Limites, dangers et complications de la transplantation cellulaire

Médecine plastique récupération est basée sur la réalisation dans la clinique et propriétés toti- souches embryonnaires pluripotentes et cellules souches, permettant in vitro et in vivo pour créer une lignée cellulaire prédéterminées repeupler les tissus et organes endommagés d'un patient humain.

La possibilité réelle d'utiliser les cellules souches de l'embryon et les cellules souches de tissus définitifs (les cellules souches adultes) d'un être humain à des fins thérapeutiques ne fait plus de doute. Cependant, les experts des académies nationales et médicales des États-Unis recommandent d'étudier plus en détail les propriétés des cellules souches dans les expériences. Sur des modèles biologiques adéquats et évaluer objectivement toutes les conséquences de la transplantation, et seulement ensuite utiliser des cellules souches dans la clinique.

Il est établi que les cellules souches font partie des dérivés tissulaires des trois feuillets embryonnaires. Les cellules souches se trouvent dans la rétine, la cornée, la peau, l'épiderme, la moelle osseuse et le sang périphérique, dans les vaisseaux, la pulpe de la dent, le rein, l'épithélium du tube digestif, le pancréas et le foie. Avec l'aide de méthodes modernes, il est prouvé que les cellules neurales de la tige sont localisées dans le cerveau et la moelle épinière de l'adulte. Ces données sensationnelles ont attiré l'attention des scientifiques et des médias, puisque les neurones du cerveau ont servi d'exemple classique d'une population de cellules statiques qui ne se rétablit pas. Les deux périodes précoces et tardives de l'ontogenèse en raison de cellules souches neurales dans le cerveau humain et animal neurones générés, astrocytes et oligodendrocytes (cellules souches: progrès scientifiques et les orientations futures de la recherche Nat Inst, de la Santé USA ..).

Cependant, dans des conditions normales, la plasticité des cellules souches des tissus définitifs n'apparaît pas. Pour réaliser le potentiel plastique des cellules souches des tissus définitifs, il faut les isoler puis les cultiver dans des milieux contenant des cytokines (LIF, EGF, FGF). De plus, les dérivés de cellules souches survivent avec succès seulement lorsqu'ils sont transplantés dans le corps d'un animal avec un système immunitaire déprimé (irradiation y, cytostatiques, busulfan, etc.). À ce jour, il n'y a eu aucune preuve convaincante de la plasticité des cellules souches chez les animaux qui n'ont pas été irradiés ou autrement exposés à une immunosuppression profonde.

Dans de telles circonstances, PGC Potence dangereuses se manifestent principalement dans leur zone de transplantation extra-utérine - injection sous-cutanée ESK souris immunodéficientes au site d'injection tératocarcinome formé. En outre, au cours de la fréquence de développement de l'embryon humain d'anomalies chromosomiques que dans l'embryogenèse chez les animaux. Au stade de blastocyste seulement 20-25% des embryons humains sont composés de cellules avec un caryotype normal, et dans la grande majorité des premiers embryons humains obtenus après la fécondation in vitro, mosaïcisme chromosomique détectée aberrations numériques et structurelles chaotiques et très fréquentes.

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Effet bénéfique des cellules souches

Les résultats préliminaires des essais cliniques confirment l'effet bénéfique des cellules souches sur le patient, mais jusqu'à présent il n'y a pas d'informations sur les conséquences à long terme de la transplantation de cellules. Dans la littérature, d'abord dominé par les rapports des résultats positifs de la transplantation de fragments de moelle d'embryons dans la maladie de Parkinson, mais ont commencé à apparaître les données des effets thérapeutiques efficaces niant de tissu nerveux embryon ou du fœtus transplantées dans le cerveau des patients.

