Limites, dangers et complications de la transplantation cellulaire

La médecine plastique régénérative repose sur la mise en œuvre clinique des propriétés toti- et pluripotentes des cellules souches embryonnaires et progénitrices, qui permettent in vitro et in vivo la création de lignées cellulaires spécifiques qui repeuplent les tissus et organes endommagés d'une personne malade.

La possibilité réelle d'utiliser des cellules souches embryonnaires et des cellules souches de tissus définitifs (les cellules souches dites « adultes ») humaines à des fins thérapeutiques ne fait plus aucun doute. Cependant, les experts des Académies nationales et de médecine des États-Unis (Stem cells and the future regenerative medicine, National Academy Press) et de l'Institut national de la santé des États-Unis (Stem cells and the future research directions, Nat. Inst. of Health USA) recommandent une étude plus détaillée des propriétés des cellules souches par le biais d'expériences sur des modèles biologiques adéquats et une évaluation objective de toutes les conséquences de la transplantation, avant d'utiliser ces cellules souches en clinique.

Il a été établi que les cellules souches font partie des dérivés tissulaires des trois feuillets germinaux. On les trouve dans la rétine, la cornée, l'épiderme, la moelle osseuse et le sang périphérique, ainsi que dans les vaisseaux sanguins, la pulpe dentaire, les reins, l'épithélium gastro-intestinal, le pancréas et le foie. Grâce à des méthodes modernes, il a été démontré que les cellules souches neurales sont localisées dans le cerveau et la moelle épinière d'un adulte. Ces données sensationnelles ont particulièrement retenu l'attention des scientifiques et des médias, car les neurones cérébraux constituent un exemple classique de population cellulaire statique qui ne se rétablit pas. Aux stades précoce et tardif de l'ontogenèse, des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes se forment dans le cerveau des animaux et des humains grâce aux cellules souches neurales (Cellules souches: progrès scientifiques et orientations futures de la recherche. Nat. Inst. of Health USA).

Cependant, dans des conditions normales, la plasticité des cellules souches des tissus définitifs ne se manifeste pas. Pour exploiter pleinement leur potentiel plastique, elles doivent être isolées puis cultivées dans des milieux contenant des cytokines (LIF, EGF, FGF). De plus, les dérivés de cellules souches ne se greffent avec succès que lorsqu'ils sont transplantés chez un animal dont le système immunitaire est affaibli (irradiation gamma, cytostatiques, busulfan, etc.). À ce jour, aucune preuve convaincante n'a été obtenue quant à la mise en œuvre de la plasticité des cellules souches chez des animaux n'ayant pas été exposés à des radiations ou à d'autres effets provoquant une immunosuppression profonde.

Dans de telles conditions, le potentiel dangereux des cellules souches embryonnaires humaines (CSE) se manifeste tout d'abord lors de leur transplantation en zone ectopique: lors de leur injection sous-cutanée à des souris immunodéficientes, des tératocarcinomes se forment au site d'injection. De plus, au cours du développement de l'embryon humain, la fréquence des anomalies chromosomiques est plus élevée que lors de l'embryogenèse animale. Au stade blastocyste, seulement 20 à 25 % des embryons humains sont constitués de cellules présentant un caryotype normal, et l'écrasante majorité des embryons humains précoces obtenus après fécondation in vitro présentent un mosaïcisme chromosomique chaotique et présentent très souvent des aberrations numériques et structurelles.

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Effets bénéfiques des cellules souches

Les résultats préliminaires des essais cliniques confirment l'effet bénéfique des cellules souches sur les patients, mais il manque encore des informations sur les effets à long terme de la transplantation cellulaire. Initialement, la littérature était dominée par des rapports faisant état de résultats positifs de transplantation de fragments cérébraux embryonnaires dans la maladie de Parkinson, mais des données ont ensuite commencé à apparaître, niant l'efficacité thérapeutique des tissus nerveux embryonnaires ou fœtaux transplantés dans le cerveau des patients.

Au milieu du XXe siècle, la restauration de l'hématopoïèse chez des animaux létalement irradiés après transfusion intraveineuse de cellules de moelle osseuse a été découverte. En 1969, le chercheur américain D. Thomas a réalisé la première greffe de moelle osseuse chez l'homme. À cette époque, le manque de connaissances sur les mécanismes d'incompatibilité immunologique des cellules de moelle osseuse du donneur et du receveur a entraîné une mortalité élevée due à de fréquents échecs de greffe et au développement d'une réaction du greffon contre l'hôte. La découverte du complexe majeur d'histocompatibilité, qui comprend les antigènes leucocytaires humains (HbA), et l'amélioration de leurs méthodes de typage ont permis d'augmenter significativement la survie après greffe de moelle osseuse, ce qui a conduit à la généralisation de cette méthode de traitement en oncohématologie. Dix ans plus tard, les premières greffes de cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenues à partir du sang périphérique par leucaphérèse ont été réalisées. En 1988, le sang de cordon ombilical a été utilisé pour la première fois comme source de CSH en France pour traiter un enfant atteint d'anémie de Fanconi. Depuis fin 2000, la presse a publié des articles sur la capacité des CSH à se différencier en cellules de divers types tissulaires, ce qui élargit potentiellement le champ de leur application clinique. Cependant, il s'est avéré que le matériel de transplantation, tout comme les CSH, contenait un nombre important d'impuretés cellulaires non hématopoïétiques de nature et de propriétés diverses. À cet égard, des méthodes de purification du greffon et des critères d'évaluation de sa pureté cellulaire sont en cours de développement. En particulier, l'immunosélection positive des cellules CD34+ est utilisée, ce qui permet l'isolement des CSH à l'aide d'anticorps monoclonaux.

