Modèles expérimentaux de l'arthrose

Le cartilage est un tissu hautement spécialisé contenant un seul type de cellules (chondrocytes), caractérisé par l'absence de vaisseaux sanguins et lymphatiques. La nutrition du cartilage est principalement réalisée par absorption à partir du liquide synovial. Le métabolisme des chondrocytes est régulé par un certain nombre de facteurs solubles produits localement par les chondrocytes et les tissus environnants. La fonction des chondrocytes dépend également de la composition du milieu extracellulaire (tension d'oxygène, concentration en ions, pH, etc.), de la composition du VCM, de l'interaction entre les cellules et les matrices, des signaux physiques. La tâche principale de la modélisation expérimentale est la création de cultures dans l'environnement extracellulaire sans modifier le phénotype des cellules matures. La deuxième tâche consiste à créer des cultures pour étudier la réponse prématurée, retardée, à court ou à long terme des chondrocytes à des signaux chimiques et / ou physiques. Des études in vitro fournissent également l'occasion d'étudier le comportement des chondrocytes dans l' arthrose. La troisième tâche est le développement de systèmes co-curatifs qui permettent d'étudier les interactions de divers tissus dans l'articulation. La quatrième tâche est la préparation d'implants cartilagineux pour la transplantation ultérieure. Enfin, la cinquième tâche consiste à étudier des facteurs de croissance, des cytokines ou des agents thérapeutiques capables de stimuler la réparation et / ou d'inhiber sa résorption du cartilage.

Au cours des dernières décennies, divers modèles de cultures de cellules cartilagineuses articulaires ont été créés, y compris des cultures monocouches, des cultures en suspension, des cultures de chondron, des explants, des cocultures, des cultures de cellules immortelles. Chaque culture a ses avantages et ses inconvénients et chacune convient à l'étude d'un aspect particulier du métabolisme des chondrocytes. Ainsi, les explants cartilagineux sont un excellent modèle pour étudier le renouvellement des éléments de la matrice, ce qui nécessite de véritables récepteurs de surface cellulaire et des interactions cellule-matrice et matrice-cellule normales. Dans le même temps, l'étude des dépôts dans la matrice ou des mécanismes de régulation du métabolisme des chondrocytes est recommandée pour être réalisée sur une culture de cellules isolées. Une culture mono-couche à faible densité est nécessaire pour étudier le processus de différenciation cellulaire. Les cultures en suspension dans une matrice naturelle ou synthétique sont un modèle pour l'analyse de la réponse adaptative des chondrocytes au stress mécanique.

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Cultures de chondrocytes

Lors du choix du tissu cartilagineux pour des études in vitro, plusieurs points importants doivent être pris en compte. La composition de la matrice et l'activité métabolique des chondrocytes varient dans différentes articulations, et cette dernière dépend également de la profondeur du chondrocyte dans le tissu. Ces données ont été obtenues dans plusieurs expériences dans lesquelles des sous-populations isolées de chondrocytes provenant des zones de cartilage de différentes profondeurs ont été étudiées. Un certain nombre de différences morphologiques et biochimiques ont été trouvées entre les chondrocytes cultivés situés à la surface et les couches profondes du cartilage articulaire. Les cellules de surface synthétisent une rare matrice fibrillaire protéoglycane appauvrie, tandis que les cellules plus profondes produisent une matrice riche en fibrilles et en protéoglycanes. De plus, les cellules de surface produisent relativement plus de petits protéoglycanes non agrégés et d'acide hyaluronique et relativement moins d'aggrécane et de sulfate de kératane que les chondrocytes plus profondément localisés. Une autre caractéristique importante du métabolisme des chondrocytes isolés des zones cartilagineuses de différentes profondeurs est la réponse au stimulus exogène. Selon M. Aydelotte et ses co-auteurs, les chondrocytes taureaux de la zone superficielle du cartilage étaient plus sensibles à l'IL-1 que les cellules de la zone profonde.

Le comportement des cellules dépend également de l'emplacement du tissu. Chondrocytes bords du cartilage et de l' oreille, provenant du même animal qui réagissent différemment aux facteurs de croissance tels que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), et TGF-bêta. FGF a augmenté l'incorporation de thymidine, de proline et de leucine dans la culture de chondrocyte de la nervure, mais pas l'oreille. TGF-P a augmenté l'incorporation de thymidine dans la nervure de chondrocytes du cartilage et de l' oreille, mais n'a eu aucun effet sur l' incorporation de thymidine dans les chondrocytes et l' oreille proline. Les cellules cartilagineuses obtenues à partir des zones les plus chargées diffèrent de celles des sites à faible charge sur le cartilage. Par exemple, les chondrocytes matures du cartilage de la surface mouton articulation du genou à partir de la région centrale de articulaire tibiale osseuse ne sont pas couverts par le ménisque, qui porte la plus grande charge in vivo, l' aggrécane synthétisé plus petit, la décorine , mais plus grandes que les cellules des zones couvertes par le ménisque. Les auteurs soulignent également l'importance d'utiliser du cartilage provenant de zones articulaires identiques lors de l'examen de la fonction synthétique des articulations.

Le métabolisme des chondrocytes et leur réponse aux facteurs régulateurs dépendent aussi de manière significative de l'âge du donneur, du développement de son squelette et de l'état des articulations à partir desquelles les cellules sont prélevées. Dans les chondrocytes humains, une diminution significative avec l'âge de la réponse proliférative est observée. La plus forte diminution est observée chez les donneurs âgés de 40 à 50 ans et de plus de 60 ans. De plus, la sévérité de la réponse proliférative aux facteurs de croissance (par exemple FGF et TGF-bêta) diminue au cours du vieillissement. En plus des changements quantitatifs dans la prolifération des chondrocytes, il y a aussi des changements qualitatifs. Les cellules des jeunes donneurs (âgées de 10 à 20 ans) réagissent mieux au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) qu'au TGF-bêta, alors que l'inverse est observé dans les cellules du donneur adulte. Pour expliquer les changements de la fonction de synthèse des chondrocytes en fonction de l'âge et leur réponse à l'effet des facteurs de croissance, plusieurs mécanismes sont utilisés. Parmi eux, une diminution du nombre et de l'affinité des récepteurs cellulaires de surface, un changement dans la synthèse et la bioactivité des facteurs de croissance et des cytokines, et la modification des signaux postrécepteurs.

L'état pathologique des articulations modifie également la morphologie et l'activité métabolique des chondrocytes. Ainsi, J. Kouri et co-auteurs (1996) ont identifié trois sous-populations de chondrocytes dans le cartilage avec arthrose. Les chondrocytes du centre superficiel et supérieur du cartilage forment des amas et synthétisent plus de protéoglycanes et de collagène. Le TGF-bêta et le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) sont capables de stimuler la synthèse des protéoglycanes par les chondrocytes et de neutraliser partiellement les effets de l'IL-1 et du TNF-a. Les explants de cartilage affectés par l'arthrose et les chondrocytes isolés du cartilage d'un patient souffrant d'arthrose sont plus sensibles à la stimulation du TGF-bêta que les chondrocytes du cartilage sain. Ces différences sont très probablement associées à des changements phénotypiques dans les chondrocytes dans les couches supérieures du cartilage articulaire.

