30 des 500 gènes dont les produits fournir des cellules de communication avec le microenvironnement environnant. Utilisation de la méthode d'analyse en série de l'expression génique montré que la généralité des boîtes génomiques fonctionnelles principales régulation de l'énergie et le métabolisme dans les cellules somatiques et les CES en dernier déterminé quantité extrêmement faible de l'ARNm des récepteurs, des protéines G, des seconds messagers, transcriptases, cofacteurs expression et de répression soit la totalité du signal de régulation du système transmembranaire dans la cellule. Ceci est dû au manque ou à l'expression très faible des gènes de transsanalisation. Au cours de la différenciation induite dans le génome de l'ESC 18 le fonctionnement est arrêté de fonctionner de manière synchrone des gènes pour l'activation fond transsignalizatsii 61 gène contrôlant la synthèse de récepteurs d'adhésion cellulaire, des composants de la matrice extracellulaire, la restriction transcriptases éléments messendzhernyh et système de transmission de signaux pour une unité nucléaire avec les récepteurs de la membrane cellulaire du plasma. En même temps bloqué l'expression de gènes responsables de la synthèse des protéines de silencieux, ainsi que l'expression du gène koingibitorov fournissant hESC du génome de totipotence.

Des marqueurs génétiques ont été trouvés pour les cellules des trois feuillets embryonnaires. Identification couche de cellule ectodermique porté sur l'expression des gènes nodal, Oct3 et FGF-5, des cellules mésodermiques - gène brachyury, zéta-globine, endoderme - à l'expression du gène gata-4. Dans l'embryogenèse normale, au cours de la gastrulation observé une migration active des populations immatures de cellules souches et progénitrices, désignant localement zones des os du visage du crâne, certaines parties du cerveau, du système nerveux périphérique, du système de conduction cardiaque et le tissu du thymus qui sont formés à partir de clones de cellules déplacées. Marquage des cellules gènes précoces couches germinales facilite l'analyse topographique de la migration des cellules souches dans l'embryon en développement. On constate en particulier que les cellules dans les agrégats embryocarcinoma expression de P19 du premier gène mésoderme brachyury commence lors de la réduction de l'expression du gène de l'activateur tissulaire du plasminogène, a-fétoprotéine, kératine 8, et la kératine 19, qui sont des marqueurs de populations migrantes début du mésoderme. Par conséquent, la formation de tissus d'origine mésodermique commence seulement après le processus de migration et de point de décantation des cellules souches mésodermiques.

Avec des caractéristiques phénotypiques extrêmement limitées et l'absence de la plupart des blocs transsignalizatsii CES expriment néanmoins des molécules réceptrices qui peuvent être utilisés pour les identifier. Il est à noter que les antigènes-marqueurs des CES chez l'homme et les primates se sont avérés communs. Le plus souvent utilisé pour les hESC d'étiquetage marqués des anticorps dirigés contre des antigènes membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (Les antigènes lipidiques uniques représentant GL7 glycolipide complexe avec de l'acide sialique), ainsi que les glycoprotéines de haut polymère TRA-1-81, TRA-1-60. En outre, hESC expriment SSEA-1 spécifique de l'antigène embryonnaire et de la phosphatase alcaline endogène, ainsi que d'un facteur de transcription spécifique Oct4. Ce dernier est nécessaire pour le maintien des mécanismes de prolifération des CSEh - gène du facteur de transcription spécifique Oct4 active l'expression du facteur de croissance des fibroblastes 4 l'expression du gène et stabilise la boxe responsable de dédoublement de l'ADN non limitatif dans les cellules immatures. Les protéines marqueurs intracellulaires les plus importants sont Oct3, Oct4, Tcf et Groucho, liées aux protéines de chromatine-silencieux.

Presque immédiatement après les ESCs de culture à long terme tentatives d'échec et l'organisme a été préparé par culture de cellules souches isolées à partir de blastocystes de souris et de la culture primaire de cellules germinales, a commencé des études de capacité de stade ESC pluripotence lorsqu'il est administré dans les premiers stades du développement embryonnaire. Il a été montré que, à la morula et blastocyste PGC sont capables de former des embryons chimères dans lesquels les PGC du donneur descendants détectés dans tous les tissus somatiques et même dans les gamètes. Ainsi, en biologie du développement en utilisant les scripts « pont » ESC entre les études expérimentales in vivo et in vitro, qui ont augmenté de manière significative la possibilité d'étudier les processus Signets tissus primaires et des organes, leur différenciation et organogenèse embryonnaire.

Il est bien établi que in vivo au cours de l'embryogenèse ESK intégré dans la masse cellulaire de l'embryon précoce, et leurs dérivés se trouvent dans tous les organes et les tissus. PGC de coloniser la lignée germinale d'un cellules germinales chimères, des descendants qui forment l'oeuf entier et le sperme. Les cellules souches embryonnaires sont clonogénique - PGC simples peuvent créer génétiquement identique à une colonie de cellules avec des marqueurs moléculaires, qui comprennent l'expression du gène Oct4 et la phosphatase alcaline, de haute activité télomérase, ainsi que l'expression des antigènes embryonnaires spécifiques.

Pour étudier les mécanismes de l'embryogenèse en utilisant la technique de hESC chimérisation morula par la création d'une structure biologique, qui est situé en dehors de PGC couche tétraploïdes blastomères donateurs et bénéficiaires sont administrés en. Ainsi, formé à partir de trophoblaste descendants blastomères tétraploïdes destinataire qui permet l'implantation et la placentation, et PGC du donneur agissant en tant que masse cellulaire interne, qui est formé à partir d'une lignée germinale viable du corps primaire et gamètes progénitrices. Valeur étude ESC est non seulement en ce que, la manipulation in vitro avec leur génome conservé pluripotence, mais aussi dans le fait que, tout en conservant la capacité de participer à la formation de CSEh cellules germinales primordiales de l'embryon chimérique. Il est montré que seulement une progéniture de PGC génétiquement modifiées de coloniser tous les primaires et les germes formant embryon chimère de tissu obtenu par agrégation ou co-culture des cellules avec l'embryon de 8 cellules. Lorsqu'elles sont transplantées dans des souris transfectées avec morula gène CES protéine fluorescente verte, les descendants fluorescents des cellules ont été trouvées dans tous les tissus étudiés de l'embryon en développement (Shimada, 1999). La transplantation d'ESC dans la morula permet la création de souris viables, dont le corps n'est constitué que des descendants du donneur ESC, ce qui ouvre des perspectives pour différentes options de clonage thérapeutique. Cette approche méthodique est maintenant utilisée avec succès pour étudier les problèmes de la biologie du développement, en particulier, elle analyse les mécanismes d'inactivation génétique du chromosome X ou l'instabilité épigénétique de l'ESC. La transplantation d'ESC dans l'embryon précoce est également utilisée en biotechnologie dans l'agriculture, ainsi que dans des expériences de thérapie génique.