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Complications de la thérapie par cellules souches

Les complications de la greffe de moelle osseuse sont le plus souvent hématologiques et associées à une longue période de pancytopénie iatrogène. Les complications infectieuses, l'anémie et les hémorragies se développent le plus souvent. À cet égard, il est primordial de sélectionner le mode optimal de prélèvement, de traitement et de conservation de la moelle osseuse pour une préservation maximale des cellules souches, garantissant ainsi une restauration rapide et stable de l'hématopoïèse. Pour caractériser une greffe, les paramètres suivants sont couramment évalués: le nombre de cellules mononucléées et/ou nucléées, les unités formant colonie et la teneur en cellules CD34-positives. Malheureusement, ces indicateurs ne fournissent qu'une évaluation indirecte de la capacité hématopoïétique réelle de la population de cellules souches du greffon. Il n'existe aujourd'hui aucun paramètre absolument précis permettant de déterminer si un greffon est suffisant pour une restauration hématopoïétique à long terme chez les patients, même après une greffe autologue de moelle osseuse. L'élaboration de critères généraux est extrêmement difficile en raison de l'absence de normes strictes pour le traitement, la cryoconservation et les tests du greffon. De plus, il est nécessaire de prendre en compte l'ensemble des facteurs influençant la réussite de la restauration de l'hématopoïèse chez chaque patient. En cas de greffe autologue de moelle osseuse, les plus importants sont le nombre de chimiothérapies antérieures, les caractéristiques du protocole de conditionnement, la période de la maladie au cours de laquelle la moelle osseuse a été prélevée et les schémas d'utilisation des facteurs de stimulation de colonies post-greffe. De plus, il ne faut pas oublier que la chimiothérapie précédant le prélèvement peut avoir un effet négatif sur les cellules souches de la moelle osseuse.

L'incidence des complications toxiques graves augmente significativement lors d'une greffe de moelle osseuse allogénique. À cet égard, les données statistiques sur la greffe de moelle osseuse allogénique chez les patients atteints de thalassémie sont intéressantes. Les rapports du Groupe européen de transplantation de moelle osseuse ont recensé environ 800 greffes de moelle osseuse chez des patients atteints de thalassémie majeure. La greffe allogénique chez les patients thalassémiques est réalisée dans la grande majorité des cas à partir de frères et sœurs HLA identiques, ce qui est associé à des complications graves et à une mortalité élevée lors de la transplantation de cellules souches provenant de donneurs apparentés partiellement compatibles ou non. Afin de minimiser le risque de complications infectieuses mortelles, les patients sont placés dans des boîtes aseptiques isolées à flux d'air laminaire et reçoivent un régime alimentaire pauvre en bactéries ou abactérien. Pour la décontamination bactérienne de l'intestin, des formes non résorbables d'antibiotiques et d'antifongiques sont prescrites per os. En prophylaxie, l'amphotéricine B est administrée par voie intraveineuse. La prévention des infections systémiques est renforcée par l'amikacine et la céftazidime, prescrites la veille de la transplantation et poursuivies jusqu'à la sortie du patient. Tous les produits sanguins sont irradiés à une dose de 30 Gy avant la transfusion. La nutrition parentérale pendant la transplantation est indispensable et débute immédiatement après la restriction alimentaire naturelle.

La forte toxicité des immunosuppresseurs entraîne de nombreuses complications, souvent responsables de nausées, de vomissements et de mucite, de lésions rénales et de pneumonie interstitielle. L'une des complications les plus graves de la chimiothérapie est la maladie veino-occlusive hépatique, entraînant le décès peu après la transplantation. Les facteurs de risque de thrombose des veines du système porte hépatique comprennent l'âge des patients, la présence d'hépatite et de fibrose hépatique, ainsi que le traitement immunosuppresseur après une greffe de moelle osseuse. La maladie veino-occlusive est particulièrement dangereuse en cas de thalassémie, qui s'accompagne d'hémosidérose hépatique, d'hépatite et de fibrose, fréquentes lors de la transfusion. La thrombose des veines du système porte hépatique se développe 1 à 2 semaines après la transplantation et se caractérise par une augmentation rapide de la bilirubine et de l'activité des transaminases dans le sang, une hépatomégalie progressive, une ascite, une encéphalopathie et des douleurs abdominales hautes. L'autopsie histologique révèle des lésions endothéliales, des hémorragies sous-endothéliales, des lésions des hépatocytes centrolobulaires, ainsi qu'une obstruction thrombotique des veinules et des veines centrales du foie. Des cas d'arrêt cardiaque mortel associés aux effets toxiques des cytostatiques ont été décrits chez des patients atteints de thalassémie.

Durant la période pré-transplantation, le cyclophosphamide et le busulfan provoquent souvent une cystite hémorragique toxique avec modifications pathologiques des cellules uroépithéliales. L'utilisation de la cyclosporine A lors d'une greffe de moelle osseuse s'accompagne souvent de néphrotoxicité et de neurotoxicité, d'un syndrome hypertensif, d'une rétention hydrique et d'une cytolyse hépatocytaire. Les troubles sexuels et reproductifs sont plus fréquents chez les femmes. Chez les jeunes enfants, le développement pubertaire n'est généralement pas affecté après la greffe, mais chez les enfants plus âgés, les troubles du développement de la sphère sexuelle peuvent être très graves, allant jusqu'à la stérilité. Les complications directement liées à la greffe incluent le rejet de cellules de moelle osseuse allogéniques, l'incompatibilité ABO et les formes aiguës et chroniques de la maladie du greffon contre l'hôte.