Au milieu du XX siècle, la restauration de l'hématopoïèse a été découvert chez les animaux irradiés après la transfusion intraveineuse léthale de cellules de moelle osseuse, et en 1969, le chercheur américain D. Thomas a effectué le premier homme de greffe de moelle osseuse. Le manque de connaissances sur les mécanismes d'incompatibilité immunologique os donneur de moelle et le receveur alors que la mortalité élevée due à la greffe de neprizhivleniya fréquents et réaction de développement « du greffon contre l'hôte ». La découverte du complexe majeur d'histocompatibilité, qui est composé d'antigène de leucocyte humain (HbA), et l'amélioration des méthodes de typage permet d'augmenter significativement le taux de survie après une transplantation de moelle osseuse, ce qui a conduit à cette méthode répandue de traitement en oncologie et d'hématologie. Après une décennie, la première transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenues à partir du sang périphérique à l'aide de la leucaphérèse a été réalisée. En 1988, en France pour le traitement d'un enfant souffrant d'anémie de Fanconi comme source de cellules souches hématopoïétiques, il a été d'abord utilisé le sang de cordon ombilical, et la fin de l'année 2000 dans la presse ont commencé à apparaître sur la capacité des cellules souches hématopoïétiques à se différencier en cellules de différents types de tissus qui augmente potentiellement la portée de leur application clinique. Cependant, il s'est avéré que le matériel pour la transplantation, avec GSK, contient un nombre important de cellules non hématopoïétiques, qui sont de nature et de propriétés diverses. A ce propos, des méthodes de purification du greffon et des critères d'évaluation de sa pureté cellulaire sont en cours de développement. En particulier, une immunosection positive des cellules CD34 + est utilisée, ce qui permet d'isoler les CSH à l'aide d'anticorps monoclonaux.

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Complications de la thérapie des cellules souches

Les complications de la greffe de moelle osseuse sont le plus souvent hématologiques et associées à une période prolongée de pancytopénie iatrogène. Les infections les plus courantes sont l'anémie, l'anémie et les hémorragies. A cet égard, il est très important de savoir comment trouver le mode d'échantillonnage optimal, le traitement et le stockage de la moelle osseuse pour la conservation maximale des cellules souches qui permettent une reprise rapide et stable de l'hématopoïèse. Pour caractériser le greffon prises pour évaluer les paramètres suivants, il est maintenant: le nombre de mononucléaires et / ou des cellules nucléées et des unités de formation de colonies de cellules contenu SB34-positifs. Malheureusement, ces indicateurs ne fournissent qu'une estimation indirecte de la capacité hématopoïétique réelle de la population de transplantation de cellules souches. Pour aujourd'hui, il existe des paramètres absolument précis pour déterminer la suffisance de la transplantation pour la récupération à long terme de l'hémopoïèse chez les patients, même dans la greffe de moelle osseuse autologue. Le développement de critères communs est extrêmement difficile en raison de l'absence de normes rigoureuses de traitement, de cryoconservation et de tests de greffe. En outre, il est nécessaire de prendre en compte la variété des facteurs qui influencent les paramètres de la récupération réussie de l'hématopoïèse chez chaque patient particulier. Dans la greffe de moelle osseuse autologue les plus importantes sont le nombre de régimes antérieurs, en particulier le régime de conditionnement, une période de la maladie, qui est produite dans la colonie d'application de système de collecte de moelle osseuse facteurs de stimulation dans la période post-transplantation. De plus, il ne faut pas oublier que la chimiothérapie précédée d'une greffe fœtale peut avoir un effet négatif sur les cellules souches de la moelle osseuse.

L'incidence des complications toxiques sévères augmente significativement avec la greffe de moelle osseuse allogénique. A cet égard, des données statistiques sur la transplantation de moelle osseuse allogénique dans la thalassémie sont intéressantes. Dans les rapports du Groupe européen de transplantation de moelle osseuse, environ 800 greffes de moelle osseuse ont été enregistrées chez des patients présentant une thalassémie importante. La transplantation allogénique dans la plupart des cas thalassémie dans effectuées à partir de frères et soeurs HLA-identique, qui est associée à des complications graves et une mortalité plus élevée dans la transplantation de matériel de cellules souches liées partiellement compatible ou apparié donneurs non apparentés. Pour minimiser le risque de complications infectieuses fatales, les patients sont placés dans des boîtes aseptiques isolées à flux laminaire d'air, recevant un régime alimentaire faible ou abactérien. Pour la décontamination bactérienne de l'intestin, on prescrit des formes non résorptives d'antibiotiques, des médicaments antifongiques. Afin d'éviter amphotéricine intraveineuse B. Prévention des infections systémiques fixes amikacine et ceftazidime, qui désignent le jour avant la transplantation, tout en continuant le traitement des patients à décharge. Toutes les préparations de sang avant l'irradiation sont irradiées à une dose de 30 Gy. La nutrition parentérale pendant la transplantation est une condition préalable et commence immédiatement en limitant la prise de nourriture naturellement.