Des greffes de CES génétiquement modifiés sont utilisées pour tester les cellules cibles des gènes mutants. Les CES cultivés in vitro sont utilisés en biotechnologie pour créer des souris knock-out. Pour ce faire, par recombinaison homologue, le gène à examiner est retiré de l'ESC, et les cellules dépourvues de ce gène sont isolées sur des milieux sélectifs. Ensuite, les CES knock-out sont injectés dans le blastocyste ou agrégés avec des blastomères de morula. Les embryons précoces chimériques ainsi obtenus ont été transplantés chez des receveurs femelles, et chez les souris nouveau-nés, des individus avec des gamètes, nuiltzigotous pour le gène, ont été sélectionnés. Avec cette technologie, de nombreuses lignées de souris knock-out ont été créées, qui sont largement utilisées en biologie expérimentale et en médecine expérimentale. Sur de tels modèles biologiques, on étudie l'importance de certains gènes dans le développement embryonnaire, ainsi que leur rôle dans les mécanismes des maladies et des états pathologiques de l'homme. En outre, les lignées d'animaux knock-out sont utilisées dans la phase de test préclinique de nouvelles méthodes de thérapie génique. Par exemple, en utilisant la transfection de gènes dans ESK allèle normal du gène mutant gérer efficacement mutation corrigée, frappe le système hématopoïétique. L'introduction de gènes étrangers dans l'ESC permet la création de lignées d'animaux de laboratoire transgéniques homozygotes à un rythme accéléré. Cependant, il convient de noter que la technique de la délétion par recombinaison dirigée des gènes a été établie de manière fiable pour l'instant uniquement en ce qui concerne l'ESC des souris. Utilisation CES murins double inactivation installé grappe de la zone de rôle fonctionnel des gènes sur le chromosome 7 (copie région génomique 19 minutes de chromosome humain), et la partie proximale du 11 chromosome (copie chromosomique humain 5d) - suppression de ces gènes dans Les souris ESK ont permis d'évaluer la fonction de leurs analogues chez l'homme.

Les études de la fonction des capacités des gènes embryonnaires humaines, la transfection dans le gène qui les animaux de laboratoire ont permis CSEh en particulier Crypto clarifier le rôle du gène dans l'onglet et formant le mésoderme cardiogénique, gène pax-6 - dans l'œil de l'embryogenèse. Constitue la première expression de gènes dans la carte de prolifération immature ESC tératocarcinome et des souris blastocyste a confirmé la répression écrasante dans les gènes de ESK transsignalizatsii. La combinaison des CES mutants 60-80 et 20-30 cellules d'embryons de souris pré-implantation normale conduit au développement d'embryons chimères dans lesquels signets corps sont constitués de cellules du donneur et du receveur, qui nous permet de déterminer le rôle des gènes inconnus dans gastrulation et organogenèse. Carte fonctionnelle des gènes de développement des embryons de souris détails agrandis du rôle du gène sf-1 onglet dans la glande surrénale et primordia génitale, gène poids-1 - dans l'onglet reins gènes de la famille de Myo - dans l'onglet de la famille des gènes du muscle squelettique gata-1-4 - dans la maturation de restriction rudiments de l'érythro- et de la lymphopoïèse.

Réalisé hors des allèles maternels et paternels de gènes dans CSEh en utilisant le vecteur recombinase servi à clarifier les fonctions des différents gènes au cours de l'embryogenèse précoce et technologie de ciblage de gènes inconnus humains dans les CES de souris contribuer à la découverte de nouveaux gènes mutants responsables du développement de graves maladies héréditaires. En utilisant la méthode de knock-out signification définie obligatoire de certains gènes pour la pose de tissus embryonnaires: gata-4 - pour l'infarctus, GATA-1 - érythroïdes tissu hématopoïétique, myoD - le muscle squelettique, brachyury - pour la restriction de mésoderme transcriptases hnf3 et HNF-4 - pour les cellules souches du foie, rAG-2 - Partage des clones de lymphocytes T et B (Repin, 2001). Suppression des gènes double dans CSEh a ouvert l'accès à l'étude du rôle fonctionnel des gènes des couches germinal, la segmentation et homéosis et la transplantation ESC étant donné la possibilité d'obtenir des embryons hybrides interspécifiques viables. Avec l'amélioration des méthodes de transplantation de PGC du donneur dans un seul embryon à 8 cellules prouvé que chimérisation au niveau cellulaire de nombreux organes de l'embryon receveur. Notez que les germes de cellules se trouvent dans les organes de souris receveur de tissus humains après l'administration de cellules souches hématopoïétiques humaines dans un blastocyste. On a constaté que dans les embryons de souris lors de la formation des corps de sang circulant CSEh pluripotentes. Il est possible que leur fonction biologique soit dans l'organisation embryonnaire du futur système immunitaire. Avec ESC in vitro reproduit les modèles adéquats de maladies génétiques humaines: double modèles knock-out gène de la dystrophine chez la souris de la dystrophie musculaire de Duchenne, l'arrêt atm gène (kinase synthèse signal de commande chromatine) - ataxie-teleangektaziyu. Dans ce cas, une maladie héréditaire mortelle chez les enfants en raison de défauts de réparation de l'ADN développe une dégénérescence des cellules de Purkinje du cervelet, qui est accompagné d'une involution du thymus en raison de la mort des cellules qui prolifèrent. Clinique, pathophysiologie et patomorfologija tazii ataxie-teleangek- reproduites par l'introduction dans l'information génétique anormale ESC de chimères souris correspondent à ceux chez l'homme. De plus Ataxie teleangektazii utilisant PGC et souris knock-out développé modèle expérimental, certaines maladies humaines homozygotes héréditaires associées à des troubles de métabolisme des glucides et des lipides, catabolisme des acides aminés, l'élimination du cuivre et de la bilirubine, qui a augmenté de manière significative la possibilité de la médecine expérimentale pour les essais précliniques de nouvelles méthodes pour le traitement des maladies pertinentes droits.

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L'utilisation de cellules souches cytohybrides

Les cellules hybrides obtenues par fusion de cellules somatiques de CSEh, sont le modèle adéquat et prometteur pour l'étude pluripotence des cellules souches et des chromosomes de reprogrammation cellules différenciées. Tsitogibridy obtenu par la fusion de l'ESC avec des cellules différenciées de l'animal adulte, l'occasion d'étudier la relation entre les génomes des différents « âges »: développe une situation unique où les chromosomes homologues dérivées de cellules de différents stades de la différenciation et des degrés de maturité, sont dans le même noyau, où ils peuvent facilement transdeystvuyuschimi partager des signaux réglementaires. Il est difficile de prévoir comment réagira tsisregulyatornye système épigénétique de chromosomes homologues existant au cours yn développement dividuelle, en réponse aux signaux de transdeystvuyuschih d'impact à partir de génomes apparentés embryonnaires. En outre, dans les cellules hybrides se produit la séparation du chromosome parental qui permet d'étudier l'interaction des génomes au niveau des chromosomes distincts, à savoir, d'identifier potentiellement la partie de chromosomes spécifiques dans le maintien de la pluripotence, ou au contraire, une sortie en différenciation.

Comme premier modèle expérimental pour l'étude de l'interaction des génomes avec différents "antécédents de développement", des cytohybrides obtenus par fusion de tératocarcinomes pluripotents et de cellules somatiques différenciées ont été utilisés. Dans certains cas, de telles cellules hybrides conservent des propriétés pluripotentes à un niveau suffisamment élevé. En particulier, les cellules hybrides tératocarcinome-somatique in vivo ont induit le développement de véritables tératomes contenant les dérivés des trois feuilles germinales, et des corps embryoïdes in vitro se sont formés dans les cultures en suspension. Même dans des cytohybrides interspécifiques de ce type, des antigènes embryonnaires ont été notés dans les cas où des partenaires somatiques dans la fusion avec des cellules de tératocarcinome avaient des lymphocytes ou des thymocytes. Il est à noter que les cyto-hybrides créés par la fusion de cellules de tératocarcinome avec des fibroblastes correspondaient à des fibroblastes selon le phénotype.