Chez les patients ayant bénéficié d'une greffe de moelle osseuse ABO-incompatible, des isoagglutinines de l'hôte contre celles du donneur ABO sont produites pendant 330 à 605 jours après la transplantation, ce qui peut entraîner une hémolyse prolongée et augmenter considérablement le besoin de transfusions sanguines. Cette complication est prévenue par la transfusion exclusive de globules rouges de type 0. Après la transplantation, certains patients présentent une neutropénie auto-immune, une thrombopénie ou une pancytopénie, nécessitant une splénectomie pour la corriger.

Chez 35 à 40 % des receveurs, une réaction aiguë du greffon contre l'hôte se développe dans les 100 jours suivant une greffe de moelle osseuse allogénique HLA-identique. L'atteinte cutanée, hépatique et intestinale varie d'une éruption cutanée, d'une diarrhée et d'une hyperbilirubinémie modérée à une desquamation cutanée, une occlusion intestinale et une insuffisance hépatique aiguë. Chez les patients atteints de thalassémie, l'incidence de la réaction aiguë du greffon contre l'hôte de grade I après greffe de moelle osseuse est de 75 %, et de 11 à 53 % pour les grades II et supérieurs. La réaction chronique du greffon contre l'hôte, sous forme de syndrome multiviscéral systémique, se développe généralement dans les 100 à 500 jours suivant une greffe de moelle osseuse allogénique chez 30 à 50 % des patients. La peau, la cavité buccale, le foie, les yeux, l'œsophage et les voies respiratoires supérieures sont touchés. On distingue une forme limitée de réaction du greffon contre l'hôte chronique, lorsque la peau et/ou le foie sont touchés, et une forme généralisée, lorsque des lésions cutanées généralisées sont associées à une hépatite chronique agressive, à des lésions oculaires, aux glandes salivaires ou à tout autre organe. Le décès est souvent dû à des complications infectieuses résultant d'un déficit immunitaire sévère. Dans la thalassémie, une forme légère de réaction du greffon contre l'hôte chronique survient chez 12 % des receveurs de moelle osseuse allogénique compatible HLA, une forme modérée chez 3 % des receveurs et une forme sévère chez 0,9 % des receveurs. Une complication grave de la greffe de moelle osseuse est le rejet du greffon, qui survient 50 à 130 jours après l'intervention. La fréquence du rejet dépend du protocole de conditionnement. En particulier, chez les patients atteints de thalassémie qui n'ont reçu que du méthotrexate pendant la période de préparation, un rejet de la greffe de moelle osseuse a été observé dans 26 % des cas, avec une combinaison de méthotrexate avec de la cyclosporine A - dans 9 % des cas, et avec l'administration de cyclosporine A uniquement - dans 8 % des cas (Gaziev et al., 1995).

Les complications infectieuses après greffe de moelle osseuse sont d'origine virale, bactérienne et fongique. Leur développement est associé à une neutropénie profonde induite par les médicaments de chimiothérapie pendant la période de conditionnement, à des lésions des barrières muqueuses par les cytostatiques et à une réaction du greffon contre l'hôte. Selon le stade d'évolution, on distingue trois phases de complications infectieuses. Au cours de la première phase (qui se développe au cours du premier mois suivant la greffe), les lésions des barrières muqueuses et la neutropénie prédominent, souvent accompagnées d'infections virales (herpès, virus d'Epstein-Barr, cytomégalovirus, varicelle-zona), ainsi que d'infections causées par des bactéries Gram positives et Gram négatives, des champignons Candida et des aspergilli. Au cours de la période post-transplantation précoce (deuxième et troisième mois après la greffe), l'infection la plus grave est le cytomégalovirus, qui entraîne souvent le décès des patients lors de la deuxième phase des complications infectieuses. Dans la thalassémie, une infection à cytomégalovirus après greffe de moelle osseuse se développe chez 1,7 à 4,4 % des receveurs. La troisième phase est observée tard dans la période post-transplantation (trois mois après l'opération) et se caractérise par un déficit immunitaire combiné sévère. Les infections causées par le virus varicelle-zona, le streptocoque, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae et les virus hépatotropes sont fréquentes durant cette période. Dans la thalassémie, la mortalité des patients après greffe de moelle osseuse est associée à un sepsis bactérien et fongique, une pneumonie interstitielle idiopathique et à cytomégalovirus, un syndrome de détresse respiratoire aiguë, une insuffisance cardiaque aiguë, une tamponnade cardiaque, une hémorragie cérébrale, une maladie veino-occlusive hépatique et une réaction aiguë du greffon contre l'hôte.

À l'heure actuelle, des progrès ont été réalisés dans le développement de méthodes d'isolement de populations pures de cellules souches hématopoïétiques à partir de la moelle osseuse. La technique d'obtention de sang fœtal à partir du cordon ombilical a été améliorée et des méthodes d'isolement de cellules souches hématopoïétiques à partir du sang de cordon ont été mises au point. La presse scientifique rapporte que les cellules souches hématopoïétiques sont capables de se multiplier lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant des cytokines. L'utilisation de bioréacteurs spécialement conçus pour l'expansion des cellules souches hématopoïétiques permet d'augmenter considérablement la biomasse de cellules souches hématopoïétiques isolées à partir de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang de cordon ombilical. La possibilité d'expansion des cellules souches hématopoïétiques constitue une étape importante vers le développement clinique de la transplantation cellulaire.