Un certain nombre de complications associées à la forte toxicité des médicaments immunosuppresseurs, qui provoquent souvent des nausées, des vomissements et une mucite, des lésions rénales et la pneumonie interstitielle. L'une des complications les plus graves de la chimiothérapie est une maladie veino-occlusive du foie, entraînant la mort au début de la période post-transplantation. Parmi les facteurs de risque de thrombose veineuse du système de portail du foie doit noter l'âge du patient, la présence de l'hépatite et la fibrose hépatique, et la tenue un traitement immunosuppresseur après une transplantation de moelle osseuse. La maladie Venookklyuzionnaya est particulièrement dangereux dans la thalassémie, qui est accompagnée d'une fibrose du foie et de l'hépatite hémosidérose - satellites fréquents traduisons traitement fusionnelles. La thrombose veineuse du système de portail du foie se développe dans 1-2 semaines après la transplantation et se caractérise par une augmentation rapide de la bilirubinémie et des transaminases, hépatomégalie progressive, ascite, encéphalopathie, et la douleur dans l'abdomen supérieur. Histologiquement matériel d'autopsie défini dans des lésions endothéliales, une hémorragie sous-endothélial, les lésions tsentrolobulyarnyh hépatocytes, l'obstruction thrombotique veinules hépatiques et de la veine centrale. Chez les patients atteints de thalassémie, des cas d'arrêt cardiaque fatal associés à des effets toxiques des cytostatiques ont été décrits.

En préparation à la transplantation, le cyclophosphamide et le busulfan provoquent souvent une cystite hémorragique toxique avec des modifications pathologiques dans les cellules uroépithéliales. L'utilisation de la cyclosporine A dans la greffe de moelle osseuse s'accompagne souvent d'effets de néphrotoxicité et de neurotoxicité, de syndrome d'hypertension, de rétention hydrique dans le corps et de cytolyse des hépatocytes. Violation de la fonction sexuelle et reproductive est plus souvent observée chez les femmes. Chez les jeunes enfants après la transplantation, le développement pubertaire ne souffre généralement pas, mais chez les enfants plus âgés, la pathologie du développement de la sphère génitale peut être très grave - jusqu'à la stérilité. Les complications directement liées à la transplantation elle-même incluent le rejet des cellules allogéniques de la moelle osseuse, l'incompatibilité dans le système ABO, les formes aiguës et chroniques de la réaction «greffon contre hôte».

Dans le patient après le type osseux incompatible ABO greffe de moelle idioagglutinin « hôte contre ABO donneur » produit dans 330-605 jours après la transplantation, ce qui peut conduire à une hémolyse prolongée et une forte augmentation du besoin de transfusions sanguines. Complication dit est empêché par la transfusion de groupes érythrocytes seulement 0. Après transplantation dans un certain nombre de patients, la neutropénie auto-immune, la thrombocytopénie, la pancytopénie, ou, pour la correction qui doit être effectuée splénectomie.

Chez 35 à 40% des receveurs, la réaction aiguë «greffon contre hôte» se développe dans les 100 jours suivant la transplantation de la moelle osseuse allogénique HbA-identique. Le degré de lésions de la peau, le foie et les intestins varie d'une éruption cutanée, une hyperbilirubinémie, la diarrhée et légère à la desquamation de la peau, une occlusion intestinale, et l'insuffisance hépatique aiguë. Les patients atteints de réaction aiguë fréquence de thalassémie « greffon contre l'hôte » mesure I après transplantation de moelle osseuse est de 75%, II et plus étendue - 11-53%. Comme un syndrome systémique multiviscérale réaction chronique « du greffon contre l'hôte » se développe habituellement dans 100-500 jours après la transplantation de moelle osseuse allogénique chez 30-50% des patients. La peau, la bouche, le foie, les yeux, l'œsophage et les voies respiratoires supérieures sont affectés. Distinguer forme limitée de « greffon contre l'hôte » de réaction chronique lorsque la peau affectée et / ou du foie, et généralisées, des lésions cutanées généralisées lorsqu'il est combiné avec l'hépatite chronique agressive, maladie des yeux, des glandes salivaires ou tout autre organe. La cause du décès est souvent les complications infectieuses résultant d'une immunodéficience sévère. Sous forme chronique légère thalassémie de la réaction « du greffon contre l'hôte » a été trouvé dans 12%, modérée - 3% et sévère - ont 0,9% des bénéficiaires de la moelle osseuse allogénique HLA compatible. Une complication sérieuse dans la greffe de moelle osseuse est le rejet de greffe, qui se développe 50-130 jours après l'opération. La fréquence de rejet dépend du mode de conditionnement. En particulier, les patients atteints de thalassémie traités pendant la préparation du méthotrexate seul, le rejet de greffe de moelle osseuse est observée dans 26% des cas, des combinaisons de methotrexate avec la cyclosporine A - 9%, et lors de l'affectation que la cyclosporine A - 8% des cas (Haziyev etc. ., 1995).