L'isolement des chondrocytes individuels est réalisé par un traitement séquentiel avec des enzymes protéolytiques d'ECM. Après leur libération de l'ECM, les cellules isolées sont idéales pour l'étude de la synthèse de composants matriciels de novo. Certains auteurs n'utilisent que la clostridium collagénase, d'autres pré-incubent le cartilage avec la trypsine, la pronase, la DNase et / ou la hyaluronidase. Le nombre de cellules isolées dépend des enzymes utilisées. Ainsi, lors du traitement de l' un de 1 g de tissu de collagénase peut être obtenu 1,4T0 ⁶ chondrocytes, alors que l'utilisation de la pronase, l' hyaluronidase et de la collagénase - 4,3-10 ⁶. Lors du traitement avec la collagénase, l'aggrécane, les protéines, l'IL-6, l'IL-8 restent beaucoup plus dans la culture cellulaire que dans le cas d'un traitement séquentiel avec diverses enzymes. Il y a plusieurs explications à ces différences entre les deux cultures cellulaires:

• des récepteurs cellulaires endommagés ou déprimé par l'action d'enzymes, le TGF-bêta inhibe la synthèse d'ADN de protéoglycanes dans les chondrocytes fraîchement isolés (jour 1), tandis que l'ADN et la synthèse des protéoglycanes de chondrocytes cultivés en monocouche (7 jours) stimulées par le TGF-bêta. Cependant, pour réexprimer ces composants membranaires, une période adéquate est nécessaire avant le début de l'expérience.
• Les protéases exogènes peuvent rompre l'interaction des cellules et de la matrice, médiée par les intégrines. La famille des intégrines favorise la fixation des chondrocytes aux molécules VKM (Shakibaei M. Et al., 1997) Cette rupture peut affecter l'expression des gènes de la matrice.
• Les résidus de composants de la matrice peuvent réguler la fonction synthétique des chondrocytes. Les intégrines sont capables de reconnaître les produits de dégradation de l'ECM, jouant ainsi un rôle important dans la réparation tissulaire après exposition aux enzymes protéolytiques. T. Larsson et ses co-auteurs (1989) ont rapporté que l'addition de pro-théoglycanes intacts ou fragmentés à la culture cellulaire stimule la synthèse de protéines et de protéoglycanes. Cependant, les niveaux élevés de l'acide hyaluronique provoque une réduction significative de l'inclusion de sulfate protéoglycanes par synthèse chondrocytes chondrocytes d'embryon de poulet matures cellules porcines et chondrosarcome de rat. De plus, l'acide hyaluronique - inhibiteur de la libération de protéoglycanes par les cellules, même en présence d'IL-lb, le TNF-a, FGF, ce qui indique que la première contrecarrer l'activité biologique de facteurs de croissance et cytokines. Le mécanisme exact qui sous-tend l'action de l'acide hyaluronique reste incertain; On sait que les chondrocytes contiennent un récepteur de l'acide hyaluronique, associé aux filaments d'actine du cytosol. La liaison de l'acide hyaluronique à son récepteur stimule la phosphorylation des protéines. Ainsi, ces données démontrent la modulation de la fonction métabolique des chondrocytes par des molécules fragmentées ou natives de protéines matricielles en activant les cellules réceptrices membranaires.
• La stimulation rapide par les enzymes de la synthèse des protéines matricielles par les chondrocytes peut être une conséquence d'un changement de la forme des chondrocytes et / ou de la réorganisation du cytosquelette.
• Certaines cytokines (par exemple, IL-8) et des facteurs de croissance (par exemple, IGF-1, TGF-P) sont fixés dans l'ECM. L'exemple le plus connu est la liaison du TGF-bêta avec le décore, ce qui conduit à une diminution de la capacité du premier à induire la croissance cellulaire dans les cellules ovariennes chez les hamsters chinois. Les données que le contenu de la décoration cartilagineuse augmente avec l'âge, indiquent une diminution de la biodisponibilité du TGF-bêta dans le vieillissement. Les facteurs de croissance et les cytokines peuvent être libérés des résidus de la matrice pendant la culture, puis moduler la fonction chondrocytaire.

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Culture monocouche de chondrocytes

Le phénotype différencié des chondrocytes se caractérise principalement par la synthèse de collagène de type II et de protéoglycanes spécifiques des tissus, ainsi que par un faible niveau d'activité mitotique. Il existe des preuves qu'avec une culture prolongée de cellules en monocouche, et après plusieurs passages répétés de cellules, les chondrocytes perdent leurs contours sphériques, acquièrent une forme allongée ressemblant aux fibroblastes. Avec cette métaplasie des fibroblastes, la fonction de synthèse des cellules est également modifiée, caractérisée par une diminution progressive de la synthèse des types de collagène II, IX et XI et une augmentation de la synthèse des collagènes I, III et Utyopov. Les petits protéoglycanes non agrégés sont synthétisés par aggrécane fonctionnel. Synthetzatepsin B et L est extrêmement faible dans les cellules différenciées, mais dans le processus de perte de différenciation augmente. La collagénase-1 est exprimée dans des chondrocytes différenciés, avec une culture prolongée, son expression diminue, tandis que la production d'inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases (TIMP) augmente.

Les chondrocytes différenciés ré-expriment le collagène du phénotype différencié lorsqu'ils sont transférés d'une culture monocouche à une culture en suspension. Le processus de différenciation est probablement lié à la forme des cellules. Cette propriété est régulièrement utilisée par les chercheurs qui étudient les greffes défectueuses avec des chondrocytes autologues. Un petit nombre de cellules obtenues à partir d'un matériel de biopsie peut être multiplié dans une culture monocouche, puis placé à nouveau dans une matrice tridimensionnelle avant la transplantation. La ré-expression d'un phénotype spécifique par des chondrocytes dédifférenciés transférés à une culture d'agarose peut être stimulée avec du TGF-p, un complexe d'osséine-hydroxyapatite et de l'acide ascorbique.

En réponse à l'effet des facteurs de croissance et des cytokines, les chondrocytes sont modifiés au cours du processus de différenciation. La réponse cellulaire aux cytokines et aux facteurs de croissance diffèrent entre les chondrocytes indifférenciés et différenciés. L'IL-1 stimule la prolifération des fibroblastes, tandis que la croissance des chondrocytes indifférenciés est inhibée par l'IL-1. La synthèse de l'ADN est stimulée par l'IGF-1 dans des chondrocytes allongés mais non aplatis. Dans les chondrocytes différenciés, les effets stimulants de l'IL-1β et du TNF-α sur les produits de la procollagénase sont plus prononcés que dans les produits indifférenciés.