Cependant, avant la propagation in vitro des cellules souches hématopoïétiques, il est nécessaire d'isoler une population homogène de cellules souches hématopoïétiques. Ceci est généralement réalisé en utilisant des marqueurs qui permettent le marquage sélectif des cellules souches hématopoïétiques avec des anticorps monoclonaux liés de manière covalente à un marqueur fluorescent ou magnétique et leur isolement à l'aide d'un trieur de cellules approprié. Dans le même temps, la question des caractéristiques phénotypiques des cellules souches hématopoïétiques n'a pas été définitivement résolue. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) considèrent les cellules avec les antigènes CD34, AC133 et Thyl à leur surface et sans CD38, HLA-DR ou autres marqueurs de différenciation (cellules avec le phénotype CD34+Liir) comme candidates aux cellules souches hématopoïétiques. Les marqueurs de lignée (Lin) comprennent la glycophorine A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Les cellules avec le phénotype CD34+CD45RalüW CD71low, ainsi que le phénotype CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, sont considérées comme prometteuses pour la transplantation.

La question du nombre de cellules souches hématopoïétiques nécessaires à une transplantation efficace demeure problématique. Actuellement, les sources de cellules souches hématopoïétiques sont la moelle osseuse, le sang périphérique et de cordon ombilical, et le foie embryonnaire. L'expansion des cellules souches hématopoïétiques est obtenue par culture en présence de cellules endothéliales et de facteurs de croissance hématopoïétiques. Dans divers protocoles, les myéloprotéines, le SCF, l'érythropoïétine, les facteurs de croissance analogues à l'insuline, les corticostéroïdes et les œstrogènes sont utilisés pour induire la prolifération des CSH. L'utilisation de combinaisons de cytokines in vitro permet d'obtenir une augmentation significative du pool de CSH, avec un pic de production à la fin de la deuxième semaine de culture.

Traditionnellement, la greffe de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon est principalement utilisée pour traiter les hémoblastoses. Cependant, la dose minimale de cellules hématopoïétiques requise pour une greffe réussie est de 3,7 x 107 ^cellules nucléées par kg de poids corporel du receveur. L'utilisation d'un nombre réduit de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon augmente significativement le risque d'échec de la greffe et de récidive de la maladie. Par conséquent, la greffe de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon est principalement utilisée pour traiter les hémoblastoses chez l'enfant.

Malheureusement, il n'existe toujours pas de normes d'approvisionnement ni de protocoles standardisés pour l'utilisation clinique des cellules hématopoïétiques du sang de cordon. Par conséquent, les cellules souches du sang de cordon ne constituent pas une source légalement reconnue de cellules hématopoïétiques pour la transplantation. De plus, il n'existe aucune norme éthique ou juridique régissant les activités et l'organisation des banques de sang de cordon, contrairement à ce qui existe à l'étranger. Par ailleurs, pour une transplantation sûre, tous les échantillons de sang de cordon doivent être soigneusement surveillés. Avant de prélever du sang d'une femme enceinte, son consentement doit être obtenu. Chaque femme enceinte doit être examinée pour détecter le portage de l'HBsAg, la présence d'anticorps contre les virus de l'hépatite C, du VIH et de la syphilis. Chaque échantillon de sang de cordon doit être testé conformément aux normes pour le nombre de cellules nucléées, le CD34+ et la capacité de formation de colonies. De plus, le typage HbA, la détermination du groupe sanguin par ABO et son appartenance par le facteur Rh sont effectués. Les tests nécessaires sont la culture bactériologique pour la stérilité, les tests sérologiques pour les infections par le VIH-1 et le VIH-2, l'HBsAg, l'hépatite C, l'infection à cytomégalovirus, les HTLY-1 et HTLY-II, la syphilis et la toxoplasmose. De plus, la réaction en chaîne par polymérase est réalisée pour détecter les infections à cytomégalovirus et le VIH. Il semble judicieux de compléter les protocoles de tests par une analyse des GSC du sang de cordon afin de détecter des maladies génétiques telles que l'a-thalassémie, la drépanocytose, le déficit en adénosine désaminase, l'agammaglobulinémie de Bruton, les maladies de Hurler et de Ponter.

L'étape suivante de la préparation à la transplantation concerne la préservation des cellules souches hématopoïétiques. Les procédures les plus dangereuses pour la viabilité des cellules lors de leur préparation sont la congélation et la décongélation. Lors de la congélation, une partie importante des cellules hématopoïétiques peut être détruite par formation de cristaux. Des substances spéciales, les cryoprotecteurs, sont utilisées pour réduire le pourcentage de mort cellulaire. Le DMSO est généralement utilisé comme cryoprotecteur à une concentration finale de 10 %. Cependant, le DMSO à cette concentration présente un effet cytotoxique direct, qui se manifeste même dans des conditions d'exposition minimale. La réduction de l'effet cytotoxique est obtenue par le strict maintien d'une température nulle lors de l'exposition, ainsi que par le respect des réglementations de traitement du matériel pendant et après la décongélation (rapidité de toutes les manipulations, utilisation de procédures de lavage multiples). Des concentrations de DMSO inférieures à 5 % sont déconseillées, car elles entraînent une mort massive des cellules hématopoïétiques pendant la période de congélation.