Les complications infectieuses après la greffe de moelle osseuse causent des virus, des bactéries et des champignons. Leur évolution est liée à la neutropénie profonde, qui est induite pendant le conditionnement de la chimiothérapie, cytostatiques défaite « du greffon contre l'hôte » barrières muqueuses et réaction. Selon le moment du développement, trois phases de complications infectieuses sont distinguées. Dans la première phase (le développement au cours du premier mois après la transplantation) est dominée par des dommages à la barrière muqueuse et neutropénie, souvent accompagnée d'infections virales (herpès, virus d'Epstein-Barr, le cytomégalovirus, Varicella zoster), ainsi que les infections causées par grampolozhi - bactéries inflammatoires et Gram-négatives, les champignons Candida , aspergillomes. Au début de la période post-transplantation (les deuxième et troisième mois après la transplantation) est l'infection à cytomégalovirus le plus grave, ce qui conduit souvent à la mort des patients dans la deuxième phase de l'infection. L'infection à cytomégalovirus thalassémie après transplantation de la moelle osseuse se produit dans des 01.07 à 04.04% des bénéficiaires. La troisième phase est observée à la fin de la période post-transplantation (trois mois après l'opération), et est caractérisé par une immunodéficience combinée sévère. Cette période est infections couramment causées par Varicella zoster, streptocoque, Pneumocystis Carini, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, et les virus hepatotropes. Mortalité thalassémie chez les patients après transplantation de moelle osseuse est associée à la septicémie bactérienne et fongique, interstitielle idiopathique et la pneumonie cytomégalovirus, le syndrome de détresse respiratoire aigu, l'insuffisance cardiaque aiguë, la tamponnade cardiaque, une hémorragie cérébrale, une maladie du foie venookklyuzionnoy et réaction aiguë « greffon contre l'hôte ».

A l'heure actuelle, certains progrès ont été réalisés dans le développement de méthodes permettant d'isoler de la moelle osseuse une population pure de cellules hématopoïétiques souches. La technique d'obtention du sang foetal à partir du cordon ombilical a été améliorée et des méthodes ont été développées pour isoler les cellules hématopoïétiques du sang de cordon. Dans la presse scientifique, il existe des rapports indiquant que lorsqu'ils sont cultivés dans des milieux contenant des cytokines, les cellules souches hématopoïétiques sont capables de se multiplier. Lors de l'utilisation de bioréacteurs spécialement conçus pour l'expansion des CSH, la biomasse des cellules hémopoïétiques souches isolées à partir de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang de cordon est significativement augmentée. La possibilité d'expansion de HSC est une étape importante dans le développement clinique de la greffe de cellules.

Cependant, avant la reproduction des CSH in vitro, il est nécessaire d'isoler une population homogène de cellules souches hématopoïétiques. Ceci est habituellement réalisé en utilisant des marqueurs qui permettent un marquage sélectif des CSH avec des anticorps monoclonaux liés de manière covalente à un marqueur fluorescent ou magnétique et les isolent en utilisant un trieur de cellules approprié. Dans le même temps, la question des caractéristiques phénotypiques des cellules souches hématopoïétiques n'a pas été définitivement résolue. A. Petrenko., V. Hryschenko (2003) en tant que candidats pour GSK traité des cellules, qui sont présents sur la surface de CD34, des antigènes AC133 et Thyl et aucun CD38, HLA-DR et d'autres marqueurs de différenciation (cellules avec le phénotype CD34 + Liir). Par marqueurs de différenciation de la lignée linéaire (Lin) comprennent glycophorine A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Perspective pour la transplantation sont des cellules avec le phénotype CD34 + CD45RalüW CD71low, ainsi que CD34 + Thyl + CD38low / c-kit / faible.

