Cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin

De toute évidence, les différents potentiels de prolifération et de différenciation des cellules souches hématopoïétiques sont déterminés par les particularités de leur développement ontogénétique, car même la localisation des principales zones d'hématopoïèse change chez l'homme au cours de l'ontogenèse. Les cellules progénitrices hématopoïétiques du sac vitellin fœtal sont dédiées à la formation d'une lignée cellulaire exclusivement érythropoïétique. Après la migration des CSH primaires vers le foie et la rate, le spectre des lignées d'engagement s'élargit dans le microenvironnement de ces organes. En particulier, les cellules souches hématopoïétiques acquièrent la capacité de générer des cellules de la lignée lymphoïde. En période prénatale, les cellules progénitrices hématopoïétiques atteignent leur zone de localisation finale et peuplent la moelle osseuse. Au cours du développement intra-utérin, le sang fœtal contient un nombre important de cellules souches hématopoïétiques. Par exemple, à la 13e semaine de grossesse, le taux de CSH atteint 18 % du nombre total de cellules sanguines mononucléées. Par la suite, on observe une diminution progressive de leur contenu, mais même avant la naissance, la quantité de CSH dans le sang du cordon ombilical diffère peu de leur quantité dans la moelle osseuse.

Selon les concepts classiques, la modification naturelle de la localisation de l'hématopoïèse au cours du développement embryonnaire des mammifères s'effectue par la migration et l'introduction dans un nouveau microenvironnement de cellules souches hématopoïétiques pluripotentes, du sac vitellin vers le foie, la rate et la moelle osseuse. Étant donné qu'aux premiers stades du développement embryonnaire, le tissu hématopoïétique contient un grand nombre de cellules souches, qui diminue avec la maturation du fœtus, le tissu hématopoïétique du foie embryonnaire, isolé à partir de matériel avorté entre 5 et 8 semaines de gestation, est considéré comme le plus prometteur pour l'obtention de cellules souches hématopoïétiques.

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Questions sur l'origine des cellules souches hématopoïétiques

Il ne fait aucun doute que la formation embryonnaire des érythrocytes prend naissance dans les îlots sanguins du sac vitellin. Cependant, le potentiel de différenciation in vitro des cellules hématopoïétiques du sac vitellin est très limité (elles se différencient principalement en érythrocytes). Il convient de noter que la transplantation de cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin ne permet pas de restaurer l'hématopoïèse avant longtemps. Il s'est avéré que ces cellules ne sont pas les précurseurs des CSH adultes. Les véritables CSH apparaissent plus tôt, entre la 3e et la 5e semaine du développement intra-utérin, dans la zone de formation du tissu gastrique et de l'endothélium vasculaire (splanchnopleure paraaortique, P-SP), ainsi qu'à la place de l'aorte, des gonades et des reins primaires, dans le mésonéphros ou région AGM. Il a été démontré que les cellules de la région AGM sont une source non seulement de cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais aussi de cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, ainsi que d'ostéoclastes impliqués dans la formation du tissu osseux. À la 6e semaine de gestation, les premières cellules progénitrices hématopoïétiques de la région AGM migrent vers le foie, qui demeure le principal organe hématopoïétique du fœtus jusqu'à la naissance.

Ce point étant extrêmement important du point de vue de la transplantation cellulaire, la question de l'origine des CSH au cours de l'embryogenèse humaine mérite une présentation plus détaillée. L'idée classique selon laquelle les cellules souches hématopoïétiques des mammifères et des oiseaux proviennent d'une source extraembryonnaire repose sur les études de Metcalf et Moore, qui furent les premiers à utiliser des méthodes de clonage de CSH et de leurs descendants isolés du sac vitellin. Les résultats de leurs travaux ont servi de base à la théorie de la migration, selon laquelle les CSH, apparues initialement dans le sac vitellin, peuplent successivement les organes hématopoïétiques transitoires et définitifs à mesure que le microenvironnement correspondant s'y forme. C'est ainsi qu'a été établi le point de vue selon lequel la génération de CSH, initialement localisées dans le sac vitellin, sert de base cellulaire à l'hématopoïèse définitive.