La présence d'impuretés érythrocytaires dans la suspension de cellules souches hématopoïétiques crée un risque de réaction d'incompatibilité avec les antigènes érythrocytaires. Parallèlement, lors du retrait des érythrocytes, la perte de cellules hématopoïétiques augmente considérablement. À cet égard, une méthode d'isolement non fractionné des cellules souches hématopoïétiques a été proposée. Dans ce cas, une solution de DMSO à 10 % et un refroidissement à vitesse constante (GS/min) à -80 °C sont utilisés pour protéger les cellules nucléées des effets néfastes des basses températures, après quoi la suspension cellulaire est congelée dans de l'azote liquide. Cette méthode de cryoconservation entraînerait une lyse partielle des érythrocytes, de sorte que les échantillons sanguins ne nécessitent pas de fractionnement. Avant la transplantation, la suspension cellulaire est décongelée, lavée de l'hémoglobine libre et du DMSO dans une solution d'albumine humaine ou dans du sérum sanguin. La préservation des précurseurs hématopoïétiques par cette méthode est certes plus élevée qu'après fractionnement du sang de cordon ombilical, mais le risque de complications transfusionnelles dues à la transfusion d'érythrocytes ABO-incompatibles demeure.

La mise en place d'un système bancaire pour le stockage des échantillons de CSH testés et typés HLA pourrait résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus. Cependant, cela nécessite l'élaboration de normes éthiques et juridiques, qui sont actuellement en discussion. Avant de créer un réseau bancaire, il est nécessaire d'adopter un certain nombre de réglementations et de documents sur la normalisation des procédures de collecte, de fractionnement, de test et de typage, ainsi que de cryoconservation des CSH. Une condition indispensable au bon fonctionnement des banques de CSH est la mise en place d'une base informatique permettant l'interaction avec les registres de la World Marrow Donor Association (WMDA) et du National Marrow Donor Program of the United States (NMDP).

De plus, il est nécessaire d'optimiser et de standardiser les méthodes d'expansion in vitro des CSH, principalement des cellules hématopoïétiques du sang de cordon. L'expansion des CSH du sang de cordon est nécessaire pour augmenter le nombre de receveurs potentiels compatibles avec le système HLA. En raison des faibles volumes de sang de cordon, le nombre de CSH qu'il contient ne permet généralement pas d'assurer la repopulation de la moelle osseuse chez les patients adultes. Parallèlement, pour réaliser des greffes non apparentées, il est nécessaire de disposer d'un nombre suffisant d'échantillons de CSH typés (de 10 000 à 1 500 000 par receveur).

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques n'élimine pas les complications liées à la greffe de moelle osseuse. Les analyses montrent qu'avec la greffe de cellules souches du sang de cordon, des formes graves de réaction aiguë du greffon contre l'hôte se développent chez 23 % des receveurs et des formes chroniques chez 25 %. Chez les patients atteints d'oncohématologie, des rechutes de leucémie aiguë au cours de la première année suivant la greffe de cellules souches du sang de cordon sont observées dans 26 % des cas.

Ces dernières années, les méthodes de transplantation de cellules souches hématopoïétiques périphériques ont connu un développement intensif. La teneur en CSH dans le sang périphérique est si faible (1 CSH pour 100 000 cellules sanguines) que leur isolement sans préparation particulière est insensé. Par conséquent, le donneur reçoit d'abord un traitement médicamenteux stimulant la libération de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse dans le sang. À cette fin, des médicaments loin d'être inoffensifs comme le cyclophosphamide et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes sont utilisés. Cependant, même après mobilisation des CSH dans le sang périphérique, la teneur en cellules CD34+ ne dépasse pas 1,6 %.

Pour la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques en clinique, la S-SEC est le plus souvent utilisée, une technique caractérisée par une tolérance relativement bonne, à l'exception de l'apparition quasi naturelle de douleurs osseuses. Il est à noter que l'utilisation de séparateurs de sang modernes permet une isolation efficace des cellules souches hématopoïétiques. Cependant, dans des conditions d'hématopoïèse normales, au moins six procédures doivent être réalisées pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques, comparable en termes de capacité de repopulation à une suspension de moelle osseuse. Chaque procédure nécessite le traitement de 10 à 12 litres de sang sur le séparateur, ce qui peut entraîner une thrombocytopénie et une leucopénie. La procédure de séparation implique l'administration d'un anticoagulant (citrate de sodium) au donneur, ce qui n'exclut pas, cependant, une activation plaquettaire par contact lors de la centrifugation extracorporelle. Ces facteurs favorisent le développement de complications infectieuses et hémorragiques. Un autre inconvénient de la méthode est la variabilité importante de la réponse de mobilisation, ce qui nécessite de surveiller la teneur en HSC dans le sang périphérique des donneurs, ce qui est nécessaire pour déterminer leur niveau maximal.

Contrairement à l'allogreffe, l'autogreffe de cellules souches hématopoïétiques élimine totalement le risque de réaction de rejet. Cependant, son inconvénient majeur, limitant son champ d'application, réside dans la forte probabilité de réinjection de cellules clonales leucémiques lors du greffon. De plus, l'absence d'effet « greffe contre tumeur » à médiation immunitaire augmente significativement la fréquence des rechutes des hémopathies malignes. Par conséquent, la seule méthode radicale pour éliminer l'hématopoïèse clonale néoplasique et restaurer une hématopoïèse polyclonale normale dans les syndromes myélodysplasiques reste la polychimiothérapie intensive avec transplantation d'hématopoïèse allogénique.