Le plus important est qu'un fait établi que dans teratokartsinomno cellules somatiques hybrides sont apparus des signes reprogrammant génome de cellules différenciées, caractérisées par une réactivation des gènes individuels ou inactifs partenaire somatique chromosome X. Ainsi, les résultats de la recherche sur le type tsitogibridah cellules somatiques teratokartsinomno-indiquent que les cellules hybrides souvent retenues pluripotence et la reprogrammation du génome, il y a des signes de partenaires somatiques.

Dans les expériences pour obtenir des cellules embryonnaires hybrides interspécifiques en fusionnant splénocytes avec l'animal de souris CES adultes étudiés caractéristiques telles tsitogibridov, analyse de ségrégation des chromosomes parentaux et évalué génome hybride pluripotence. Pour les cellules hybrides interspécifiques produites par fusion de cellules de tératocarcinome avec des cellules somatiques, généralement caractérisée par une faible ségrégation des chromosomes avec caryotype tétraploïde ou quasi-tétraploïde. Une composition chromosomique similaire a été observée dans le cytohybride par la fusion de cellules sexuelles primaires avec des lymphocytes. Dans le même temps, des cellules hybrides interspécifiques obtenues à la suite de la fusion de cellules de tératocarcinome de souris avec des lymphocytes de vison, marqué la ségrégation des chromosomes intensive du partenaire somatique.

Une nouvelle étape qualitative dans l'étude de la ségrégation des chromosomes parentaux chez les hybrides interspécifiques intervient après le développement de la méthode d'analyse de microsatellites utilisant la réaction en chaîne par polymérase, de sorte que chaque chromosome de la souris a trouvé quelques centaines de marqueurs, ce qui permet une discrimination fiable entre une paire de chromosomes homologues dans les cellules hybrides.

En fusionnant ESK (en utilisant des cellules HM-1 déficiente en activité gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, isolé à partir de blastocystes souche de souris 129 / 01A) avec des splénocytes provenant de souris ligne congéniques DD / c n'a pas réussi à recevoir l'ensemble des clones hybrides morphologiquement avait similitude avec hESC. Tous les clones ont été isolés sur un milieu sélectif, dans lequel la croissance est possible qu'avec la gipoksantinfosforiboziltransferazoy cellulaire active. L'analyse par électrophorèse a révélé la présence de tous les clones variant allélique gipoksantinfosforiboziltransferazy souris caractéristique DD / c. En utilisant l'analyse cytogénétique, il a été constaté que quatre avaient trois clones hybrides okolodiploidny de chromosomes. Un quasi-clone tétraploïde contenait deux populations de cellules hybrides, dont un était tétraploïde, et le second, plus petit - diploïde.

L'analyse de microsatellites permettant de discriminer toute paire de chromosomes homologues de souris 129 / 01a et DD / c, dans les clones hybrides avec ensemble okolodiploidnym a montré que les clones se sont produits dans deux élimination préférentielle distincte autosomes partenaire somatique. La plupart des clones autosomiques HESS2 et HESS3 avaient des marqueurs ligne 129 / 01a, à savoir, partenaire pluripotentes. L'exception était le chromosome 1 et I: clones HESS2 et HESS3, ainsi que des marqueurs de cellules HM-1, un petit nombre de marqueurs présents partenaire somatiques. Ces résultats peuvent refléter la ségrégation incomplète des chromosomes 1 et partenaire et somatiques et sont conformes aux données cytogénétiques que la trisomie des chromosomes qui se produit dans 30 à 40% HESS2 et des clones de cellules HESS3. Clone HESS4 diffère significativement de la composition chromosomique: de nombreuses autosomes Ce clone provient du génome ESK (chromosomes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 et 17), mais les chromosomes 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 et 19 étaient représentés par des homologues des deux parents. Le rapport quantitatif des microsatellites marquant ces chromosomes homologues correspond approximativement à 1: 1. Cela a permis aux auteurs de suggérer que l'on est dérivé du homologue du génome du CES et l'autre - de cellules différenciées. Dans certains sous-clones de clone HESS4 observé que la présence symbolique de chromosomes 18 et 19 partenaires somatiques. Les résultats indiquent que les cellules clone HESS4, en plus de la ségrégation des chromosomes partenaires somatiques, il a été l'élimination de l'un ou les deux homologues du génome pluripotentes chromosomique ci-dessus, à savoir, il y avait une ségrégation des deux côtés des chromosomes des deux parents - le phénomène est tout à fait inhabituel, car tsitogibridov ségrégation caractéristique des chromosomes seulement un des parents.

De plus, après le 20ème passage, tous les clones de cellules hybrides contenaient exclusivement des marqueurs chromosomiques X du partenaire somatique, c'est-à-dire que dans les clones, le chromosome X de ESC était remplacé par le chromosome X du partenaire somatique. Ceci est confirmé par des données d'hybridation in situ utilisant une sonde marquée au FITC spécifique du chromosome X de souris: un signal positif a été détecté seulement sur un chromosome. Il convient de noter qu'aux stades plus précoces de la culture (jusqu'au 15e passage), d'après les données cytogénétiques, dans plusieurs cellules, il y avait deux chromosomes X. Par conséquent, l'utilisation de milieux sélectifs permet de manipuler la composition chromosomique de cellules hybrides et de cibler sélectivement des clones portant des chromosomes uniques du partenaire somatique sur le fond du génome ESC.

En tant que caractéristique unique du tsitogibridov du génome est la localisation des génomes parentaux dans un seul noyau, bien sûr, pose la question de maintenir les propriétés du génome embryonnaire pluripotentes hybrides de cellules ESC-somatiques dans les conditions de contact étroit avec le génome de cellules différenciées. Morphologiquement, le cytohybride des cellules ESC et somatiques ressemblait à la lignée parentale de l'ESC. L'évaluation de la pluripotence a montré que tous les clones avec un ensemble de chromosomes presque diploïdes étaient capables de former des corps embryoïdes dans des cultures en suspension dans lesquelles des dérivés de trois feuilles germinales étaient présents.

La plupart des cellules hybrides contenaient l'antigène ECMA-7, marqueur caractéristique des embryons précoces de souris, et présentaient également une activité élevée de la phosphatase alcaline. Les données les plus convaincantes sur les propriétés pluripotentes élevées des cellules hybrides ont été obtenues expérimentalement pour obtenir une série de chimères d'injection impliquant des cellules hybrides du clone HESS2. Une analyse des marqueurs biochimiques a montré que les descendants de cellules hybrides donneuses étaient présents dans la plupart des tissus chimères. Par conséquent, les cellules hybrides obtenues par fusion d'ESC et de cellules différenciées somatiques conservent la pluripotence à un niveau élevé, y compris la capacité de former des chimères lorsqu'elles sont insérées dans la cavité du blastocyste.

Les clones HESS2 et HESS4 différaient significativement dans la composition des chromosomes parents, mais ils avaient des propriétés pluripotentes similaires. On pourrait supposer que plyuripotentnostv « dans le génome hybride se manifeste en signe dominant, mais il est possible que tous les chromosomes du génome embryonnaire sont impliqués dans le maintien de la pluripotence. Si cette hypothèse est correcte, on peut s'attendre à ce que l'élimination de certains chromosomes du partenaire pluripotent du génome de l'hybridome ne s'accompagne pas d'un changement de leur statut pluripotent. Dans ce cas, l'analyse de la ségrégation du chromosome parental dans les cellules hybrides embryonnaires permettrait de se rapprocher d'identifier les chromosomes responsables du contrôle de la pluripotence des cellules embryonnaires.