Les cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin appartiennent à la catégorie des cellules souches hématopoïétiques les plus précoces. Leur phénotype est décrit par la formule AA4.1+CD34+c-kit+. Contrairement aux cellules souches hématopoïétiques matures de la moelle osseuse, elles n'expriment pas les antigènes Sca-1 ni les molécules du CMH. Il semblerait que l'apparition d'antigènes marqueurs à la surface des membranes des cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin pendant la culture corresponde à leur différenciation au cours du développement embryonnaire avec la formation de lignées hématopoïétiques engagées: l'expression des antigènes CD34 et Thy-1 diminue, celle des antigènes CD38 et CD45RA augmente et les molécules HLA-DR apparaissent. Avec la spécialisation ultérieure in vitro, induite par des cytokines et des facteurs de croissance, l'expression d'antigènes spécifiques des cellules souches hématopoïétiques d'une lignée cellulaire donnée commence. Cependant, les résultats de l'étude de l'hématopoïèse embryonnaire chez des représentants de trois classes de vertébrés (amphibiens, oiseaux et mammifères) et, en particulier, l'analyse de l'origine des CSH responsables de l'hématopoïèse définitive lors de l'ontogenèse postnatale, contredisent les concepts classiques. Il a été établi que chez les représentants de toutes les classes considérées, deux régions indépendantes dans lesquelles les CSH apparaissent se forment au cours de l'embryogenèse. La région extraembryonnaire « classique » est représentée par le sac vitellin ou ses analogues, tandis que la zone intraembryonnaire récemment identifiée de localisation des CSH comprend le mésenchyme paraaortique et la région AGM. Aujourd'hui, on peut affirmer que chez les amphibiens et les oiseaux, les CSH définitives proviennent de sources intraembryonnaires, tandis que chez les mammifères et l'homme, la participation des CSH du sac vitellin à l'hématopoïèse définitive ne peut pas encore être totalement exclue.

L'hématopoïèse embryonnaire dans le sac vitellin est en fait une érythropoïèse primaire, caractérisée par la préservation du noyau à tous les stades de maturation érythrocytaire et la synthèse d'hémoglobine fœtale. Selon les données les plus récentes, la vague d'érythropoïèse primaire s'achève dans le sac vitellin au 8e jour du développement embryonnaire. Elle est suivie d'une période d'accumulation de cellules progénitrices érythroïdes définitives (BFU-E), qui se forment exclusivement dans le sac vitellin et apparaissent pour la première fois au 9e jour de gestation. Au stade suivant de l'embryogenèse, les cellules progénitrices érythroïdes définitives (CFU-E), ainsi que (!) les mastocytes et les CFU-GM, sont déjà formés. Ceci fonde l'hypothèse selon laquelle les cellules progénitrices définitives naissent dans le sac vitellin, migrent avec la circulation sanguine, se fixent dans le foie et initient rapidement la première phase de l'hématopoïèse intraembryonnaire. Selon ces concepts, le sac vitellin peut être considéré, d'une part, comme le site de l'érythropoïèse primaire, et d'autre part, comme la première source de cellules progénitrices hématopoïétiques définitives dans le développement embryonnaire.

Il a été démontré que des cellules formant des colonies à fort potentiel prolifératif peuvent être isolées du sac vitellin dès le huitième jour de gestation, c'est-à-dire bien avant la fermeture du système vasculaire de l'embryon et du sac vitellin. De plus, les cellules à fort potentiel prolifératif obtenues in vitro à partir du sac vitellin forment des colonies dont la taille et la composition cellulaire ne diffèrent pas des paramètres correspondants de la croissance en culture des cellules souches de moelle osseuse. Parallèlement, la retransplantation de cellules formant des colonies du sac vitellin à fort potentiel prolifératif produit un nombre significativement plus élevé de cellules filles formant des colonies et de cellules progénitrices multipotentes qu'avec les cellules progénitrices de moelle osseuse de l'hématopoïèse.

Français Une conclusion finale sur le rôle des cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin dans l'hématopoïèse définitive pourrait être fournie par les résultats du travail dans lequel les auteurs ont obtenu une lignée de cellules endothéliales du sac vitellin (G166), qui a efficacement soutenu la prolifération de ses cellules avec les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des HSC (AA4.1+WGA+, faible densité et faibles propriétés adhésives). Le contenu de ces dernières a augmenté de plus de 100 fois lorsqu'elles ont été cultivées sur une couche nourricière de cellules C166 pendant 8 jours. Des macrophages, des granulocytes, des mégacaryocytes, des cellules blastiques et des monocytes, ainsi que des cellules précurseurs de lymphocytes B et T ont été identifiés dans des colonies mixtes cultivées sur une sous-couche de cellules C166. Les cellules du sac vitellin poussant sur une sous-couche de cellules endothéliales avaient la capacité de s'auto-reproduire et ont résisté jusqu'à trois passages dans les expériences des auteurs. La restauration de l'hématopoïèse grâce à eux chez des souris matures atteintes d'immunodéficience combinée sévère (SCID) s'est accompagnée de la formation de tous les types de leucocytes, ainsi que de lymphocytes T et B. Cependant, les auteurs ont utilisé dans leurs études des cellules vitellines d'un embryon de 10 jours, chez lequel les systèmes vasculaires extra- et intra-embryonnaires sont déjà fermés, ce qui ne permet pas d'exclure la présence de cellules souches hématopoïétiques intra-embryonnaires parmi les cellules vitellines.