Mais même dans ce cas, le traitement de la plupart des hémoblastoses vise uniquement à augmenter la survie des patients et à améliorer leur qualité de vie. Selon plusieurs études de grande envergure, une survie sans récidive à long terme après allotransplantation de CSH est obtenue chez 40 % des patients oncohématologiques. Lors de l'utilisation de cellules souches d'un frère ou d'une sœur HLA-compatible, les meilleurs résultats sont observés chez les patients jeunes ayant des antécédents récents de la maladie, un taux de blastes allant jusqu'à 10 % et une cytogénétique favorable. Malheureusement, la mortalité associée à l'allotransplantation de CSH chez les patients atteints de maladies myélodysplasiques reste élevée (environ 40 % dans la plupart des rapports). Les résultats d'une étude menée sur 10 ans par le National Bone Marrow Donor Program aux États-Unis (510 patients, âge médian: 38 ans) indiquent que la survie sans récidive à deux ans est de 29 %, avec une probabilité de récidive relativement faible (14 %). Cependant, la mortalité associée à l'allotransplantation de CSH provenant d'un donneur non apparenté est extrêmement élevée et atteint 54 % sur une période de deux ans. Des résultats similaires ont été obtenus dans une étude européenne (118 patients, âge médian: 24 ans, survie sans récidive à deux ans: 28 %, récidive: 35 %, mortalité: 58 %).

Lors de chimiothérapies intensives suivies d'une restauration de l'hématopoïèse par des cellules hématopoïétiques allogéniques, des complications immunohématologiques et transfusionnelles surviennent fréquemment. Elles sont en grande partie dues au fait que les groupes sanguins humains sont hérités indépendamment des molécules du CMH. Par conséquent, même si le donneur et le receveur sont compatibles pour les principaux antigènes HLA, leurs érythrocytes peuvent présenter des phénotypes différents. On distingue l'incompatibilité « majeure », lorsque le receveur possède des anticorps préexistants contre les antigènes érythrocytaires du donneur, et l'incompatibilité « mineure », lorsque le donneur possède des anticorps contre les antigènes érythrocytaires du receveur. Des cas d'incompatibilités combinées « majeures » et « mineures » sont possibles.

Les résultats d'une analyse comparative de l'efficacité clinique de l'allotransplantation de cellules souches hématopoïétiques de moelle osseuse et de sang de cordon dans les hémoblastoses indiquent que chez les enfants après allotransplantation de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, le risque de développer une réaction du greffon contre l'hôte est significativement réduit, mais une période de récupération plus longue du nombre de neutrophiles et de plaquettes est observée avec une incidence plus élevée de mortalité à 100 jours après la transplantation.

L'étude des causes de mortalité précoce a permis de clarifier les contre-indications à la greffe allogénique de CSH, parmi lesquelles les plus importantes sont:

• la présence de tests positifs à l’infection à cytomégalovirus chez le receveur ou le donneur (sans traitement préventif);
• maladie aiguë des radiations;
• la présence ou même la suspicion de la présence d'une infection mycosique chez un patient (sans effectuer de prophylaxie systémique précoce avec des médicaments fongicides);
• hémoblastoses, dans lesquelles les patients ont reçu un traitement à long terme avec des cytostatiques (en raison de la forte probabilité d'arrêt cardiaque soudain et de défaillance multiviscérale);
• transplantation à partir de donneurs HLA non identiques (sans prophylaxie de la réaction aiguë du greffon contre l'hôte avec la cyclosporine A);
• hépatite virale chronique C (en raison du risque élevé de développer une maladie veino-occlusive du foie).

La transplantation de CSH peut donc entraîner de graves complications, souvent mortelles. Au début (jusqu'à 100 jours après la transplantation), on peut citer les complications infectieuses, la réaction aiguë du greffon contre l'hôte, le rejet du greffon (défaillance des CSH du donneur), la maladie veino-occlusive hépatique, ainsi que les lésions tissulaires causées par la toxicité du traitement, caractérisée par un taux de remodelage élevé (peau, endothélium vasculaire, épithélium intestinal). Les complications tardives après la transplantation comprennent la réaction chronique du greffon contre l'hôte, les rechutes de la maladie sous-jacente, le retard de croissance chez l'enfant, le dysfonctionnement de l'appareil reproducteur et de la glande thyroïde, et les lésions oculaires.

Récemment, suite aux publications sur la plasticité des cellules de la moelle osseuse, l'idée d'utiliser les CSH pour traiter les crises cardiaques et d'autres maladies a émergé. Bien que certaines expériences animales étayent cette possibilité, les conclusions concernant la plasticité des cellules de la moelle osseuse doivent être confirmées. Ce fait doit être pris en compte par les chercheurs qui pensent que les cellules de moelle osseuse humaines transplantées se transforment facilement en cellules du muscle squelettique, du myocarde ou du système nerveux central. L'hypothèse selon laquelle les CSH sont une source cellulaire naturelle de régénération de ces organes nécessite des preuves solides.

Français En particulier, les premiers résultats d'une étude randomisée ouverte menée par V. Belenkov (2003) ont été publiés. Son objectif était d'étudier l'effet de la C-SvK (c'est-à-dire la mobilisation de CSH autologues dans le sang) sur l'état clinique, hémodynamique et neurohumoral de patients atteints d'insuffisance cardiaque chronique modérée à sévère, ainsi que d'évaluer sa sécurité par rapport au traitement standard (inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine, bêtabloquants, diurétiques, glycosides cardiaques). Dans la première publication des résultats de l'étude, les auteurs du programme notent que le seul argument en faveur de l'O-SvK réside dans les résultats du traitement d'un patient, qui a montré une amélioration incontestable de tous les paramètres cliniques et hémodynamiques grâce à ce traitement. Cependant, la théorie de la mobilisation des HSC dans la circulation sanguine avec régénération myocardique ultérieure dans la zone post-infarctus n'a pas été confirmée - même chez un patient avec une dynamique clinique positive, l'échocardiographie de stress avec dobutamine n'a pas révélé l'apparition de zones de myocarde viable dans la zone cicatricielle.