La culture des chondrocytes

La culture de chondrocytes en suspension dans un milieu liquide ou dans une matrice tridimensionnelle naturelle ou synthétique stabilise le phénotype du chondrocyte. Les cellules conservent leur forme sphérique, synthétisent des protéines spécifiques des tissus. Une culture de chondrocytes pondérés est habituellement recommandée pour l'étude de la formation d'une nouvelle matrice péricellulaire. Des cultures de chondrocytes dans des polymères absorbants synthétiques ou naturels sont utilisées pour implanter des cellules dans des défauts du cartilage afin de stimuler la régénération du tissu cartilagineux de l'articulation. L'environnement synthétique ou naturel pour les cellules implantables doit satisfaire à un certain nombre d'exigences:

• Les implants doivent avoir une structure poreuse pour l'adhérence et la croissance cellulaire,
• ni le polymère lui-même ni les produits de sa dégradation ne doivent provoquer d'inflammation ou de réactions toxiques lors de l' implantation in vivo,
• le porteur de la greffe doit être capable de se lier à un cartilage adjacent ou à un os sous-chondral,
• une matrice naturelle ou synthétique doit être capable d'absorption, sa dégradation doit être équilibrée par la régénération tissulaire,
• Pour faciliter la réparation du cartilage, la structure chimique et l'architecture matricielle de la matrice devraient aider à maintenir le phénotype cellulaire codé par les chondrocytes et la synthèse de protéines spécifiques des tissus,
• lors de l'implantation in vivo, il est nécessaire d'étudier les propriétés mécaniques de la matrice synthétique ou naturelle.

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Suspension des chondrocytes en phase liquide

L'attachement des cellules aux récipients en matière plastique, dans laquelle la culture de chondrocytes peut être empêché leurs murs revêtus d'une cellulose de méthyle en solution, d'agarose, d'un hydrogel (poly-2-hydroxyéthylméthacrylate) ou un mélange de collagène-agarose. Dans ces conditions, les chondrocytes forment des agrégats et synthétisent principalement des collagènes aggrécanes et tissulaires (types II, IX, XI). Habituellement, deux types de cellules sont trouvés. Les cellules situées au centre conservent une forme sphérique entourée d'une ECM bien développée, ce qui est confirmé par des études histochimiques et ultrastructurales. Sur la périphérie, les chondrocytes ont des contours discoïdes, sont entourés d'une ECM rare; On sait peu de choses sur les caractéristiques fonctionnelles de ces cellules.

La culture de chondrocytes sur des microsupports supportés en suspension est possible; Des billes de dextran (cytodex), des billes de dextran revêtues de collagène (cytodex III), des microsphères non-vides de collagène de type I (collagène) sont utilisées comme microsupports. Dans ces conditions de culture, les chondrocytes se fixent à la surface du microsupport, conservent leur forme sphérique et produisent un matériau analogue à une matrice. De plus, l'utilisation du collagène favorise la prolifération des chondrocytes et la ré-expression d'un phénotype normal. Par conséquent, la culture de chondrocytes sur les microsphères du collagène peut être utilisée pour restaurer le phénotype cellulaire avant la transplantation.

Une autre méthode de culture d'une suspension de chondrocytes en milieu liquide est leur culture sous forme de billes denses constituées de cellules (0,5-1 * 10 ^b ) obtenues par centrifugation. De tels chondrocytes sont capables de produire une matrice contenant un grand nombre de protéoglycanes, le collagène de type II, mais pas le collagène de type I, ce qui est confirmé par des méthodes histologiques, immunohistochimiques et quantitatives.

Suspension de chondrocytes dans un ECM naturel

Les chondrocytes peuvent être cultivés en suspension dans une matrice tridimensionnelle (agar mou, agarose, gel ou éponge de collagène, acide hyaluronique, colle de fibrine, billes d'alginate).

Les chondrocytes d'agarose cultivés conservent leur phénotype normal et synthétisent le collagène de type II et les nouveaux agrégats spécifiques des tissus. Lorsqu'ils sont cultivés dans de l'agarose, les protéoglycanes synthétisés par les cellules sont libérés dans le milieu pendant 50 jours. A titre de comparaison - en culture monocouche, la phase cellulaire est déjà saturée de glycosaminoglycanes dans les 5 à 6 premiers jours de culture; Lorsqu'elle est cultivée dans le milieu après l'intensification de la synthèse et de la libération des glycosaminoglycanes, la diminution dépendant du temps des glycosaminoglycanes se produit dans les 8-10 premiers jours. Néanmoins, le comportement des chondrocytes au cours de leur culture en agarose diffère de celui des conditions in vivo. Dans l'agarose, un grand nombre d'agrégats d'Aggregan synthétisés contiennent des molécules plus petites et plus petites que in vivo. Le TGF-P stimule la synthèse des protéoglycanes dans l'explant, mais réduit la synthèse de l'aggrécane dans l'agarose.

L'alginate est un polysaccharide linéaire dérivé des algues brunes. En présence de cations divalents, tels que les ^ions Ca ²⁺, ce polymère devient un gel. Chaque chondrocytes pris dans alginate, entouré par une matrice de polysaccharides chargés négativement, les pores sont comparables à celles du cartilage hyalin. La matrice qui est formée chondrocytes dans des billes d' alginate, constituée de deux segments - une mince couche de matrice associée aux cellules correspondant aux matrices péricellulaires et territoriales du cartilage articulaire et plus éloigné matrice interterritoriale équivalent dans le tissu natif. Le jour 30 de la culture, le volume relatif et absolu occupé par les cellules, et chacun des deux départements dans le bourrelet d'alginate est presque totalement identique à celles du cartilage natif. Depuis près de 30 jours chondrocytes conservent leur forme sphérique et produisent des propriétés hydrodynamiques agrécane, qui sont similaires à celles des molécules d' agrécane dans la matrice de la molécule du cartilage articulaire et du collagène II, IX et XI types. Dans le même temps, comme d' autres cultures, des suspensions, des billes d' alginate sur la surface de cellules aplaties sont présents qui produisent une petite quantité de molécules de collagène de type I, libéré directement dans l'environnement et non incorporé dans le magnétoscope. Dans les billes d'alginate, on observe une prolifération modérée des chondrocytes. Après 8 mois de culture dans les chondrocytes matures de gel d' alginate ne perdent pas l' activité métabolique et continue de faire la synthèse de collagène de type spécifique de tissu II et aggrécane.

N. Tanaka et ses coauteurs (1984) ont étudié les propriétés de diffusion de diverses molécules naturelles dans l'alginate et ont découvert que les molécules de plus de 70 kD ne diffusent pas à travers l'alginate. Ainsi, la culture de cellules dans l'alginate convient à l'étude de la régulation de la biosynthèse matricielle et de l'organisation de l'ECM. La disponibilité des cellules cultivées dans l'alginate permet d'étudier l'effet des facteurs régulateurs peptidiques et des agents pharmacologiques sur les niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel et traductionnel.