Français Dans le même temps, l'analyse du potentiel de différenciation des cellules hématopoïétiques des premiers stades de développement, isolées avant l'unification des systèmes vasculaires du sac vitellin et de l'embryon (8-8,5 jours de gestation), a révélé la présence de précurseurs de cellules T et B dans le sac vitellin, mais pas dans le corps de l'embryon. Dans le système in vitro, par la méthode de culture en deux étapes sur une monocouche de cellules épithéliales et sous-épithéliales du thymus, les cellules mononucléaires du sac vitellin se sont différenciées en lymphocytes T pré-T et T matures. Dans les mêmes conditions de culture, mais sur une monocouche de cellules stromales du foie et de la moelle osseuse, les cellules mononucléaires du sac vitellin se sont différenciées en cellules B pré-B et en lymphocytes B IglVT matures.

Les résultats de ces études indiquent la possibilité de développement de cellules du système immunitaire à partir de tissu extraembryonnaire du sac vitellin, et la formation de lignées primaires de cellules T et B dépend de facteurs du microenvironnement stromal des organes hématopoïétiques embryonnaires.

D'autres auteurs ont également montré que le sac vitellin contient des cellules à potentiel de différenciation lymphoïde, et que les lymphocytes qui en résultent ne diffèrent pas, en termes de caractéristiques antigéniques, de ceux des animaux sexuellement matures. Il a été établi que les cellules du sac vitellin d'un embryon de 8 à 9 jours sont capables de restaurer la lymphopoïèse dans le thymus athymocyte avec l'émergence de lymphocytes matures CD3+CD4+- et CD3+CD8+- possédant un répertoire formé de récepteurs des lymphocytes T. Ainsi, le thymus peut être peuplé de cellules d'origine extraembryonnaire, mais il est impossible d'exclure la migration probable de cellules précurseurs précoces des lymphocytes T provenant de sources intraembryonnaires de lymphopoïèse vers le thymus.

Parallèlement, la transplantation de cellules hématopoïétiques du sac vitellin chez des receveurs adultes irradiés n'entraîne pas toujours une repopulation à long terme des zones de localisation du tissu hématopoïétique appauvri, et in vitro, les cellules du sac vitellin forment significativement moins de colonies spléniques que les cellules de la région AGM. Dans certains cas, l'utilisation de cellules du sac vitellin d'un embryon de 9 jours permet encore une repopulation à long terme (jusqu'à 6 mois) du tissu hématopoïétique chez les receveurs irradiés. Les auteurs estiment que les cellules du sac vitellin présentant le phénotype CD34+c-kit+ non seulement ne diffèrent pas de celles de la région AGM dans leur capacité à repeupler les organes hématopoïétiques appauvris, mais restaurent également l'hématopoïèse plus efficacement, le sac vitellin en contenant près de 37 fois plus.

Il convient de noter que les expériences ont utilisé des cellules hématopoïétiques du sac vitellin portant des antigènes marqueurs de cellules souches hématopoïétiques (c-kit+ et/ou CD34+ et CD38+), injectées directement dans le foie ou la veine abdominale de la progéniture de souris femelles ayant reçu une injection de busulfan au 18e jour de gestation. Chez ces nouveau-nés, leur propre myélopoïèse a été fortement inhibée en raison de l'élimination des cellules souches hématopoïétiques induite par le busulfan. Après transplantation de cellules souches hématopoïétiques du sac vitellin, des éléments figurés contenant le marqueur donneur – la glycérophosphate déshydrogénase – ont été détectés dans le sang périphérique des receveurs pendant 11 mois. Il a été constaté que les CSH du sac vitellin restaurent le contenu en cellules des lignées lymphoïdes, myéloïdes et érythroïdes dans le sang, le thymus, la rate et la moelle osseuse, et que le niveau de chimérisme était plus élevé en cas d'administration intrahépatique plutôt qu'intraveineuse de cellules du sac vitellin. Les auteurs pensent que les cellules souches hématopoïétiques vitellines des embryons à un stade précoce (jusqu'à 10 jours) nécessitent une interaction préalable avec le microenvironnement hématopoïétique du foie pour peupler avec succès les organes hématopoïétiques des receveurs adultes. Il est possible qu'il existe un stade de développement unique dans l'embryogenèse, où les cellules vitellines, migrant initialement vers le foie, acquièrent ensuite la capacité de peupler le stroma des organes hématopoïétiques des receveurs matures.