O. Serov et ses co-auteurs (2001) n'ont pas trouvé parmi 50 descendants obtenus en croisant des chimères avec des souris normales, telles que le génotype des souris 129 / 01a et portant le chromosome X des souris DD. Les auteurs en voient la raison dans la réduction de la pluripotence dans les cellules hybrides sous l'influence du génome somatique. Une explication alternative peut être l'effet négatif de la trisomie sur certains autosomes et des déséquilibres dans les chromosomes sexuels (XXY ont été observés dans les cellules jusqu'au 15ème passage) dans les cellules hybrides quand ils ont passé la méiose. On sait que les cellules de XXY ne peuvent pas traverser la méiose et former des gamètes. La trisomie est également capable de provoquer une diminution de l'activité proliférative des cellules hybrides, à la suite de laquelle l'avantage sélectif dans le développement de chimères peut appartenir aux cellules de l'embryon receveur. Il s'ensuit que pour évaluer adéquatement le potentiel pluripotent des cellules hybrides, il est nécessaire d'obtenir des clones hybrides avec un ensemble diploïde normal de chromosomes.

Dans les expériences Serova O. Et al (2001) ont d'abord démontré la possibilité de reprogrammer le chromosome X dans le génome d'une cellule hybride de cellules somatiques. Cette conclusion résulte des auteurs analysent l'expression de chimères de gène HPRT (marqueur X-chromosome): la présence de variants alléliques souris HPRT DD / c a été détecté dans tous les tissus analysés chimère. Il convient de souligner que, après l'introduction de cellules hybrides dans la cavité blastocyste tsitogibridy tombent dans des conditions non sélectives et la préservation du chromosome X dans le génome des cellules hybrides signifie qu'il est devenu une composante obligatoire de son génome et ne fait aucune discrimination pas du partenaire pluripotentes du chromosome Y.

Résumant les résultats de l'analyse de l'interaction des génomes somatiques et pluripotents dans des cellules embryonnaires hybrides, les auteurs concluent que chez certains cytohybrides, la pluripotence se manifeste comme un trait dominant. Un génome hybride est capable de reprogrammer des chromosomes individuels de cellules différenciées, ce qui n'exclut toutefois pas la possibilité de l'effet inverse du génome somatique sur la pluripotence du génome embryonnaire. Dans la culture de cellules hybrides, l'induction de la différenciation se produit beaucoup plus souvent que dans la lignée parentale originale de l'ESC NM-1. Un effet similaire est observé dans la formation des colonies primaires: de nombreuses colonies primaires de cellules hybrides embryonnaires se différencient dans les premiers stades de la formation avec de grandes pertes de clones au cours de leur sélection et de leur multiplication.

Ainsi, les cytohybrides créés par la fusion des CES avec des cellules somatiques, malgré un contact étroit avec le génome des cellules différenciées, préservent la pluripotence comme une propriété unique du génome embryonnaire. De plus, dans de telles cellules hybrides, il est possible de reprogrammer les chromosomes individuels provenant des cellules diffusées. Reste à savoir dans quelle mesure les propriétés pluripotentes du génome embryonnaire dans les cellules hybrides persistent, en particulier, leur capacité à participer à la formation de la voie embryonnaire chez les chimères. Pour cela, il est nécessaire d'obtenir des cellules hybrides embryonnaires avec un caryotype normal. Dans tous les cas, les cellules hybrides embryonnaires pluripotentes peuvent devenir un véritable modèle génétique pour l'identification des chromosomes impliqués dans le maintien de la pluripotence ou son contrôle, car la ségrégation bilatérale des chromosomes parentaux offre potentiellement une telle opportunité.

L'étude du phénomène, que O. Serov et ses co-auteurs (2001) définissent comme «mémoire chromosomique», n'est pas moins attrayante. Dans le génome hybride chromosomes homologues sont deux configurations alternatives: partenaire somatiques différenciation homologues une fois subi, alors que partenaire pluripotentes homologues, ce processus ne fait que commencer. Par conséquent, le maintien de bonnes propriétés pluripotentes de cellules hybrides indique que la configuration « pluripotentes » ESC assez stables homologues dans les génomes hybrides, en dépit de l'impact des facteurs de transdeystvuyuschih émanant du partenaire somatique. Les caractéristiques décrites ci-dessus reprogrammations différenciée des chromosomes du génome homologue au cours du développement de ne pas exclure les chimères de la possibilité que les premières étapes de la formation in vitro et la culture tsitogibridov ils conservent leur statut acquis lors de la différenciation in vivo. Selon des données récentes, lors du transfert des cellules hybrides embryonnaires dans un milieu non sélectif dans lequel il y a une chromosomes d'élimination intensive seul partenaire somatique, à savoir, le génome des cellules hybrides discrimine facilement homologues après culture in vitro pendant 10-15 passages. Ainsi, les cellules hybrides embryonnaires représentent un modèle expérimental prometteur pour l'étude non seulement des propriétés fondamentales du génome embryonnaire pluripotence, mais aussi ses alternatives - différenciation embryonnaire.

Efficacité thérapeutique de la greffe de cellules souches embryonnaires

Avant d'analyser l'efficacité thérapeutique de la transplantation ESC et de leurs dérivés, nous résumons le matériel ci-dessus. Caractéristiques ESC en termes de mise en œuvre intégrale de l'embryogenèse in vitro ne sont pas suffisantes en raison de défauts dans ce cas en raison de l'absence de cellules souches mésenchymateuses qui se produisent dans le corps autonome et indépendamment de CSEh. La puissance génétique de l'ESC est inférieure au potentiel génétique du zygote, par conséquent, il n'est pas directement utilisé pour le clonage des embryons. Le potentiel biologique unique de l'ESC en tant que seules cellules dans lesquelles les programmes de développement sont déployés en succession complète se retrouve dans des études sur la fonction des gènes. A l'aide de l'ESC, les premières combinaisons de signaux activant l'expression de gènes précoces et tardifs codant le développement de trois feuillets embryonnaires sont déchiffrées. La préservation de la pluripotence du génome in vitro en fait un outil unique de régénération réparatrice, capable de reconstituer automatiquement les pertes cellulaires de dommages aux organes et aux tissus. Dans un mode de réalisation hypothétique idéal peut supposer que « ... Dans la transplantation de PGC du donneur dans l'organisme bénéficiaire sont transférés programmes de manière compacte emballés que dans des conditions favorables sont réalisées dans la construction de nouveaux tkani'7 capable » ... Efficacement intégré dans le corps du receveur comme morphologique, à la fois fonctionnel et fonctionnel. "

Naturellement, suite au développement de méthodes de monodifférenciation de l'ESC, l'étude in vivo de l'activité fonctionnelle des cellules obtenues in vitro à partir d'un seul clone spécialisé a débuté. Le clone proliférant de l'ESO génère des populations de cellules progénitrices migrantes qui sont réellement capables de s'intégrer activement dans les zones de lésion tissulaire du receveur, qui est utilisé en médecine régénératrice-plastique. Il a été établi que la transplantation de Dopa-neurones dans la substance noire réduit les manifestations cliniques dans l'hémiparkinsonianisme expérimental. Les transplantations régionales de cellules souches neurales donneuses réduisent le degré de troubles moteurs causés par un traumatisme ou une contusion de la moelle épinière et du cerveau. Reçu et les premiers résultats positifs de la transplantation de cellules souches dans les maladies démyélinisantes. Il semblerait que les pouvoirs de régénération-plastique des CES ouvrent des possibilités illimitées pour l'utilisation de la transplantation cellulaire en médecine pratique. Cependant, lors de la transplantation dans les zones ectopiques, les CES se transforment inévitablement en tumeurs. Lorsque l'injection sous-cutanée de ESC chez des souris immunodéficientes teratomas sont formés. Lorsque la suspension d'ESK est transplantée sous la capsule du testicule chez des souris syngéniques, il se forme également un tératome constitué de différents tissus dont les cellules sont issues des trois feuillets embryonnaires. Dans de tels tératomes, les processus d'organogenèse réduite sont extrêmement rares.