Le problème du nombre de CSH suffisant pour une transplantation efficace reste un problème. Actuellement, la source de cellules hématopoïétiques est la moelle osseuse, le sang périphérique et le sang de cordon, ainsi que le foie embryonnaire. L'expansion des cellules hématopoïétiques souches est réalisée en les cultivant en présence d'endothéliocytes et de facteurs de croissance hématopoïétiques. Dans divers protocoles, les myéloprotéines, le SCF, l'érythropoïétine, les facteurs de croissance analogues à l'insuline, les corticostéroïdes et les œstrogènes sont utilisés pour induire la prolifération des CSH. Lorsque des combinaisons de cytokines sont utilisées in vitro, une augmentation significative du pool de CSH peut être obtenue avec un pic de leur libération à la fin de la deuxième semaine de culture.

Traditionnellement, le sang de cordon HSC est utilisé principalement dans les hémoblastoses. Cependant, la dose minimum de cellules hématopoïétiques, qui sont nécessaires pour le succès de la transplantation de cellules de sang de cordon est de 3,7 × 10 ⁷ cellules nucléées pour 1 kg de poids corporel du receveur. L'utilisation d'une plus petite quantité de CSH augmente significativement le risque d'échec de la greffe et de rechute de la maladie. Par conséquent, la transplantation de cellules hématopoïétiques du sang du cordon ombilical est principalement utilisée dans le traitement de l'hémoblastose chez les enfants.

Malheureusement, il n'y a toujours pas de vide standard, et des protocoles normalisés utilisation clinique des cellules hématopoïétiques du sang de cordon. Par conséquent les cellules souches elles-mêmes de sang de cordon ne sont pas légalement reconnus comme une source de cellules souches hématopoïétiques pour la transplantation. En outre, il n'y a pas de règles éthiques ou juridiques régissant les activités et l'organisation des banques de krovb ombilical qui sont disponibles à l'étranger. Pendant ce temps, pour la sécurité de la transplantation de sang de cordon ombilical, doivent être surveillés attentivement tous les échantillons. Avant de prélever un échantillon de sang sur une femme enceinte, son consentement doit être obtenu. Doit être examiné chaque enceinte sur un chariot de HBsAg, des anticorps dirigés contre le virus de l'hépatite C, le VIH et la syphilis. Chaque échantillon de sang de cordon doit être testé sur le nombre standard de cellules nucléées et CD34 + capacité de formation de colonies. En outre, HbA mené dactylographie, ABO groupe sanguin et son appartenance au facteur Rh. Les procédures d'essai sont nécessaires sur la stérilité des cultures bactériologiques, un test sérologique pour le VIH-1 et VIH-2, HBsAg, le virus de l'hépatite C, une infection à cytomégalovirus, ntly ntly-1 et II, la syphilis, la toxoplasmose. En outre, pour la détection de la réaction de cytomegalovirus et de chaîne de la polymérase du VIH est réalisée. Il semble opportun de compléter l'analyse des protocoles d'essai CSHs ombilical de sang de cordon pour identifier ces maladies génétiques telles que la thalassémie et l'anémie falciforme, le déficit en adénosine désaminase, agammaglobulinemia Bruton, la maladie Harlera et punter.

Au stade suivant de la préparation pour la transplantation, la question se pose de la préservation de GSK. Les plus dangereux pour la viabilité des cellules lors de leur préparation sont les procédures de congélation et de décongélation. Lors de la congélation des cellules hématopoïétiques, une partie importante d'entre eux peuvent être détruits en raison de la formation de cristaux. Pour réduire le pourcentage de mort cellulaire, des substances spéciales sont utilisées - cryoprotecteurs. Le plus souvent, en tant que cryoprotecteur, le DMSO est utilisé à une concentration finale de 10%. Cependant, pour le DMSO, cette concentration est caractérisée par un effet cytotoxique direct, qui se manifeste même dans des conditions d'exposition minimale. La réduction de l'effet cytotoxique est obtenue par le maintien strict de la température zéro du mode d'exposition, ainsi que par le respect de la procédure de traitement du matériau et de décongélation (rapidité de toutes les manipulations, application de procédures de lavage réutilisables). Ne pas appliquer une concentration de DMSO inférieure à 5%, car dans ce cas, la mort massive des cellules hématopoïétiques se produit pendant la période de congélation.