À cet égard, il convient de noter que le chimérisme des cellules du système immunitaire est assez souvent observé après la transplantation de cellules de moelle osseuse à des receveurs matures irradiés - dans le sang de ces derniers, les cellules du phénotype donneur se trouvent en assez grande quantité parmi les lymphocytes B, T et les granulocytes du receveur, qui se poursuit pendant au moins 6 mois.

Chez les mammifères, les cellules hématopoïétiques sont détectées pour la première fois par des méthodes morphologiques au 7e jour du développement embryonnaire et sont représentées par des îlots hématopoïétiques à l'intérieur des vaisseaux du sac vitellin. Cependant, la différenciation hématopoïétique naturelle dans le sac vitellin se limite aux érythrocytes primaires qui retiennent les noyaux et synthétisent l'hémoglobine fœtale. Néanmoins, on pensait traditionnellement que le sac vitellin était la seule source de CSH migrant vers les organes hématopoïétiques de l'embryon en développement et assurant l'hématopoïèse définitive chez l'animal adulte, car l'apparition des CSH dans le corps de l'embryon coïncide avec la fermeture des systèmes vasculaires du sac vitellin et de l'embryon. Ce point de vue est corroboré par des données montrant que les cellules du sac vitellin, clonées in vitro, donnent naissance à des granulocytes et des macrophages, et in vivo à des colonies spléniques. Ensuite, au cours d'expériences de transplantation, il a été établi que les cellules hématopoïétiques du sac vitellin, qui dans le sac vitellin lui-même ne sont capables de se différencier qu'en érythrocytes primaires, acquièrent dans le microenvironnement hépatique des souris SCID nouveau-nées et adultes, le thymus appauvri ou le stroma nourricier, la capacité de repeupler les organes hématopoïétiques avec la restauration de toutes les lignées hématopoïétiques, même chez les animaux receveurs adultes. En principe, cela nous permet de les classer comme de véritables CSH, c'est-à-dire des cellules qui fonctionnent pendant la période postnatale. On suppose que le sac vitellin, avec la région AGM, sert de source de CSH pour l'hématopoïèse définitive chez les mammifères, mais leur contribution au développement du système hématopoïétique reste floue. La signification biologique de l'existence de deux organes hématopoïétiques aux fonctions similaires au début de l'embryogenèse des mammifères est également incertaine.

La recherche de réponses à ces questions se poursuit. In vivo, il a été possible de prouver la présence dans le sac vitellin d'embryons âgés de 8 à 8,5 jours de cellules restaurant la lymphopoïèse chez des souris SCID irradiées de manière sublétale et présentant un déficit prononcé en lymphocytes T et B. Des cellules hématopoïétiques du sac vitellin ont été injectées par voie intrapéritonéale et directement dans la rate et le foie. Après 16 semaines, des lymphocytes T TCR/CD34 CD4+ et CD8+ et des lymphocytes B B-220+IgM+ marqués par les gènes antrx du CMH du donneur ont été détectés chez les receveurs. Parallèlement, les auteurs n'ont pas trouvé de cellules souches capables de restaurer le système immunitaire dans l'organisme des embryons âgés de 8 à 8,5 jours.

Les cellules hématopoïétiques du sac vitellin présentent un potentiel prolifératif élevé et sont capables d'autoreproduction prolongée in vitro. Certains auteurs identifient ces cellules comme des CSH en raison de la génération prolongée (près de 7 mois) de cellules progénitrices érythroïdes, qui se distinguent des cellules progénitrices de la moelle osseuse de la lignée érythroïde par une période de passage plus longue, des colonies plus grandes, une sensibilité accrue aux facteurs de croissance et une prolifération plus longue. De plus, dans des conditions appropriées de culture in vitro de cellules du sac vitellin, des cellules progénitrices lymphoïdes se forment également.