Un certain nombre de travaux fournissent des informations sur les résultats positifs de la transplantation de dérivés précoces des ESCO chez des animaux ayant une pathologie expérimentale. Neurotransplantation cellulaire en utilisant des dérivés de PGC est développée dans l'expérience et les premiers essais cliniques de correction de troubles fonctionnels dans le cerveau et les traumatismes de la moelle épinière, le traitement de la syringomyélie et la sclérose en plaques (Repin, 2001). Avec l'avènement de la technologie in vitro neyronogeneza CES, au lieu d'utiliser des techniques de transplantation de tissus cérébraux embryonnaires développés dérivés de neurosphères, obtenus à partir de cultures de tissu neural embryonnaire. De telles suspensions de transplantation sont beaucoup plus homogènes et contiennent des précurseurs de neurones et de neuroglium engagés.

En plus du milieu de culture ordinaire avec de l'acide rétinoïque à une dose de 10 ug / ml pendant 6 semaines dans des lignées embryonnaires (tératomes de) Ntera-2 humain -kartsinomy formé plus de 80% des neurones post-mitotiques. L'homogénéité complète de la population neuronale est réalisée par le flux de tri des marqueurs immunophénotypiques marqués par des neurones matures qui peuvent se débarrasser des restes teratokartsinomnyh et des cellules immatures. Après transplantation dans diverses régions du cerveau d'animaux expérimentaux, ces neurones non seulement survivent, mais sont également intégrés dans des réseaux neuronaux régionaux. Chez les animaux avec des modèles expérimentaux de défauts locaux du système nerveux central neurotransplantation réduit les manifestations cliniques de la pathologie humaine, tels que les effets du traumatisme craniocérébral, accidents vasculaires cérébraux, les maladies démyélinisantes, les défauts de développement cérébelleux héréditaires, les maladies dépôt des lipides et des polysaccharides.

Pour optimiser les processus de régénération dans les maladies dégénératives du système nerveux central, des technologies pour la préparation d'oligodendrocytes productrices de myéline à partir d'ESK sont en cours de développement. La première étape implique traditionnellement la prolifération des CES avec la multiplication du nombre de cellules nécessaires à la transplantation. Dans la seconde étape, la différenciation dirigée des cellules en une population de précurseurs d'oligodendrocytes producteurs de myéline est effectuée, qui est contrôlée par des antigènes de marquage sélectifs.

Certaines perspectives sont ouvertes pour les dérivés de l'utilisation CES de développer des méthodes pour la correction de l'immunodéficience provoquée par des anomalies génétiques dans la maturation du thymus. Dans les études in KO (rag 1) chez la souris avec défaut de gène induite - mécanisme de recombinaison violation V (D) du locus de gène J TCR, conduisant à la perte de la fonction des lymphocytes T, des dérivés premières de transplantation de PGC chez l'animal thymus récupère la maturation de populations normales de clones immunitaires responsables de immunité cellulaire. Les essais cliniques de transplantation préformées dans CSEh in vitro pour traiter l'anémie héréditaire mortelle chez les enfants.

Les objections à l'introduction rapide de la transplantation de cellules souches dans la clinique sont justifiées par un nombre limité de lignées stables de cellules souches embryonnaires humaines et la nécessité de leur standardisation. Pour augmenter la pureté des lignées ESC standardisées, ainsi que des cellules souches adultes, une méthode de sélection de lignées basée sur l'analyse génétique moléculaire de courtes répétitions en tandem de l'ADN est suggérée. Il est également nécessaire de tester les lignes ESC pour la présence de petits réarrangements chromosomiques et de mutations génétiques, la possibilité potentielle de leur apparition dans des conditions de culture cellulaire est suffisamment élevée. Thèse étend obligatoire tester les propriétés de tous les types de PGC et les cellules souches pluripotentes régionales, puisque leur propagation in vitro peut donner lieu à de nouvelles caractéristiques ne sont pas inhérentes aux cellules souches embryonnaires à des tissus définitives ou. En particulier, on suppose que la culture à long terme dans les médias avec des cytokines HESS plus proches des cellules tumorales, car ils se produisent des voies de changement similaire de régulation du cycle cellulaire avec l'acquisition de la capacité à mettre en œuvre un nombre illimité de divisions cellulaires. Certains auteurs, sur la base du potentiel de développement de tumeurs, considèrent la transplantation humaine de dérivés précoces de cellules souches embryonnaires comme une insouciance. À leur avis, il est beaucoup plus sûr d'utiliser les descendants engagés de l'ESC, c'est-à-dire les lignées des ancêtres des cellules différenciées. Cependant, une technique fiable pour obtenir des lignées cellulaires humaines stables qui se différencient dans la bonne direction n'a pas encore été développée.

Ainsi, dans la littérature, il existe de plus en plus de données sur l'effet thérapeutique positif de la transplantation de dérivés de cellules souches embryonnaires humaines. Cependant, beaucoup de ces travaux sont sujets à révision et à critique. Certains chercheurs croient que les résultats des premiers essais cliniques sont préliminaires et suggèrent seulement que les cellules souches peuvent avoir un effet bénéfique sur l'évolution clinique d'une maladie. Par conséquent, il est nécessaire d'obtenir des données sur les résultats à long terme de la transplantation de cellules. En tant qu'argument, les stades de développement de la neurotransplantologie clinique sont donnés. En effet, dans la littérature, d'abord dominé par la publication de l'efficacité élevée des greffes du cerveau fragments d'embryons dans la maladie de Parkinson, mais ont commencé à apparaître des rapports niant l'efficacité thérapeutique du tissu neural embryonnaire ou fœtale transplantées dans le cerveau des patients.