Les chondrocytes sont également cultivés dans une matrice de fibres de collagène de types I et II. S. Nehrer et ses co-auteurs (1997) ont comparé le fonctionnement des chondrocytes du chien dans des matrices polymériques poreuses de collagène-protéoglycane contenant des collagènes de différents types. Ils ont trouvé des différences importantes dans la morphologie de la fonction biosynthétique des chondrocytes cultivés dans des matrices de collagène contenant des collagènes de types I et II. Les cellules de la matrice de collagène de type II enroulaient leur forme sphérique, tandis que dans le collagène de type I, elles avaient une morphologie de type fibroblaste. De plus, dans la matrice du collagène de type II, les chondrocytes produisent plus de glycosaminoglycanes. J. Van Susante et al (1995) ont comparé les propriétés des chondrocytes cultivés dans l'alginate et le gel de collagène (type I). Les auteurs ont trouvé une augmentation significative du nombre de cellules dans le gel de collagène, mais à partir du sixième jour de culture, les cellules ont perdu un phénotype caractéristique, se transformant en cellules de type fibroblaste. Dans le gel d'alginate, une diminution du nombre de cellules a été observée, mais les chondrocytes ont conservé leur phénotype normal. La quantité de gel collagène protéoglycanes par cellule étaient significativement plus élevés que dans l'alginate, mais la diminution a été observée dans les éléments de la matrice de gel de synthèse à partir du 6ème jour de la culture, alors que dans la synthèse alginate continue de croître.

Une matrice de fibrine tridimensionnelle solide est une substance naturelle qui supporte les chondrocytes qui y sont pesés dans un phénotype différencié. La matrice de fibrine 3D peut également être utilisée comme support pour la transplantation de chondrocytes. Les avantages de la fibrine sont l'absence de cytotoxicité, la capacité à remplir l'espace, la capacité d'adhésion. Par des études histologiques et biochimiques, l'autoradiographie, la microscopie électronique, les chondrocytes dans le gel de fibrine ont été trouvés pour conserver leur morphologie, se multiplier et produire une matrice, même après 2 semaines de culture. Cependant, G. Homminga et ses co-auteurs (1993) ont rapporté qu'après 3 jours de culture, la désintégration de la fibrine commence, la dédifférenciation des chondrocytes progresse.

Suspension de chondrocytes dans un ECM artificiel (synthétique)

Les implants de cartilage pour la chirurgie reconstructive ou orthopédique peuvent être obtenus en cultivant des chondrocytes isolés in vitro dans une matrice biocompatible synthétique.

Les chondrocytes d'acide polyglycolique cultivés prolifèrent et conservent une morphologie et un phénotype normaux dans les 8 semaines. Complexe acide polyglycolique des chondrocytes est constitué de cellules, les glycosaminoglycanes kollagnov a une capsule de collagène externe. Cependant, dans de tels implants, il existe deux types de molécules de collagène - I et II. Les implants dédifférenciés par une série de passages de chondrocytes ont un plus grand nombre de glycosaminoglycanes et de collagènes que dans les implants de chondrocytes principalement indifférenciés.

L. Freed et ses co-auteurs (1 993b) ont comparé le comportement de cultures humaines et de chondrocytes de taureau dans l'acide polyglycolique fibreux (HPHC) et dans l'acide polylactique (PPLC). Après 6 à 8 semaines de culture des chondrocytes du taureau dans le HSVG ou le PPLC, les auteurs ont observé la prolifération cellulaire et la régénération de la matrice cartilagineuse. Dans HSBC, les chondrocytes étaient sphériques, situés dans des lacunes entourées d'une matrice cartilagineuse. Après 8 semaines de culture in vitro, le tissu régénéré contenait jusqu'à 50% de matière sèche (4% de masse cellulaire, 15% de glycosaminoglycanes et 31% de collagène). Dans les cellules PPLK ont été en forme de fuseau, une petite quantité de glycosaminoglycanes et de collagène. Dans HSBC, la croissance cellulaire était 2 fois plus intense que dans PTCA. Dans des conditions in vivo, les chondrocytes cultivés dans HPVC et PPLC pendant 1 à 6 mois ont produit un tissu histologiquement similaire au cartilage. Les implants contenaient des glycosaminoglycanes, des collagènes de type I et de type II.

Les chondrocytes bulliques fœtaux ont été cultivés dans du polyéthylène poreux hydrophobe et hydrophile à haute densité. Après 7 jours d'incubation dans les deux substrats, les cellules conservent une forme sphérique, contenant principalement du collagène de type II. Après 21 jours de culture, il s'est avéré que la matrice hydrophile contient plus de collagène de type II que la matrice hydrophobe.

Le tissu cartilagineux peut également être obtenu par culture en monocouche sur des filtres Millicell-CM. Pré-revêtement des filtres avec du collagène est nécessaire pour la fixation des chondroït. L'examen histologique de la culture montre l'accumulation de chondrocytes dans les ECM contenant des protéoglycanes et du collagène de type II. Le collagène de type I dans une telle culture n'est pas détecté. Les chondrocytes dans le tissu cartilagineux résultant ont une forme sphérique, mais à la surface du tissu, ils sont quelque peu aplatis. L'épaisseur du tissu nouvellement formé augmente avec le temps et dépend de la densité initiale de la monocouche de cellules. Dans des conditions de culture optimales, l'épaisseur du tissu cartilagineux atteint 110 μm, l'organisation de ses cellules et du collagène dans les couches superficielles et profondes est similaire à celle du cartilage articulaire. VKM contient environ 3 fois plus de collagène et de protéoglycanes. Après 2 semaines de culture, l'accumulation de la matrice-sa a été notée, ce qui a permis d'extraire le tissu du filtre et de l'utiliser pour la transplantation.

Sims et ses collaborateurs (1996) ont étudié la culture de chondrocytes dans une matrice polymère encapsulée dans un gel d'oxyde de polyéthylène qui permet de transporter un grand nombre de cellules par injection. Six semaines après l'injection dans le tissu sous-cutané de souris athymiques, il s'est formé un nouveau cartilage morphologiquement caractérisé par une opalescence blanche similaire au cartilage hyalin. Les données d'études histologiques et biochimiques ont indiqué la présence de chondrocytes activement proliférants, qui produisent ECM.

Explantation

L'examen du tissu cartilagineux est utilisé pour étudier les processus d'ana- et de catabolisme, l'homéostasie, la résorption et la réparation. Les chondrocytes dans les explants tissulaires cartilagineux soutiennent le phénotype normal et la composition de la MEC, similaires à ceux du cartilage articulaire in vivo. Après 5 jours de culture en présence de sérum, un niveau constant de synthèse et de dégradation naturelle est atteint. La résorption peut accélérer la culture de tissu et dans la culture principale avec l'addition de sérum au moyen d' un certain nombre d'agents, par exemple, IL-IB, le TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, des dérivés de l' acide rétinoïque ou des radicaux d'oxygène actif. Pour étudier la réparation du cartilage, son endommagement est induit par des médiateurs solubles de l'inflammation (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) ou une rupture physique de la matrice.