Les données présentées permettent généralement de considérer le sac vitellin comme une source de CSH, moins engagées et donc dotées d'un potentiel prolifératif supérieur à celui des cellules souches de la moelle osseuse. Cependant, malgré le fait que le sac vitellin contienne des cellules progénitrices hématopoïétiques pluripotentes qui maintiennent in vitro diverses lignées de différenciation hématopoïétique pendant une longue période, le seul critère d'exhaustivité des CSH est leur capacité à repeupler à long terme les organes hématopoïétiques du receveur, dont les cellules hématopoïétiques sont détruites ou génétiquement défectueuses. Ainsi, la question clé est de savoir si les cellules hématopoïétiques pluripotentes du sac vitellin peuvent migrer et peupler les organes hématopoïétiques et s'il est opportun de réviser les travaux connus démontrant leur capacité à repeupler les organes hématopoïétiques des animaux matures avec formation des principales lignées hématopoïétiques. Des sources intraembryonnaires de GSC définitives ont été identifiées chez des embryons d'oiseaux dès les années 1970, ce qui remettait déjà en question les idées reçues sur l'origine extraembryonnaire des GSC, y compris chez d'autres vertébrés. Ces dernières années, des publications ont fait état de la présence de zones intraembryonnaires similaires contenant des GSC chez les mammifères et les humains.

Il convient de souligner une fois de plus que les connaissances fondamentales dans ce domaine sont extrêmement importantes pour la transplantation cellulaire pratique, car elles permettent non seulement de déterminer la source privilégiée de CSH, mais aussi d'établir les caractéristiques de l'interaction des cellules hématopoïétiques primaires avec un organisme génétiquement étranger. Il est connu que l'introduction de cellules souches hématopoïétiques de foie fœtal humain dans un embryon de mouton au stade de l'organogenèse conduit à la naissance d'animaux chimères, dont le sang et la moelle osseuse contiennent 3 à 5 % de cellules hématopoïétiques humaines de manière stable. Parallèlement, les CSH humaines ne modifient pas leur caryotype, conservant un taux de prolifération élevé et une capacité de différenciation. De plus, les CSH xénogéniques transplantées n'entrent pas en conflit avec le système immunitaire et les phagocytes de l'organisme hôte et ne se transforment pas en cellules tumorales, ce qui a servi de base au développement intensif de méthodes de correction intra-utérine des pathologies génétiques héréditaires à l'aide de CSH ou de CSE transfectées avec des gènes déficients.

Mais à quel stade de l'embryogenèse est-il plus approprié de procéder à une telle correction? Pour la première fois, des cellules déterminées pour l'hématopoïèse apparaissent chez les mammifères immédiatement après l'implantation (6e jour de gestation), alors que les signes morphologiques de différenciation hématopoïétique et les organes hématopoïétiques présumés sont encore absents. À ce stade, les cellules dispersées de l'embryon de souris sont capables de repeupler les organes hématopoïétiques des receveurs irradiés avec la formation d'érythrocytes et de lymphocytes qui diffèrent des cellules hôtes par le type d'hémoglobine ou de glycérophosphate isomérase, respectivement, ainsi que d'un marqueur chromosomique supplémentaire (Tb) des cellules donneuses. Chez les mammifères, comme chez les oiseaux, simultanément avec le sac vitellin, avant la fermeture du lit vasculaire commun, les cellules hématopoïétiques apparaissent directement dans le corps de l'embryon dans la splanchnopleure para-aortique. Des cellules hématopoïétiques de phénotype AA4.1+ ont été isolées de la région AGM et caractérisées comme des cellules hématopoïétiques multipotentes formant des lymphocytes T et B, des granulocytes, des mégacaryocytes et des macrophages. Phénotypiquement, ces cellules progénitrices multipotentes sont très proches des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse des animaux adultes (CD34+c-kit+). Le nombre de cellules AA4.1+ multipotentes parmi l'ensemble des cellules de la région AGM est faible: elles ne représentent pas plus d'un douzième de sa surface.

Chez l'embryon humain, une région intraembryonnaire contenant des CSH homologues à la région AGM des animaux a également été identifiée. De plus, chez l'homme, plus de 80 % des cellules multipotentes à fort potentiel prolifératif sont présentes dans le corps de l'embryon, bien que ces cellules soient également présentes dans le sac vitellin. Une analyse détaillée de leur localisation a montré que des centaines de ces cellules sont regroupées en groupes compacts situés à proximité immédiate de l'endothélium de la paroi ventrale de l'aorte dorsale. Phénotypiquement, il s'agit de cellules CD34CD45+Lin. En revanche, dans le sac vitellin, ainsi que dans d'autres organes hématopoïétiques de l'embryon (foie, moelle osseuse), ces cellules sont uniques.

Par conséquent, chez l'embryon humain, la région AGM contient des amas de cellules hématopoïétiques étroitement associés à l'endothélium ventral de l'aorte dorsale. Ce contact est également observé au niveau immunochimique: les cellules des amas hématopoïétiques et les cellules endothéliales expriment le facteur de croissance endothélial vasculaire, le ligand Flt-3, leurs récepteurs FLK-1 et STK-1, ainsi que le facteur de transcription des cellules souches leucémiques. Dans la région AGM, les dérivés mésenchymateux sont représentés par un dense cordon de cellules arrondies situé le long de l'aorte dorsale et exprimant la ténascine C, une glycoprotéine de la substance fondamentale impliquée dans les processus d'interaction et de migration intercellulaires.