Dirigé les premiers essais cliniques évaluant la sécurité de transplantation neuroblastes - dérivés de PGC Ntera-2 tératocarcinome, des cellules immatures qui prolifèrent en culture ont été soumis à un stockage 100000000ème masse cellulaire. Certaines des cellules ainsi obtenues ont été utilisées pour caractériser le phénotype et pour déterminer les impuretés cellulaires, ainsi que pour tester une éventuelle contamination par des virus et des bactéries. À partir du milieu de culture a été éliminé et LIF couche nourricière de cellules stromales et les conditions fœtales créées pour la différenciation dirigée de cellules hES en neuroblastes avec une combinaison de cytokines et de facteurs de croissance. Ensuite, les neuroblastes ont été purifiés à partir de cellules de tératocarcinome immatures sur un trieur à cage d'écoulement. Après la seconde purification et la caractérisation du phénotype des cellules transplantées neuroblastes suspension (10 à 12 millions) à l'aide d'une seringue spéciale et Microcanules stéréotaxie et sous le contrôle du CT injecté dans le noyau basal du cerveau de patients (le septième mois après accident vasculaire cérébral hémorragique). Le dépistage post-transplantation d'un an des conséquences de la transplantation neuronale dans la zone d'AVC n'a montré aucun effet secondaire ni effet indésirable. La moitié des patients a connu une amélioration de la fonction motrice dans la période de 6 à 12 mois après la transplantation. Changements cliniques positifs ont été accompagnés par une augmentation de la zone de course de l'approvisionnement en sang après transplantation de cellules: augmentation de l'absorption moyenne de la 2-désoxyglucose marqué par fluorescence, selon la tomographie par émission de positons a atteint 18%, et chez certains patients - 35%.

Cependant, le National Institute of Health des États-Unis a mené une étude indépendante sur l'efficacité clinique de la neurotransplantation chez les patients atteints de parkinsonisme. Les patients du premier groupe ont été transplantés avec du tissu nerveux embryonnaire produisant de la dopamine, tandis que le second groupe de patients subissait une fausse opération. Les résultats indiquent une efficacité clinique nulle de cette neurotransplantation, malgré le fait que les neurones embryonnaires produisant de la dopamine survivent dans le cerveau des receveurs. De plus, au bout de 2 ans après la transplantation de tissu nerveux du fœtus chez 15% des patients ont développé une dyskinésie persistante, qui est absente chez les patients du groupe placebo (cellules souches: progrès scientifiques et les orientations futures de la recherche Nat Inst, de la Santé Etats-Unis ...). Les observations du développement ultérieur de la maladie chez ces patients se poursuivent.

Certains auteurs attribuent la littérature contradictoires sur l'évaluation des données de neurotransplantation d'efficacité clinique avec une approche différente de la sélection des groupes de patients, le choix inadéquat des méthodes objectives pour évaluer leur état et, surtout, des termes différents du développement du tissu nerveux du fœtus et dans différentes parties du cerveau dont le tissu a été produit dans différentes tailles transplantation et caractéristiques méthodiques de la chirurgie.

Il convient de noter que les tentatives de diriger la transplantation de cellules souches embryonnaires pluripotentes dans la région du striatum du cerveau des rats avec gemiparkinsonizmom corps expérimental accompagné la prolifération ESC et leur différenciation en neurones dopaminergiques. Il faut supposer que les neurones nouvellement formés étaient effectivement intégrés dans les réseaux neuronaux, puisque après la transplantation de l'ESC, la correction des anomalies comportementales et l'asymétrie motrice dans le test à l'apomorphine ont été observées. Dans le même temps, certains des animaux sont morts en raison de la transformation de l'ESK transplanté dans la tumeur cérébrale.

Les experts de l'Académie nationale des États-Unis et médicaux, spécialistes des Instituts nationaux de la santé croient que le potentiel clinique de CSEh mérite une attention sérieuse, cependant, insister sur la nécessité d'une étude détaillée de leurs propriétés, la probabilité de complications et les effets à long terme dans des expériences avec des modèles biologiques adéquats des maladies humaines (cellules souches et future médecine régénératrice National Academy Press, Cellules souches et les futures directions de recherche., Inst. Nat. De Santé USA).

De ce point de vue, il est important que l'analyse histologique comparative des tératome expérimentales obtenues par transplantation dans le lisier testiculaires PGC avec tératome qui se sont développées en raison de l'embryon précoce de la transplantation, qui comprenait également présent CES a montré que ESK quelle que soit leur origine ou leur interaction avec par ceux-ci ou d'autres cellules environnantes réalisent de la même manière leurs pouvoirs tumorigènes. Il est avéré que ces tératomes ont une origine clonale, comme d'un CES de tumeur peut se produire, constitué par les dérivés de l'ensemble des trois couches germinales (.Rega, 2001). Il est à noter que lorsqu'elles sont transplantées dans des souris immunodéficientes clonés PGC avec caryotype normal et les tératomes formés constitués d'une variété de types de cellules somatiques différenciées. Ces données expérimentales sont la preuve parfaite de l'origine clonale du tératome. Du point de vue de la biologie du développement, ils suggèrent qu'il est pas un multiple de cellules progénitrices engagées et l'identité des cellules souches pluripotentes est la source de dérivés différenciés de trois couches de germes, des composants de tératome. Cependant, dans les résultats de la transplantation de cellules pratiques de ces études sont, sinon prohibitif, alors un signe d'avertissement de danger potentiel, étant donné que l'ESC d'inoculation ou de cellules germinales primordiales dans les différents tissus de souris immunodéficientes adultes provoque inévitablement l'apparition de tumeurs des cellules souches greffées. Dégénérescence néoplasique transplanté ectopique ESC accompagnée de l'émergence des populations satellites de cellules différenciées - par une distinction partielle est certainement et clones CES progénitrices lignes dédiées. Il est intéressant de noter que les CSEh de transplantation dans les cellules musculaires squelettiques près teratokartsinomnymi neurones forment plus souvent. Cependant, dans l'administration PGC Mace œuf ou blastocyste accompagnés d'une intégration complète dans les cellules germinales sans formation de cellules néoplasiques. Dans ce cas, les ESC sont construits dans pratiquement tous les organes et tissus de l'embryon, y compris le rudiment sexuel. Ces animaux allofennye ont d'abord été préparés en soumettant la cellule tératocarcinome 129 dans les premiers stades des embryons à 8-100 cellules. Dans allofennyh populations de souris geterogenomnyh PGC du donneur dérivés de cellules sont introduits dans la moelle osseuse, l'intestin, la peau, le foie et les organes génitaux, qui vous permet de créer dans l'expérience même des cellules de chimères interspécifiques. Plus le temps de l'embryon précoce, plus le pourcentage de chimérisation cellulaire, le plus haut degré chimérisation observé dans le système hématopoïétique, la peau, le système nerveux, le foie et l'intestin grêle allofennogo embryon. Dans l'organisme adulte du tissu chimérisation prêtent protégée contre l'exposition au système immunitaire des barrières gistogematicalkie destinataire: les cellules germinales primordiales de transplantation dans le parenchyme testiculaire accompagnée d'insertion de cellules souches du donneur dans le tissu receveur couche germenativny. Cependant, la transplantation ESC dans une formation de blastocyste organes génitaux chimères primordiums avec génération donneur des cellules germinales primordiales ne se produit pas. ESC pluripotence lors de la création des conditions particulières et peuvent être utilisées pour le clonage: ESC souris de transplantation d'embryons de souris 16/08-cellulaire, la mitose cellulaire, dans lequel tsitokalazinom bloqué, contribue à l'embryogenèse normale avec le développement des PGC du donneur d'embryon.