La méthode des cultures organotypiques est un modèle pour étudier les effets in vitro de facteurs externes isolés sur les chondrocytes et la matrice environnante. In vivo, les chondrocytes sont rarement localisés dans l'ECM et ne se touchent pas. La culture du cartilage articulaire explant conserve cette organisation structurale, ainsi que les interactions particulières entre les chondrocytes et leur environnement extracellulaire environnant. Ce modèle est également utilisé pour étudier l'effet du stress mécanique, des agents pharmacologiques, des facteurs de croissance, des cytokines, des hormones sur le métabolisme du cartilage.

Un autre avantage de l'explantation tissulaire cartilagineuse est l'absence d'altération des chondrocytes par des enzymes protéolytiques ou un facteur mécanique, ce qui est inévitable lorsque les cellules sont isolées. Les récepteurs et autres protéines membranaires et glycoprotéines sont protégés contre les facteurs dommageables.

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Culture des chondrons

Chondron est une unité structurelle, fonctionnelle et métabolique du cartilage articulaire, composé d'un chondrocyte, sa matrice péricellulaire et une capsule de filament compact, et est responsable de l'homéostasie de la matrice. Les chondrons sont extraits mécaniquement du cartilage et recueillis par plusieurs homogénéisations successives à basse vitesse. Isolé à partir des zones de différentes profondeurs cartilage hondrony peut être divisé en quatre catégories: single hondron, hondrony double, multiple (trois ou plus) hondrony disposés linéairement (colonne hondronov) de congestion hondronov.

Les chondrons simples se trouvent généralement dans les couches intermédiaires du cartilage intact, appariés - à la limite des couches moyennes et profondes, des chondrons multiples situés de manière linéaire sont typiques des couches profondes du cartilage intact. Enfin, les groupes de chondrons sont constitués de groupes organisés de chondrons simples et appariés qui conservent l'état agrégé après homogénéisation. Les accumulations de chondrons sont de gros fragments de cartilage, contenant généralement plusieurs chondrons et des fibrilles de collagène situées radialement, c'est-à-dire une organisation typique caractéristique des couches profondes de la matrice. Les chondrons sont immobilisés dans un agarose transparent, ce qui permet d'étudier leur structure, leur composition moléculaire et leur activité métabolique. Système Hondron - agarose considéré comme un modèle micro du cartilage, qui est différent du système traditionnel de chondrocytes - agarose qui préserve le microenvironnement naturel, il n'y a pas besoin de réaliser sa synthèse et l'assemblage. La culture des chondrons est un modèle pour étudier les interactions des cellules et de la matrice dans le cartilage articulaire dans des conditions normales et pathologiques.

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Culture de chondrocytes immortels

Pour créer des lignées cellulaires permanentes, on utilise de l'ADN recombinant ou des virus contenant de l'oncogène qui peuvent rendre la cellule "immortelle". Les chondrocytes immortels ont la capacité de prolifération sans fin, en maintenant un phénotype stable. F. Mallein-Gerin et al (1995) ont montré que l'oncogène est SV40T la prolifération induite par des chondrocytes de souris qui continuent ainsi à exprimer de manière stable le collagènes II, IX et XI types, ainsi que des protéines de liaison commun et l'aggrécane. Cependant, cette lignée cellulaire acquiert la capacité de synthétiser de type I collagène par mise en culture dans une culture monocouche ou dans un gel d'agarose.

W. Horton et ses co-auteurs (1988) ont décrit une lignée de cellules immortelles présentant un faible taux d'expression de l'ARNm du collagène de type II. Ces cellules ont été obtenues en les transformant avec un rétrovirus de souris contenant des I-myc- et y-ra-oncogènes. Ce type de cellules est un modèle unique pour étudier les interactions de la matrice articulaire en l'absence de collagène de type II, ainsi que la régulation de la synthèse du collagène de type II.

La culture Hondropitov avec le gène muté ou supprimé - un modèle pratique pour l'étude de leurs fonctions physiologiques. Ce modèle est particulièrement adapté à l' étude du rôle des molécules spécifiques dans les organisations de la matrice du cartilage ou d' étudier les effets de divers facteurs réglementaires sur le métabolisme du cartilage. Chondrocytes gène synthétisé à distance de type collagène IX fibrilles de collagène plus large que la normale, ce qui indique que le collagène de type IX régule le diamètre des fibrilles. Comme je l' ai mentionné au chapitre 1, la mutation du gène nouvellement trouvé COLAI codant pour le collagène de type II dans les familles souffrant d'arthrose primaire généralisée. Pour étudier l'effet du collagène de type mutant II dans la matrice articulaire R. Dharmrvaram et al (1997) réalisée transfection ( "contamination" un acide nucléique étranger) COL défectueux ₂ AI ( l' arginine en position 519 est remplacé par la cystéine) dans les chondrocytes de foetus humain in vitro.

Système de cocultures. Dans l'articulation, le cartilage interagit avec des cellules d'autres types contenus dans la membrane synoviale, le liquide synovial, les ligaments, l'os sous-chondral. Le métabolisme des chondrocytes peut être influencé par divers facteurs solubles synthétisés par ces cellules. Ainsi, le cartilage articulaire de l'arthrite est détruit par les enzymes protéolytiques et les radicaux libres, qui sont produits par les cellules synoviales. Par conséquent, des modèles ont été développés pour étudier les interactions complexes entre le cartilage et les tissus environnants, qui sont appelés coculture.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) ont été chondrocytes de lapin en culture et des ostéoblastes dans le système de coculture (COSTAR), dans lequel les cellules ont été séparées membrane microporeuse (0,4 micron) permet l'échange entre les deux types de cellules, sans contact direct. Cette étude a démontré la capacité des ostéoblastes à stimuler la croissance des chondrocytes à travers des médiateurs solubles.

A.M. Malfait et co-auteurs (1994) ont étudié la relation entre les monocytes du sang périphérique et les chondrocytes. Ce modèle est pratique pour étudier les processus médiés par les cytokines, dans les arthropathies inflammatoires (polyarthrite rhumatoïde, spondylite séronégative, etc.). Les auteurs du modèle ont séparé les cellules par une membrane liant les protéines avec des pores de 0,4 μm de diamètre. L'étude a montré que les monocytes stimulés lipopolysaccharide élaborées ifno IL-1-a, qui inhibe la synthèse de chondrocytes agrécane et contribue à la dégradation de l'aggrécane agrégats déjà synthétisés.

K. Tada et al (1994) a créé un modèle de coculture dans laquelle gel cellules endotheliales dans le collagène (I-type) ont été placés dans la chambre intérieure de la chambre extérieure séparée d'elle par les chondrocytes placés dans un filtre avec une taille de pores de 0,4 microns. Dans un état d'isolement complet de la chambre externe, les cellules endothéliales humaines forment des tubes dans un gel de collagène en présence d'EGF ou de TGF-a. Avec la culture simultanée des deux types de cellules TGF, la formation dépendante des tubes par les cellules endothéliales a été inhibée. L'inhibition des chondrocytes de ce processus a été partiellement éliminée par des anticorps anti-TGF-bêta. On peut supposer que le TGF-bêta produit par les chondrocytes déprime la vascularisation du cartilage lui-même.