Après transplantation, les cellules souches multipotentes de la région AGM restaurent rapidement l'hématopoïèse chez les souris matures irradiées et assurent une hématopoïèse efficace pendant une longue période (jusqu'à 8 mois). Les auteurs n'ont pas trouvé de cellules présentant de telles propriétés dans le sac vitellin. Les résultats de cette étude sont confirmés par les données d'une autre étude, qui a montré que chez les embryons aux premiers stades de développement (10,5 jours), la région AGM est la seule source de cellules correspondant à la définition des CSH, restaurant l'hématopoïèse myéloïde et lymphoïde chez les receveurs matures irradiés.

La lignée stromale AGM-S3 a été isolée de la région AGM, dont les cellules favorisent la production de cellules progénitrices engagées (CFU-GM, BFU-E, CFU-E) et d'unités formant des colonies de type mixte en culture. La teneur de ces dernières lors de la culture sur une sous-couche nourricière de cellules de la lignée AGM-S3 est multipliée par 10 à 80. Ainsi, le microenvironnement de la région AGM contient des cellules de base du stroma qui favorisent efficacement l'hématopoïèse. La région AGM elle-même pourrait donc agir comme un organe hématopoïétique embryonnaire, source de cellules souches hématopoïétiques définitives, c'est-à-dire de cellules souches hématopoïétiques qui forment le tissu hématopoïétique d'un animal adulte.

L'immunophénotypage étendu de la composition cellulaire de la région AGM a montré qu'elle contient non seulement des cellules hématopoïétiques multipotentes, mais aussi des cellules impliquées dans la différenciation myéloïde et lymphoïde (lymphocytes T et B). Cependant, l'analyse moléculaire de cellules CD34+c-kit+ individuelles de la région AGM par réaction en chaîne par polymérase a révélé l'activation des seuls gènes de la bêta-globine et de la myéloperoxydase, mais pas des gènes lymphoïdes codant pour la synthèse des CD34, Thy-1 et 15. L'activation partielle de gènes spécifiques à la lignée est caractéristique des premiers stades ontogénétiques de la génération des CSH et des cellules progénitrices. Considérant que le nombre de cellules progénitrices engagées dans la région AGM d'un embryon de 10 jours est de 2 à 3 ordres de grandeur inférieur à celui du foie, on peut affirmer qu'au 10e jour de l'embryogenèse, l'hématopoïèse dans la région AGM ne fait que commencer, alors que dans l'organe hématopoïétique principal du fœtus pendant cette période, les lignées hématopoïétiques se sont déjà développées.

Français En effet, contrairement aux cellules souches hématopoïétiques antérieures (9-11 jours) du sac vitellin et de la région AGM, qui repeuplent le microenvironnement hématopoïétique du nouveau-né, mais pas l'organisme adulte, les cellules progénitrices hématopoïétiques du foie embryonnaire de 12-17 jours ne nécessitent plus de microenvironnement postnatal précoce et peuplent les organes hématopoïétiques d'un animal adulte aussi bien qu'un nouveau-né. Après transplantation de CSH de foie embryonnaire, l'hématopoïèse chez les souris receveuses adultes irradiées avait un caractère polyclonal. De plus, en utilisant des colonies marquées, il a été démontré que le fonctionnement des clones greffés est entièrement soumis à la succession clonale révélée dans la moelle osseuse adulte. Par conséquent, les cellules souches hématopoïétiques embryonnaires hépatiques, marquées dans les conditions les plus douces, sans préstimulation avec des cytokines exogènes, possèdent déjà les principaux attributs des cellules souches hématopoïétiques adultes: elles ne nécessitent pas de microenvironnement post-embryonnaire précoce, entrent dans un état de dormance profonde après la transplantation et sont mobilisées dans la formation clonale de manière séquentielle conformément au modèle de succession clonale.