Par conséquent, une alternative est de transplantation allogénique ESC clonage thérapeutique basée sur la transplantation nucléaire de cellules somatiques dans un ovocyte énucléé pour créer une masse cellulaire interne de blastocytes qui sont alors alloués ligne de PGC du donneur génétiquement identiques noyau somatique. Techniquement, cette idée est réalisable, car la possibilité de la création de lignées de CSEh à partir de blastocystes obtenus après transplantation de noyaux somatiques dans ovocyte énucléé prouvé à plusieurs reprises dans des expériences sur les animaux de laboratoire (Nagy, 1990, Munsie, 2000). En particulier chez les souris homozygotes pour la mutation rag2, des fibroblastes obtenus par culture de cellules de tissus sous-épidermiques ont été utilisés comme noyaux donneurs sont transplantés dans des ovocytes énucléés. Après l'activation, les ovocytes « zygote » culture jusqu'à la formation de blastocyste, à partir de la masse cellulaire interne est PGC isolées et les faisant passer dans une ligne de cellules de nullizigotnyh du gène mutant (rag2 ~ / ~). Par recombinaison homologue dans ces CES, la mutation d'un gène allélique a été corrigée. Dans la première série d'expériences à partir de cellules hES gène recombinant récupéré corps embryoïdes ont été préparées, les cellules transfectées celui-ci avec un retrovirus recombinant (HoxB4i / GFP) et après propagation dans des souris injectées veine rag2 ~ / ~. Dans la deuxième série, les blastomères tétraploïdes ont été agrégés avec des CES génétiquement modifiés et transplantés à leurs receveurs femelles. Les souris immunocompétentes nées ont servi de donneurs de moelle osseuse pour la transplantation de souris mutantes rag2 ~ / ~. Dans les deux séries, le résultat était positif: en 3 à 4 semaines, toutes les souris matures se sont avérées avoir des cellules myéloïdes et lymphoïdes normales normales capables de produire des immunoglobulines. Ainsi, la transplantation dans les noyaux de cellules somatiques ovocyte peut être utilisé non seulement pour produire des lignées de CSEh, mais aussi pour tsitogenoterapii - Correction d'anomalies héréditaires à l'aide de l'ESC comme vecteur pour le transport de corriger l'information génétique. Mais dans ce sens de la transplantation cellulaire, outre les problèmes bioéthiques, il y a des limites. On ne sait pas comment la sécurité transplantation serait cellules par clonage thérapeutique avec un génotype identique au génotype d'un patient particulier, parce que ces cellules peuvent introduire des mutations qui créent une prédisposition à certaines maladies. Oeufs humains normaux restent objet inaccessible, alors que même les noyaux somatiques lors de la transplantation dans ovocyte animal énucléé seulement 15-25% d'ingénierie « zygote » développer au stade blastocyste. Il n'est pas déterminé combien blastocyste est nécessaire pour obtenir une seule ligne de CES clonés pluripotentes. Il convient de noter et le niveau élevé des coûts financiers associés à la complexité de la méthodologie de clonage thérapeutique.

En conclusion, dans le génome ESC de pluripotence ADN hypométhylé est combinée avec une activité télomérase élevée et courte en C ^ phase de cycle cellulaire, ce qui assure une multiplication intense et potentiellement infinie, au cours de laquelle les PGC conservent les chromosomes diploïdes et set « juvénile » de caractéristiques phénotypiques. Croissance clonale de PGC dans la culture ne fait pas obstacle à les différencier en une cellule spécialisée de l'organisme à une prolifération de la ligne d'arrêt et en ajoutant des signaux de régulation appropriés. La différenciation de restriction de hESC en ligne in vitro de cellules somatiques est réalisée sans la participation du mésenchyme, en contournant Nohteyaov, est organogenèse et sans la formation de l'embryon. L'administration ectopique de CES in vivo conduit inévitablement à la formation de tératocarcinomes. La transplantation ESC dans un blastocyste ou de l'embryon précoce accompagnés de leur intégration avec les tissus de l'embryon et de ses organes chimérisation stables.

Technologies régénératrices et plastique basée sur la transplantation de cellules est le point d'intersection des intérêts des membres de la biologie cellulaire, la biologie du développement, génétique expérimentale, l'immunologie, la neurologie, la cardiologie, l'hématologie, et bien d'autres domaines de la médecine expérimentale et pratique. Les résultats expérimentaux les plus importants prouvent la possibilité de reprogrammer les cellules souches avec la direction du changement de leurs propriétés, ce qui ouvre des perspectives pour le contrôle des processus de cytodifferentiation avec des facteurs de croissance - pour la régénération du myocarde, la restauration des lésions du système nerveux central et la normalisation de la fonction de l'appareil d'îlots du pancréas. Cependant, les dérivés répandus de transplantation d'introduction ESC dans la pratique médicale est nécessaire d'étudier les propriétés des cellules souches humaines dans plus de détails et d'autres expériences avec PGC dans des modèles expérimentaux de maladies.

Les questions bioéthiques et le problème du rejet de greffe de cellules allogéniques pourrait résoudre la plasticité observée du génome des cellules régionales souches adultes. Cependant, l'information initiale est que lors de la transplantation des cellules hépatiques isolées et caractérisée de hématopoiétiques autologues, dont il existe de nouveaux hépatocytes, incorporant dans les lobules hépatiques, sont maintenant en cours de révision et critiquée. Cependant, les données publiées que la transplantation de cellules souches neurales dans le thymus est la formation de nouveaux germes de donneurs de T et les lymphocytes B, et la transplantation de cellules souches neuronales du cerveau dans la moelle osseuse conduit à la formation de germes hématopoïétique soutenue myéloïde donneur et l'érythropoïèse . Par conséquent, dans les organes adultes peuvent conserver les cellules souches pluripotentes capables de génome reprogrammation de l'ESC à pleine capacité.

L'embryon humain reste la source de la réception de l'ESC à des fins médicales, ce qui prédétermine l'inévitabilité d'une nouvelle intersection de problèmes moraux, éthiques, moraux, juridiques et religieux au moment de la naissance de la vie humaine. La découverte des CES a donné un puissant élan à la reprise de discussions difficiles sur la ligne de démarcation entre les cellules vivantes et la matière, la substance et la personnalité. En même temps, il n'existe pas de normes, de règles et de lois universelles concernant l'utilisation de l'ESC en médecine, malgré les tentatives répétées pour les créer et les accepter. Chaque État dans sa législation résout ce problème par lui-même. Pour leur part, les médecins du monde entier continuent d'essayer de développer la médecine plastique régénératrice au-delà de ces discussions, principalement à travers l'utilisation de cellules souches non embryonnaires, et les réserves de cellules souches d'un organisme adulte.

Une partie de l'histoire de l'isolement des cellules souches embryonnaires

Terato- cellules (embryonnaires) ont été isolées à partir de -kartsinomnye se produisant spontanément souche du testicule de souris tératomes 129 / ter-Sv, les lignes de l'ovaire de souris tératomes spontanées Lt / Sv, et à partir de tératomes, les cellules ont été transplantées ektopichno la source ou le tissu embryonnaire. Parmi ainsi obtenus terato- lignées de souris stables (embryon) -kartsinomnyh certaines cellules sont pluripotentes, d'autres ont été soumis à une différenciation que dans les cellules d'un type particulier, et certains ont été généralement incapables de cytodifferentiation.

À l'époque, l'accent a été la recherche qui a montré une terato- de retour possible (embryon) cellules -kartsinomnyh à phénotype normal après leur introduction dans le développement de tissus d'embryons, ainsi que le travail pour créer in vitro terato- (embryon) génétiquement modifié -kartsinomnyh cellules, à l'aide duquel des souris mutantes ont été obtenues pour la modélisation biologique de la pathologie héréditaire humaine.