Il convient de noter qu'à l'heure actuelle, les données sont clairement insuffisantes pour recommander une mise en œuvre généralisée de la thérapie cellulaire de remplacement en pratique clinique quotidienne. Des études cliniques bien conçues et de haute qualité sont nécessaires pour déterminer l'efficacité des différentes options de thérapie cellulaire régénérative, en définir les indications et les contre-indications, ainsi que pour élaborer des recommandations pour l'utilisation combinée de la thérapie régénérative-plastique et des traitements chirurgicaux ou conservateurs traditionnels. On ignore encore quelle population particulière de cellules de la moelle osseuse (souches hématopoïétiques ou stromales) peut donner naissance aux neurones et aux cardiomyocytes, et on ignore également quelles conditions contribuent à ce phénomène in vivo.

Des travaux dans ces domaines sont menés dans de nombreux pays. Le compte rendu du symposium sur l'insuffisance hépatique aiguë des National Institutes of Health des États-Unis mentionne, parmi les méthodes thérapeutiques prometteuses, outre la transplantation hépatique, la transplantation d'hépatocytes xéno- ou allogéniques et la connexion extracorporelle de bioréacteurs avec des cellules hépatiques. Il est prouvé que seuls les hépatocytes étrangers fonctionnellement actifs sont capables de soutenir efficacement le foie du receveur. Pour l'utilisation clinique des hépatocytes isolés, il est nécessaire de créer une banque de cellules, ce qui réduira considérablement le délai entre l'isolement et l'utilisation. La méthode la plus efficace pour créer une banque d'hépatocytes isolés est la cryoconservation des cellules hépatiques dans l'azote liquide. L'utilisation de ces cellules en clinique chez les patients atteints d'insuffisance hépatique aiguë et chronique a montré un effet thérapeutique assez élevé.

Malgré les résultats optimistes et encourageants de la transplantation de cellules hépatiques, tant expérimentaux qu'en pratique clinique, de nombreux problèmes restent encore à résoudre. Parmi ceux-ci figurent le nombre limité d'organes adaptés à l'obtention d'hépatocytes isolés, l'efficacité insuffisante des méthodes d'isolement, l'absence de méthodes standardisées de conservation des cellules hépatiques, le manque de clarté des mécanismes de régulation de la croissance et de la prolifération des cellules transplantées, et l'absence de méthodes adéquates pour évaluer la prise ou le rejet des hépatocytes allogéniques. Ceci inclut également l'existence d'une immunité à la greffe lors de l'utilisation de cellules allogéniques et xénogéniques, certes moindre que lors de la transplantation hépatique orthotopique, mais nécessitant l'utilisation d'immunosuppresseurs, l'encapsulation des hépatocytes isolés ou leur traitement enzymatique spécifique. La transplantation d'hépatocytes entraîne souvent un conflit immunitaire entre le receveur et le donneur sous la forme d'une réaction de rejet, nécessitant l'utilisation de cytostatiques. Une solution à ce problème pourrait être l’utilisation de supports microporeux polymères pour isoler les cellules hépatiques, ce qui améliorera leur survie, puisque la membrane de la capsule protège efficacement les hépatocytes malgré l’immunisation de l’hôte.

Cependant, en cas d'insuffisance hépatique aiguë, une telle transplantation d'hépatocytes est inefficace en raison du temps relativement long nécessaire aux cellules hépatiques pour se greffer dans un nouvel environnement et atteindre un fonctionnement optimal. Une limitation potentielle est la sécrétion de bile lors de la transplantation ectopique d'hépatocytes isolés, et lors de l'utilisation de bioréacteurs, une barrière physiologique importante est l'incompatibilité entre les protéines humaines et celles produites par les hépatocytes xénogéniques.

La littérature médicale rapporte que la transplantation locale de cellules souches stromales de moelle osseuse facilite la correction efficace des défauts osseux, et que la restauration du tissu osseux est dans ce cas plus intensive qu'avec la régénération réparatrice spontanée. Plusieurs études précliniques sur des modèles expérimentaux démontrent de manière convaincante la possibilité d'utiliser des greffes de cellules souches stromales de moelle osseuse en orthopédie, bien que des travaux supplémentaires soient nécessaires pour optimiser ces méthodes, même dans les cas les plus simples. En particulier, les conditions optimales pour l'expansion des cellules stromales ostéogéniques ex vivo n'ont pas encore été trouvées, et la structure et la composition de leur support idéal (matrice) restent à déterminer. Le nombre minimal de cellules nécessaires à la régénération osseuse volumétrique n'a pas été déterminé.

Il a été démontré que les cellules souches mésenchymateuses présentent une plasticité transgermique, c'est-à-dire la capacité de se différencier en types cellulaires phénotypiquement différents des cellules de la lignée d'origine. Dans des conditions de culture optimales, les lignées polyclonales de cellules souches stromales de moelle osseuse peuvent supporter plus de 50 divisions in vitro, ce qui permet d'obtenir des milliards de cellules stromales à partir d'1 ml d'aspirat de moelle osseuse. Cependant, la population de cellules souches mésenchymateuses est hétérogène, ce qui se manifeste à la fois par une variabilité de la taille des colonies, des taux différents de formation et une diversité morphologique des types cellulaires, allant des cellules fusiformes de type fibroblaste aux grandes cellules plates. L'hétérogénéité phénotypique est observée après seulement 3 semaines de culture de cellules souches stromales: certaines colonies forment des nodules de tissu osseux, d'autres des amas d'adipocytes et d'autres, plus rares, des îlots de tissu cartilagineux.