Il est évidemment nécessaire d'approfondir le phénomène de succession clonale. L'érythropoïèse est assurée par des cellules souches hématopoïétiques dotées d'un potentiel prolifératif élevé et capables de se différencier en toutes les lignées de cellules précurseurs des cellules sanguines. À intensité normale d'hématopoïèse, la plupart des cellules souches hématopoïétiques sont en dormance et sont mobilisées pour la prolifération et la différenciation, formant séquentiellement des clones qui se remplacent. Ce processus est appelé succession clonale. Des preuves expérimentales de la succession clonale dans le système hématopoïétique ont été obtenues lors d'études sur des CSH marquées par transfert de gènes rétroviraux. Chez l'animal adulte, l'hématopoïèse est maintenue par de nombreux clones hématopoïétiques fonctionnant simultanément, dérivés des CSH. Sur la base du phénomène de succession clonale, une approche de repeuplement pour l'identification des CSH a été développée. Selon ce principe, on distingue les cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC), capables de restaurer le système hématopoïétique tout au long de la vie, et les HSC à court terme, qui remplissent cette fonction pendant une période de temps limitée.

Si l'on considère les cellules souches hématopoïétiques du point de vue de la repopulation, la particularité des cellules souches hématopoïétiques du foie embryonnaire réside dans leur capacité à créer des colonies significativement plus grandes que celles des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ou de la moelle osseuse, et ce, quel que soit le type de colonies. Ce seul fait témoigne d'un potentiel prolifératif plus élevé. Une propriété unique des cellules souches hématopoïétiques du foie embryonnaire est un cycle cellulaire plus court que celui d'autres sources, ce qui est crucial pour l'efficacité de la repopulation des organes hématopoïétiques lors de la transplantation. L'analyse de la composition cellulaire de la suspension hématopoïétique obtenue à partir de sources d'organisme mature indique qu'à tous les stades de l'ontogenèse, les cellules nucléaires sont majoritairement représentées par des cellules finalement différenciées, dont le nombre et le phénotype dépendent de l'âge ontogénétique du donneur de tissu hématopoïétique. En particulier, les suspensions de cellules mononucléaires de la moelle osseuse et du sang de cordon ombilical sont constituées de plus de 50 % de cellules matures de la série lymphoïde, tandis que le tissu hématopoïétique du foie embryonnaire contient moins de 10 % de lymphocytes. De plus, les cellules de la lignée myéloïde du foie embryonnaire et fœtal sont principalement représentées par la série érythroïde, tandis que dans le sang de cordon et la moelle osseuse, ce sont les éléments granulocytes-macrophages qui prédominent.

Il est également important que le foie embryonnaire contienne un ensemble complet des premiers précurseurs hématopoïétiques. Parmi ces derniers, il convient de noter les cellules érythroïdes, granulopoïétiques, mégacaryopoïétiques et les cellules formant des colonies multilignées. Leurs précurseurs plus primitifs – les LTC-IC – sont capables de proliférer et de se différencier in vitro pendant cinq semaines ou plus, et conservent également leur activité fonctionnelle après greffe dans l'organisme du receveur lors de transplantations allogéniques, voire xénogéniques, chez des animaux immunodéficients.

L'intérêt biologique de la prédominance des cellules érythroïdes dans le foie embryonnaire (jusqu'à 90 % du nombre total d'éléments hématopoïétiques) est dû à la nécessité d'alimenter en érythrocytes le volume sanguin en croissance rapide du fœtus en développement. Dans le foie embryonnaire, l'érythropoïèse est représentée par des précurseurs érythroïdes nucléaires de divers degrés de maturité contenant de l'hémoglobine fœtale (a2u7) qui, grâce à sa plus grande affinité pour l'oxygène, assure une absorption efficace de cette dernière à partir du sang maternel. L'intensification de l'érythropoïèse dans le foie embryonnaire est associée à une augmentation locale de la synthèse d'érythropoïétine (EPO). Il est à noter que la présence d'érythropoïétine seule suffit à l'épanouissement du potentiel hématopoïétique des cellules hématopoïétiques du foie embryonnaire, tandis qu'une combinaison de cytokines et de facteurs de croissance, composée d'EPO, de SCF, de GM-CSF et d'IL-3, est nécessaire à l'engagement des CSH de la moelle osseuse et du sang de cordon dans l'érythropoïèse. Parallèlement, les cellules progénitrices hématopoïétiques précoces isolées du foie embryonnaire, dépourvues de récepteurs à l'EPO, ne répondent pas à l'érythropoïétine exogène. Pour l'induction de l'érythropoïèse dans une suspension de cellules mononucléaires du foie embryonnaire, la présence de cellules plus avancées, sensibles à l'érythropoïétine et présentant le phénotype CD34+CD38+, exprimant le récepteur à l'EPO, est nécessaire.