S. Groot et ses co-auteurs (1994) ont simultanément cultivé des chondrocytes à partir des zones hypertrophiques et prolifératives de l'os d'une souris fœtale âgée de 16 jours avec des morceaux de tissu cérébral. Après 4 jours de culture, la transdifférenciation des chondrocytes en ostéoblastes et le début de la formation d'ostéoïdes ont été observés. Après 11 jours de culture, une partie du cartilage a été remplacée par du tissu osseux et la matrice osseuse a été partiellement calcifiée. Certains neuropeptides et neurotransmetteurs produits par le tissu cérébral affectent le métabolisme des ostéoblastes ou ont des récepteurs sur eux. Parmi ceux-ci, la norépinéphrine, le peptide intestinal vasoactif, le peptide associé au gène de la calcitonine, la substance P et la somatostatine peuvent être isolés . Cultivé avec des chondrocytes, des morceaux de tissu cérébral peuvent produire certains de ces facteurs, ce qui peut induire le processus de transdifférenciation des chondrocytes en ostéoblastes.

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L'influence des facteurs externes sur la culture des chondrocytes

L'effet de la tension d'oxygène sur le métabolisme des chondrocytes

Dans la plupart des cas, les cultures de chondrocytes se développent dans des conditions de tension atmosphérique de l'oxygène. Néanmoins, il est bien connu que les chondrocytes in vivo existent dans des conditions hypoxiques et la tension d'oxygène varie avec différentes conditions pathologiques. Au cours du processus de maturation, des changements significatifs dans l'approvisionnement en sang des épiphyses sont observés. Puisque la vascularisation varie dans différentes zones de la plaque de croissance, la tension d'oxygène dans celles-ci varie également. C. Brighton et R. Heppenstall (1971) ont démontré que dans la plaque du tibia chez les lapins, la tension d'oxygène dans la zone hypertrophique est moindre que dans le cartilage environnant. Les mesures de certains paramètres métaboliques ont montré que les chondrocytes sont capables de réagir rapidement aux changements locaux de la concentration en oxygène. Tout d'abord, avec une faible tension d'oxygène, sa consommation de chondrocytes diminue. Avec une diminution de la tension d'oxygène de 21 à 0,04%, l'utilisation du glucose est augmentée, l'activité de l'enzyme glycolyse et la synthèse de l'acide lactique sont augmentées. Même avec une faible tension d'oxygène, la quantité absolue d'ATP, d'ADP et d'AMP reste stable. Ces données indiquent la directionnalité du métabolisme des chondrocytes pour maximiser la conservation de l'énergie. Néanmoins, l'activité de synthèse, et donc les processus de réparation, changent dans des conditions d'hypoxie.

Une forte tension d'oxygène affecte également le métabolisme des chondrocytes, provoquant une diminution de la synthèse des protéoglycanes et de l'ADN, une dégradation de la matrice du cartilage. Ces effets, en règle générale, s'accompagnent de la production de radicaux libres d'oxygène.

Influence de la concentration ionique et de la pression osmotique de l'environnement sur la fonction des chondrocytes

Dans le cartilage natif concentration d'ions est significativement différente de celle des autres tissus: la teneur en sodium dans le milieu extracellulaire est de 250 - 350 mmoles, et son osmolarité - 350-450 mOsm. Lors de l'isolement chondrocytes à partir d'un magnétoscope et les incuber dans un milieu standard (DMEM (milieu essentiel minimal Dulbecco - moyen essentiel minimum de Dulbecco) osmolarité - 250-280,7 mOsm) change environnement fortement de la cellule. En outre, la concentration de calcium et de potassium dans les milieux standard est beaucoup plus faible que dans les tissus natifs, et la concentration d'anions est beaucoup plus élevée.

L'addition de saccharose au milieu conduit à une augmentation de son osmolarité et induit une augmentation intracellulaire transitoire de la concentration en anions H ⁺ et calcium dans le cytosol. De tels changements intracellulaires peuvent influencer les processus de différenciation des chondrocytes et leur activité métabolique. J. Urban et al (1993) ont trouvé que l'inclusion de ³⁵ 8-sulfate et ³ chondrocytes isolés H-proline incubées dans du milieu DMEM standard pour 2-4 heures, on a seulement 10% de celle dans le tissu natif. L'intensité de la synthèse a atteint un maximum avec l'osmolarité du milieu extracellulaire de 350-400 mosmol à la fois dans les chondrocytes nouvellement isolés et dans les explants du tissu cartilagineux. De plus, le volume de chondrocytes a augmenté de 30 à 40% après la mise en place de cellules isolées dans un milieu DMEM standard de ladite osmolarité. Toutefois, lorsque les chondrocytes en culture dans osmolarité non physiologique pendant 12-16 heures, les cellules adaptées au nouvel environnement en réduisant l'intensité du cisaillement est proportionnelle osmolarité de la biosynthèse du milieu extracellulaire.

P. Borgetti et al (1995) ont étudié l'effet de l'osmolarité du milieu extracellulaire sur la croissance, la morphologie et la biosynthèse des chondrocytes porcins. Les auteurs ont démontré des caractéristiques biochimiques et morphologiques similaires des chondrocytes cultivés dans des milieux avec une osmolarité de 0,28 et 0,38 mosmol. Lorsque 0,48 mOsm osmolarité du milieu pendant les 4-6 premières heures de la culture a été observée diminution de la prolifération cellulaire et la synthèse des protéines, mais par la suite eu restaurer ces paramètres qui ont fini par atteindre les valeurs de contrôle. Lors de la mise en culture chondrocytes dans un milieu avec 0,58 mOsm cellules osmolarité perdent leur capacité à supporter l'intensité physiologique processus prolifératifs et après 6 jours, le nombre de chondrocytes est considérablement réduit. Avec l'osmolarité du milieu, 0,58 mosmol, une profonde inhibition de la synthèse protéique est observée. En outre, lorsqu'elles sont cultivées dans des milieux avec une osmolarité mOsm 0,28-0,38 chondrocytes conservent le phénotype physiologique à une osmolarité plus élevée (0,48-0,58 mOsm) des changements significatifs dans la morphologie cellulaire, la perte manifestée phénotype caractéristique chondrocytes conversion dans les cellules de fibroblastes, ainsi que la perte de cellules, la capacité d'assembler les protéoglycanes matriciels. Les résultats de cette étude indiquent la capacité des chondrocytes à répondre à des oscillations d'osmolalité limitées dans l'environnement extracellulaire.