La transplantation de tissu nerveux embryonnaire a été initialement utilisée pour traiter les maladies dégénératives du système nerveux central. Ces dernières années, des éléments cellulaires de neurosphères obtenus à partir de cellules souches neurales ont été transplantés à la place de tissu cérébral embryonnaire (Poltavtseva, 2001). Les neurosphères contiennent des précurseurs de neurones et de cellules gliales, ce qui laisse espérer une restauration des fonctions cérébrales perdues après leur transplantation. Après transplantation de cellules neurosphériques dispersées dans la région striatum du cerveau de rat, leur prolifération et leur différenciation en neurones dopaminergiques ont été observées, ce qui a éliminé l'asymétrie motrice chez les rats atteints d'hémiparkinsonisme expérimental. Cependant, dans certains cas, des tumeurs se sont développées à partir de ces cellules, entraînant la mort des animaux (Bjorklund, 2002).

En clinique, des études approfondies menées sur deux groupes de patients, dont ni les patients ni les médecins les observant ne savaient (étude en double aveugle), ont montré que l'un avait reçu une greffe de tissu embryonnaire contenant des neurones producteurs de dopamine et que l'autre avait subi une opération simulée. Ces études ont donné des résultats inattendus. Les patients transplantés de tissu nerveux embryonnaire ne se sentaient pas mieux que les patients du groupe témoin. De plus, 5 patients sur 33 ont développé une dyskinésie persistante deux ans après la greffe de tissu nerveux embryonnaire, absente chez les patients du groupe témoin (Cellules souches: progrès scientifiques et orientations futures de la recherche. Nat. Inst. of Health. États-Unis). L'un des problèmes non résolus de la recherche clinique sur les cellules souches neurales cérébrales reste l'analyse des perspectives et des limites réelles de la transplantation de leurs dérivés pour la correction des troubles du SNC. Il est possible que la neurogenèse dans l'hippocampe, induite par une activité convulsive prolongée, conduisant à sa réorganisation structurelle et fonctionnelle, puisse être un facteur dans le développement progressif de l'épilepsie. Cette conclusion mérite une attention particulière, car elle met en évidence les conséquences négatives possibles de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau mature et de la formation de connexions synaptiques aberrantes par ceux-ci.

Il ne faut pas oublier que la culture en milieu contenant des cytokines (mitogènes) rapproche les caractéristiques des cellules souches de celles des cellules tumorales, car des modifications similaires de la régulation des cycles cellulaires s'y produisent, déterminant leur capacité à se diviser sans limite. Il est imprudent de transplanter des dérivés précoces de cellules souches embryonnaires chez l'homme, car le risque de développer des tumeurs malignes est alors très élevé. Il est beaucoup plus sûr d'utiliser leur progéniture plus stable, c'est-à-dire des cellules précurseurs de lignées différenciées. Cependant, à l'heure actuelle, aucune technique fiable permettant d'obtenir des lignées stables de cellules humaines se différenciant dans la direction souhaitée n'a encore été développée.

L'utilisation des technologies de biologie moléculaire pour la correction des pathologies héréditaires et des maladies humaines par la modification des cellules souches présente un intérêt majeur pour la médecine. Les caractéristiques du génome des cellules souches permettent de développer des schémas de transplantation uniques pour corriger les maladies génétiques. Cependant, ce domaine présente plusieurs limites qu'il convient de surmonter avant toute application pratique du génie génétique des cellules souches. Tout d'abord, il est nécessaire d'optimiser le processus de modification génomique ex vivo des cellules souches. Il est connu qu'une prolifération prolongée (3 à 4 semaines) des cellules souches réduit leur transfection; plusieurs cycles de transfection sont donc nécessaires pour atteindre un niveau élevé de modification génétique. Cependant, le principal problème réside dans la durée d'expression des gènes thérapeutiques. Jusqu'à présent, aucune étude n'a démontré que la période d'expression efficace après transplantation de cellules modifiées dépassait quatre mois. Dans 100 % des cas, l'expression des gènes transfectés diminue avec le temps en raison de l'inactivation des promoteurs et/ou de la mort des cellules dont le génome est modifié.

Un enjeu important est le coût de l'utilisation des technologies cellulaires en médecine. Par exemple, le besoin annuel estimé pour financer uniquement les frais médicaux d'une unité de transplantation de moelle osseuse conçue pour réaliser 50 greffes par an est d'environ 900 000 dollars américains.

Le développement des technologies cellulaires en médecine clinique est un processus complexe et multi-étapes qui implique une coopération constructive entre des centres scientifiques et cliniques multidisciplinaires et la communauté internationale. Parallèlement, les questions d'organisation scientifique de la recherche en thérapie cellulaire requièrent une attention particulière. Les plus importantes sont l'élaboration de protocoles de recherche clinique, le contrôle de la fiabilité des données cliniques, la constitution d'un registre national des études, l'intégration dans des programmes internationaux d'études cliniques multicentriques et la mise en œuvre des résultats en pratique clinique.

En conclusion de l’introduction aux problèmes de la transplantologie cellulaire, je voudrais exprimer l’espoir que l’unification des efforts des principaux spécialistes ukrainiens de divers domaines scientifiques assurera des progrès significatifs dans la recherche expérimentale et clinique et permettra dans les années à venir de trouver des moyens efficaces pour fournir une assistance aux personnes gravement malades ayant besoin d’une transplantation d’organes, de tissus et de cellules.

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