Dans la littérature, il n'existe toujours pas de consensus sur le développement de l'hématopoïèse pendant la période embryonnaire. La signification fonctionnelle de l'existence de sources extra- et intra-embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques n'a pas été établie. Cependant, il ne fait aucun doute que, dans l'embryogenèse humaine, le foie est l'organe central de l'hématopoïèse et, entre la 6e et la 12e semaine de gestation, il constitue la principale source de cellules souches hématopoïétiques qui peuplent la rate, le thymus et la moelle osseuse. Les GDR assurent l'exécution des fonctions correspondantes pendant les périodes de développement pré- et postnatal.

Il convient de noter une fois de plus que le foie embryonnaire, comparé aux autres sources, se caractérise par la teneur la plus élevée en cellules souches hématopoïétiques (CSH). Environ 30 % des cellules CD344 du foie embryonnaire présentent le phénotype CD38. Parallèlement, le nombre de cellules progénitrices lymphoïdes (CD45+) aux premiers stades de l'hématopoïèse hépatique ne dépasse pas 4 %. Il a été établi qu'au cours du développement fœtal, de 7 à 17 semaines de gestation, le nombre de lymphocytes B augmente progressivement par palier mensuel de 1,1 %, tandis que le taux de CSH diminue de manière permanente.

L'activité fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques dépend également de la période de développement embryonnaire de leur source. L'étude de l'activité de formation de colonies de cellules hépatiques d'embryons humains à 6-8 et 9-12 semaines de gestation, cultivées en milieu semi-liquide en présence de SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 et EPO, a montré que le nombre total de colonies est 1,5 fois plus élevé lors de l'ensemencement de CSH de foie embryonnaire à des stades précoces de développement. Parallèlement, le nombre de cellules progénitrices de la myélopoïèse, telles que CFU-GEMM, dans le foie à 6-8 semaines d'embryogenèse est plus de trois fois supérieur à leur nombre à 9-12 semaines de gestation. En général, l'activité de formation de colonies des cellules hépatiques hématopoïétiques d'embryons au premier trimestre de gestation était significativement plus élevée que celle des cellules hépatiques fœtales au deuxième trimestre de la grossesse.

Les données ci-dessus indiquent que le foie embryonnaire au début de l'embryogenèse se distingue non seulement par une teneur accrue en cellules progénitrices hématopoïétiques précoces, mais aussi par un spectre de différenciation plus large en diverses lignées cellulaires. Ces caractéristiques de l'activité fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques du foie embryonnaire pourraient avoir une certaine importance clinique, car leurs caractéristiques qualitatives permettent d'espérer un effet thérapeutique prononcé lors de la transplantation, même d'un petit nombre de cellules obtenues aux premiers stades de la gestation.

Néanmoins, la question de la quantité de cellules souches hématopoïétiques nécessaire à une transplantation efficace reste ouverte et pertinente. Des tentatives sont en cours pour la résoudre en exploitant le fort potentiel d'autoreproduction des cellules hématopoïétiques du foie embryonnaire in vitro, stimulées par des cytokines et des facteurs de croissance. Grâce à une perfusion constante de cellules souches hématopoïétiques hépatiques embryonnaires précoces dans un bioréacteur, il est possible d'obtenir, après 2 à 3 jours, une quantité de cellules souches hématopoïétiques 15 fois supérieure à leur niveau initial. À titre de comparaison, il convient de noter qu'il faut au moins deux semaines pour multiplier par 20 la production de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon humain dans les mêmes conditions.

Ainsi, le foie embryonnaire se distingue des autres sources de cellules souches hématopoïétiques par une teneur plus élevée en cellules progénitrices hématopoïétiques engagées et précoces. En culture avec des facteurs de croissance, les cellules hépatiques embryonnaires de phénotype CD34+CD45Ra1 CD71l0W forment 30 fois plus de colonies que des cellules similaires du sang de cordon et 90 fois plus que les cellules souches hématopoïétiques de moelle osseuse. Les différences les plus marquées entre les sources spécifiées résident dans la teneur en cellules progénitrices hématopoïétiques précoces qui forment des colonies mixtes: la quantité de CFU-GEMM dans le foie embryonnaire est respectivement 60 et 250 fois supérieure à celle du sang de cordon et de la moelle osseuse.

Il est également important que jusqu'à la 18e semaine de développement embryonnaire (période de début de l'hématopoïèse dans la moelle osseuse), plus de 60 % des cellules hépatiques participent à la fonction hématopoïétique. Le fœtus humain étant dépourvu de thymus et, par conséquent, de thymocytes jusqu'à la 13e semaine de développement, la transplantation de cellules hématopoïétiques issues de foie embryonnaire de 6 à 12 semaines de gestation réduit significativement le risque de réaction du greffon contre l'hôte et ne nécessite pas la sélection d'un donneur histocompatible, car elle facilite l'obtention d'un chimérisme hématopoïétique.