La culture en suspension conditionnée a été utilisée pour isoler les lignées de cellules terato-embryo-carcinome. Dans terato- de culture (embryon) -kartsinomnye cellules, comme les CES, se développent pour former des corps embryoïdes et nécessitent d'être traduit en une dissociation de liaison ligne maintenir la pluripotence sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires ou culture en suspension dans des milieux conditionnés. Terato- cellules pluripotentes de l'embryon () - lignes de carcinome large, sphériques, ont une forte activité de la phosphatase alcaline, forment des agrégats et sont capables de différenciation multidirectionnelle. Lorsqu'il est introduit dans un blastocyste sont agrégées avec morula, conduisant à la formation d'embryons chimères, dans les différents organes et tissus qui se trouvent dérivés terato- (embryon) -kartsinomnyh cellules. Cependant, la grande majorité de ces embryons chimériques meurent in utero, et dans les organes survivants des cellules nouveau-nés étrangers chimères et rarement détectée avec une faible densité. En même temps, l'incidence des tumeurs (fibrosarcome, rhabdomyosarcome, et d'autres types de gonflement malin et Pancréas adénome) augmente fortement, et la dégénérescence néoplasique se produit souvent même in utero d'embryons chimères.

La plupart des cellules de carcinome terato-embryonnaire dans le micro-environnement de cellules embryonnaires normales acquièrent presque naturellement des caractéristiques néoplasiques malignes. On pense que la malignité irréversible est due à l'activation de proto-oncogènes dans le processus de réarrangements structurels. Une exception est constituée par les lignées cellulaires embriokartsinomnoy SST3, tératome dérivé de testicule de souris (ligne 129 / Sv-ter), qui présentent une grande capacité à intégrer dans les tissus et organes du fœtus sans la formation ultérieure de tumeurs chez des souris chimères. Les dérivés de lignées cellulaires de terato-embryo-carcinome chez les souris chimères ne participent pratiquement pas à la formation des gonocytes primaires. De toute évidence, il est relié à une haute fréquence des aberrations chromosomiques communes à la plupart terato- (embryon) lignées -kartsinomnyh dans lequel les cellules observées comme l'aneuploïdie ou une anomalie chromosomique.

En laboratoire, plusieurs lignées stables de carcinomes térato- embryonnaires humains, caractérisées par une pluripotence, une forte activité proliférative et une capacité à se différencier avec la croissance des cultures, ont été obtenues. En particulier, la lignée NTERA-2 de cellules humaines de terato-embryo-carcinome a été utilisée pour étudier les mécanismes de la cytodifférenciation neuronale. Après transplantation de cellules de cette lignée dans la région sous-ventriculaire du cerveau antérieur des rats nouveau-nés, leur migration et leur neuronogenèse ont été observées. Il y a eu même des tentatives de transplantation terato- neuronale obtenu par culture de cellules (embryon) ligne -kartsinomnoy Ntera-2, aux patients avec des traits qui, selon les auteurs, conduisant à une amélioration clinique de la maladie. Dans ce cas, les cas de malignité des cellules transplantées de la lignée terato-embryo-carcinome NTERA-2 chez les patients avec AVC n'ont pas été notés.

La première lignée de cellules souches embryonnaires pluripotentes non différenciées de souris au début des années 80-s du siècle dernier a obtenu Evans et Martin, en les sélectionnant à partir de la masse cellulaire interne d'un blastocyste - embryoblast. Les lignes ESC isolées ont longtemps préservé la pluripotence et la capacité à se différencier en différents types de cellules sous l'influence de facteurs d'un milieu de culture particulier.

Le terme « cellule souche pluripotente embryonnaire » appartient Leroy Stevens que l'étude des effets de goudron de tabac sur la fréquence du développement de la tumeur a attiré l'attention sur la présence de tératocarcinome testiculaire spontanée de linéaire (129 / v) de souris du groupe de contrôle. Les cellules testiculaires de tératocarcinome ont été caractérisées par un taux de prolifération élevé, et en présence de liquide qui reste dans la cavité abdominale avec la formation de la différenciation spontanée des neurones, les kératinocytes, les chondrocytes, les cardiomyocytes, ainsi que des fragments de cheveux et d'os, mais sans aucune indication d'un cytoarchitectonics commandés de tissu approprié. Lors de la plantation de la culture de cellules de tératocarcinome cultivés non fixé sur le substrat clones pluripotentes et formés des corps embryoïdes ont ensuite été refroidis et soumis à un désordre de la fission spontanée se différencier en neurones, les cellules gliales, des cellules musculaires et des cardiomyocytes. Stevens a constaté que la souris de tératocarcinome 129 / v contient moins de 1% des cellules capables de se différencier en une variété de lignée somatique spécialisée, et la différenciation lui-même dépend de facteurs qui les affectent (composition liquide péritonéal, les produits ajoutés à la culture de cellules matures ou de tissus). Hypothèse Leroy Stevenson sur la présence parmi les cellules de tératocarcinome progénitrices embryonnaires cellules germinales sexuelle a été confirmée: la suspension embryoblast cellules d'embryons préimplantatoires dans les tissus de souris adulte formé tératocarcinome, et séparé d'eux des lignées cellulaires pures après l'administration intrapéritonéale aux animaux bénéficiaires se sont différenciées en neurones, cardiomyocytes et autres kletki somatiques les dérivés de l'ensemble des trois couches germinales. Dans des expériences in vivo transplantation ESK (obtenu à partir de embryoblast mais non trophoblastiques) dans des embryons de souris à différents stades lignes 8-32 blastomère congénitales limitée de l'animal chimérique (pas de formation de tumeur) dans des organes qui détecte les choux de tissu de donneur. Chimérisme a été observée même dans la lignée des cellules sexuelles.

Les cellules germinales primaires progénitrices isolées de sexe germinale d'embryons de souris, la morphologie, le phénotype immunologique et caractéristiques fonctionnelles conformes aux hESC dérivés de tératocarcinome Stevenson et embryoblast. Chez les chimères nées après l'introduction de l'ESC dans le blastocyste, la morphogenèse allophrénique des organes était caractérisée par une alternance mosaïque d'unités structurelles et fonctionnelles donneur et receveur du foie, des poumons et des reins. Dans un certain nombre de cas, on a observé la formation de cryptes ou de lobules intestinaux du foie, constitués simultanément des cellules du receveur et du donneur. Cependant, toujours la réalisation de la morphogenèse s'est produite selon le programme génétique de l'espèce à laquelle appartenait le receveur, et le chimérisme était limité uniquement au niveau cellulaire.

Ensuite, on a constaté que la prolifération des CSEh sans cytodifferentiation sur une des cellules mésenchymateuses dérivées couche-alimentation (fibroblastes foetaux) se produit en présence de LIF liant dans des milieux nutritifs sélectifs qui fournissent de manière sélective seulement la survie des cellules souches et progénitrices, alors que la grande majorité des éléments cellulaires spécialisés meurt. Avec l'aide de ces techniques en 1998 par James Thomson a alloué cinq lignées immortalisées de cellules souches embryonnaires à partir de la masse cellulaire interne d'une personne blastocyste. Cette même année, John Gerhart a mis au point un procédé pour isoler les lignes immortelles ESC de bouffée sexuelle d'embryons humains quatre, cinq semaines. En raison de leurs propriétés uniques, en seulement deux ans, les cellules souches embryonnaires et les cellules souches des tissus définitifs ont déjà commencé à être utilisés dans la pratique de la médecine régénérative et la thérapie génique.