Le changement dans la concentration d'autres ions peut également affecter les processus de biosynthèse dans les chondrocytes. Ainsi, le degré d'incorporation de ³⁵ S (sulfate) est augmentée de la moitié avec l' augmentation de la concentration en ions potassium de 5 mM (la concentration dans l'environnement standard de DM EM) à 10 mM (la concentration dans l'ECM in vivo). Une concentration de calcium inférieure à 0,5 mmol a contribué à la production de collagène par les chondrocytes taurins matures, tandis qu'une concentration de 1-2 mmol (correspondant à la concentration dans le milieu DM DM standard) a entraîné une réduction significative de la synthèse du collagène. Une augmentation modérée de la biosynthèse a été observée à des niveaux élevés de calcium (2-10 mmol). Divers cations participent à la fixation des chondrocytes aux protéines VKM. Ainsi, les ions magnésium et manganèse fournissent une fixation à la fibronectine et au collagène de type II, tandis que les ions calcium ne participent pas à la fixation des chondrocytes aux protéines. Ainsi, les résultats des études décrites indiquent l'influence des changements des ions extracellulaires du potassium, du sodium, du calcium et de l'osmolarité du milieu sur la fonction biosynthétique des chondrocytes incubés dans les milieux standards.

L'influence du stress mécanique sur le métabolisme des chondrocytes

L'immobilisation de l'articulation provoque une atrophie réversible du cartilage, ce qui indique le besoin de stimuli mécaniques pour le déroulement normal des processus métaboliques dans l'ECM. Dans la plupart des cas, les modèles de culture cellulaire utilisés existent dans des conditions normales de pression atmosphérique. M. Wright et ses co-auteurs (1996) ont montré que l'environnement mécanique affecte le métabolisme des chondrocytes, la réponse des cellules dépend de l'intensité et de la fréquence de la charge de compression. Des expériences de chargement sur des explants de cartilage articulaire intact in vitro ont démontré une diminution de la synthèse de protéines et de protéoglycanes sous l'action d'une charge statique, tandis que le chargement dynamique stimule ces processus. Les mécanismes exacts pour réaliser l'effet de la charge mécanique sur le cartilage sont complexes et probablement liés à la déformation cellulaire, à la pression hydrostatique, à la pression osmotique, au potentiel électrique et aux récepteurs cellulaires de surface aux molécules matricielles. Pour étudier l'effet de chacun de ces paramètres, il est nécessaire de créer un système dans lequel un paramètre peut être indépendamment modifié. Par exemple, une culture d'explant n'est pas appropriée pour étudier la déformation cellulaire, mais elle peut être utilisée pour étudier l'effet global de la pression sur l'activité métabolique des chondrocytes. La compression du cartilage conduit à une déformation cellulaire, et également accompagnée par l'apparition d' un gradient de pression hydrostatique, le potentiel électrique et l' écoulement du fluide changement de facteurs physico - chimiques tels que la teneur en eau dans la matrice, la densité de charge électrique, le niveau de la pression osmotique. La déformation cellulaire peut être étudiée en utilisant des chondrocytes isolés immergés dans un gel d'agarose ou de collagène.

Plusieurs systèmes ont été développés pour étudier l'effet de la stimulation mécanique sur la culture des chondrocytes. Certains chercheurs utilisent des systèmes à cet effet dans lesquels la pression est appliquée à la culture cellulaire à travers la phase gazeuse. Par exemple, JP Veldhuijzen et al (1979) en utilisant une surpression de 13 kPa à une basse fréquence (0,3 Hz) pendant 15 minutes, a observé une augmentation de la synthèse de l' AMPc et de protéoglycanes et d' abaisser la synthèse d'ADN. R. Smith et al (1996) ont montré que l'exposition intermittente des cultures primaires de taureau chondrocytes pression hydrostatique (10 MPa) à 1 Hz pendant 4 heures en raison de l'augmentation de la synthèse du genre aggrécane et le collagène II, tandis que la pression constante n'a eu aucun effet sur ces processus. L' utilisation d' un système similaire M. Wright et al (1996) ont rapporté que la pression cyclique sur la culture cellulaire est associée à une hyperpolarisation de la membrane cellulaire de chondrocytes et l' activation de Ca ²⁺ Les canaux potassiques dépendantes. Ainsi, les effets de la pression cyclique sont médiés par des canaux ioniques, activés par étirement, dans la membrane des chondrocytes. La réponse des chondrocytes à la pression hydrostatique dépend des conditions de culture cellulaire et de la fréquence de la charge appliquée. Ainsi, la pression hydrostatique cyclique (5 MPa) réduit l'incorporation de sulfate en monocouche de chondrocytes à une fréquence de 0,05, 0,25 et 0,5 Hz, alors que pour les fréquences au- dessus de sulfate d'inclusion 0,5 Hz dans le cartilage augmente explants.

M. Bushmann et al (1992) ont rapporté que les chondrocytes dans un gel d'agarose modifient la biosynthèse en réponse à une contrainte mécanique statique et dynamique de la même manière que l'organe intact cultivé. Les auteurs ont constaté que la charge mécanique génère un stimulus hyperosmotique suivi d'une diminution du pH dans les chondrocytes.

L'effet de l'étirement mécanique peut être étudié sur une culture de cellules immergées dans un gel. La force d'étirement peut être créée en utilisant un vide contrôlé par ordinateur. Lorsque le système est dans un certain degré de vide, le fond de la boîte de Pétri avec la culture cellulaire est prolongé d'une certaine quantité, la déformation est maximale sur les bords du fond de la coupe et est minimale au centre. Stretching est transmis et cultivé dans une boîte de Pétri de chondrocytes. Avec cette méthode, Holm-vall K. Et al (1995) ont montré que dans les cultures de gel de collagène (II) de type cellules de chondrosarcome ont augmenté l'expression de l' ARNm et ₂ -integrina. Un ₂ p _r intégrine est capable de se lier au collagène de type II. Il est considéré comme un mécanorécepteur, car il interagit avec les protéines liant l'actine, reliant ainsi l'ECM et le cytosquelette.

Effet du pH sur le métabolisme des chondrocytes

Le pH du liquide interstitiel de l'ECM du tissu cartilagineux est plus acide que dans d'autres tissus. A. Maroudas (1980) a déterminé le pH du cartilage articulaire à 6,9. W. Diamant et ses co-auteurs (1966) ont trouvé un pH de 5,5 dans des conditions pathologiques. On sait que les chondrocytes vivent à faible PO2, ce qui indique le rôle important de la glycolyse (95% du métabolisme total du glucose) dans le métabolisme de ces cellules; la glycolyse s'accompagne de la production d'une grande quantité d'acide lactique.

En plus de l'acidification de l'environnement par les produits de la glycolyse, les composants de la matrice eux-mêmes sont d'une grande importance. Un grand nombre de charges négatives fixes sur les protéoglycanes extracellulaires modifie la composition ionique: il y a une forte concentration de cations libres (par exemple H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) et une faible concentration d'anions (par exemple, O2, ENSP). De plus, sous l'influence d'une charge mécanique, l'eau est expulsée de l'ECM, ce qui conduit à une augmentation de la concentration des charges négatives fixes et à l'attraction de plus de cations sur la matrice. Ceci s'accompagne d'une diminution du pH du milieu extracellulaire, qui affecte le pH intracellulaire, modifiant ainsi le métabolisme des chondrocytes. R. Wilkin et A. Hall (1995) ont étudié l'effet du pH du milieu extracellulaire et intracellulaire sur la biosynthèse de la matrice par des chondrocytes tauraux isolés. Ils ont observé une double modification de la synthèse de la matrice avec une diminution du pH. Une légère diminution du pH (7,4 35 S0 ₄ et ³ H-proline dans les chondrocytes, alors que l' acidification plus profonde (pH <7,1) inhibe la synthèse de 75% par rapport à contrôle. La création du même faible pH (6,65) avec des ions ammonium a provoqué une diminution de la synthèse de la matrice de seulement 20%. Les résultats obtenus indiquent que la modification du pH du milieu de synthèse de la matrice extracellulaire ne peut pas être expliquée uniquement par des modifications du pH du milieu intracellulaire. En outre, les chondrocytes ont la capacité de réguler le pH intracellulaire de Na ⁺, H ⁺ échangeur, Ca ⁺ -dépendante C1 ^_ -NSOZ -TRANSPORTEURS et H ⁺ / ATPase.

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Effet de la composition du milieu de culture sur le métabolisme des chondrocytes

Le milieu de culture des chondrocytes doit correspondre aux conditions expérimentales. Ces dernières années, le sérum de veau a été utilisé pour optimiser les conditions de culture. Cependant, lors de l'utilisation du sérum, un certain nombre de points importants doivent être pris en compte:

• la croissance externe des cellules de la périphérie du tissu dans les cultures d'organes,
• la variabilité de la composition des sérums de différentes séries,
• présence de composants inconnus chez eux,
• augmentation du risque d'interférence, artefacts dans l'étude de l'influence de divers facteurs biologiques sur l'activité métabolique des cellules.

Un exemple de ce dernier est l'étude de l'effet de l'EGF sur les chondrocytes du cartilage chez le rat. EGF stimule l' incorporation de ³ H-thymidine et d' augmenter la teneur en ADN dans la culture. Cet effet était plus prononcé à de faibles concentrations sériques (<1%), mais à des concentrations élevées (> 7,5%), l'effet a disparu.

Il est bien connu que les niveaux de synthèse et de dégradation dans le DMEM enrichi en sérum de veau sont significativement augmentés par rapport aux conditions in vivo. Les différences entre le métabolisme in vivo et in vitro peuvent être causées par des différences entre le liquide synovial et l'environnement dans lequel les cellules sont cultivées. D. Lee et al (1997) ont cultivé des chondrocytes de jeunes taureaux dans de l'agarose en utilisant un milieu nutritif contenant du DMEM enrichi avec 20% de sérum de veau et une grande quantité de liquide synovial allogénique normal. La présence de liquide synovial dans le milieu induit une augmentation du nombre de protéoglycanes, jusqu'à 80% de la quantité totale de liquide synovial. Les résultats obtenus indiquent que le liquide synovial en culture induit un taux métabolique similaire à celui in vivo, avec un haut niveau de synthèse des glycosaminoglycanes et un faible niveau de division cellulaire.

G. Verbruggen et al (1995) ont montré que la synthèse de la ³⁵ S-arrpeKaHa chondrocytes humains en culture dans de l' agarose dans du DMEM sans sérum était de 20 à 30% du niveau observé de synthèse dans du DMEM, supplémenté avec 10% de sérum de veau. Les auteurs ont déterminé dans quelle mesure l'IGF-1, l'IGF-2, le TGF-P ou l'insuline restaurent la production d'aggrécane dans des milieux sans sérum. Les auteurs ont conclu que 100 ng / ml d'insuline, IGF-1 ou IGF-2 réduisaient partiellement la synthèse de l'aggrécane à 39-53% du niveau témoin. Avec une combinaison de ces facteurs, aucun phénomène synergique ou cumulatif n'a été identifié. Dans le même temps, 10 ng / ml de TGF-P en présence de 100 ng / ml d' insuline stimulée synthèse de l' aggrécane à 90% ou plus du niveau de référence. Enfin, la transferrine sérique, seule ou en association avec l'insuline, n'a pas affecté la synthèse de l'aggrécane. Lorsque le sérum de veau a été remplacé par de la sérumalbumine bovine, la teneur totale en aggrécane a été significativement réduite. L'enrichissement du milieu pour culture d'insuline, IGF ou TGF-P a partiellement restauré la capacité des cellules à produire des agrégats d'aggrécane. Dans ce cas, l'IGF-1 et l'insuline sont capables de maintenir l'homéostasie dans les cultures cellulaires. Après 40 jours de culture dans un milieu additionné de 10 à 20 ng / ml synthèse d' IGF-1, le protéoglycane a été maintenu au même niveau ou même plus haut en comparaison avec un milieu contenant du sérum de veau à 20%. Processus cataboliques procédé lentement dans du milieu additionné de IGF-1 que dans le milieu supplémenté avec 0,1% de solution d'albumine, mais un peu plus rapide dans un milieu supplémenté avec 20% de sérum. Dans les cultures à longue durée de vie, 20 ng / ml d'IGF-1 maintient un état stable des cellules.

D. Lee et al (1993) ont comparé l'effet de la composition du milieu de culture (DMEM, sérum de veau DMEM + 20%, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) sur la synthèse d'ADN dans une culture de cartilage expiant, culture monocouche et en suspension dans de l' agarose . Cultivés en agarose en présence de sérum, les auteurs ont observé une tendance à regrouper les chondrocytes en grandes grappes. Des cellules cultivées sans sérum ou avec de l'IGF-1 ont été stockées dans un agarose de forme ronde, assemblées en petits groupes, mais ne formant pas de grands agrégats. Dans la monocouche, la synthèse de l'ADN était significativement plus élevée dans les milieux contenant du sérum que dans le milieu enrichi en IGF-1; La synthèse de l'ADN dans ce dernier était beaucoup plus élevée que dans l'environnement non enrichi. Dans la culture de chondrocytes dans une suspension dans de l'agarose dans un milieu non enrichi et dans des milieux avec IGF-1, aucune différence dans la synthèse d'ADN n'a été observée. En même temps , la suspension mise en culture des chondrocytes en agarose dans du milieu additionné de sérum, a été accompagnée par une augmentation de l' incorporation de radionucléide ³ H-thymidine par rapport à d' autres environnements.

La vitamine C est nécessaire pour l'activation des enzymes impliquées dans la formation d'une structure spirale stable de fibrilles de collagène. Les chondrocytes, déficients par rapport à l'acide ascorbique, synthétisent des précurseurs non hélicoïdaux non hélicoïdaux du collagène, qui sont lentement sécrétés. L'introduction de l'acide ascorbique (50 μg / ml) provoque l'hydroxylation des collagènes de types II et IX et leur sécrétion en quantités normales. L'addition de vitamine C n'a pas affecté le niveau de synthèse des protéoglycanes. Par conséquent, la sécrétion de collagène est régulée indépendamment de la sécrétion de protéoglycanes.

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