La présence d'impuretés de globules rouges dans le mélange en suspension GSK crée le risque de développer une réaction d'incompatibilité pour les antigènes érythrocytaires. Dans le même temps, avec l'élimination des érythrocytes, la perte de cellules hématopoïétiques augmente de manière significative. A cet égard, une méthode de séparation non fractionnée de GCS a été proposée. Dans ce cas, pour protéger les cellules nucléées contre les effets néfastes de basses températures en utilisant une solution à 10% de DMSO et de refroidissement à une vitesse constante (HS / min) à -80 ° C, après quoi la suspension cellulaire a été congelée dans de l'azote liquide. On pense qu'avec cette technique de cryoconservation, une lyse partielle des érythrocytes a lieu, par conséquent les échantillons de sang ne nécessitent pas de fractionnement. Avant la transplantation, la suspension cellulaire est décongelée, lavée sans hémoglobine et sans DMSO dans une solution d'albumine ou de sérum humain. La préservation des progéniteurs hématopoïétiques en utilisant cette méthode est bien plus élevé que après le fractionnement du sang de cordon, mais le risque de complications dues à la transfusion de transfusions incompatibles ABO de globules rouges stockés.

La mise en place d'un système de banques pour le stockage des échantillons HSC testés et HSC pourrait résoudre les problèmes ci-dessus. Cependant, pour cela, il est nécessaire de développer des normes éthiques et juridiques, qui sont encore en cours de discussion. Avant la création d'un réseau bancaire, il est nécessaire d'adopter un certain nombre de dispositions et de documents sur la standardisation des procédures d'échantillonnage, de fractionnement, de test et de typage et de cryoconservation de la GCW. Une condition obligatoire pour le fonctionnement efficace des banques GSK est l'organisation d'une base informatique pour interagir avec les registres de la World Donor Medullary Association (WMDA) et du National Meditation Programme des États-Unis (NMDP).

De plus, il est nécessaire d'optimiser et de normaliser les méthodes d'expansion des CSH in vitro, principalement les cellules sanguines du cordon hématopoïétique. La reproduction du sang de cordon HSC est nécessaire pour augmenter le nombre de receveurs potentiels compatibles avec le système HLA. En raison de petits volumes de sang ombilical, la quantité de CSH qui y est contenue n'est, en règle générale, pas en mesure de fournir une repopulation de la moelle osseuse chez les patients adultes. En même temps, pour effectuer des transplantations sans rapport, il est nécessaire d'avoir accès à un nombre suffisant d'échantillons typiques de GSK (de 10 000 à 1 500 000 par 1 receveur).

La transplantation de cellules hématopoïétiques souches n'élimine pas les complications accompagnant la greffe de moelle osseuse. L'analyse montre que dans la transplantation de cellules souches du sang de cordon ombilical, des formes sévères de la réaction aiguë «greffon contre hôte» se développent chez 23% des patients, chroniques chez 25% des receveurs. Chez les patients oncohématologiques, des récidives de leucémie aiguë au cours de la première année suivant la transplantation de sang de cordon HSC sont observées dans 26% des cas.

Ces dernières années, les méthodes de transplantation de cellules souches hématopoïétiques périphériques se sont développées de manière intensive. La teneur en HSC dans le sang périphérique est si faible (il y a 1 GSK pour 100 000 cellules sanguines), que leur isolement sans préparation spéciale n'a pas de sens. Par conséquent, le donneur reçoit antérieurement une stimulation médicamenteuse de la libération de cellules de moelle osseuse hématopoïétiques dans le sang. A cette fin, des médicaments aussi inoffensifs que le cyclophosphamide et le facteur stimulant les colonies de granulocytes sont utilisés. Mais même après la procédure de mobilisation des CSH dans le sang périphérique, la teneur en cellules CD34 + n'excède pas 1,6%.

Pour mobiliser les CSH dans la clinique, le C-CEC est plus couramment utilisé, ce qui se caractérise par une relativement bonne tolérance, à l'exception de l'apparition presque régulière de la douleur dans les os. Il convient de noter que l'utilisation de séparateurs de sang modernes nous permet d'isoler efficacement les progéniteurs souches de l'hématopoïèse. Cependant, dans des conditions d'hématopoïèse normale, au moins 6 procédures doivent être effectuées pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques, comparable à la capacité repopulative de la suspension de moelle osseuse. Avec chaque procédure, le séparateur traite 10-12 litres de sang, ce qui peut provoquer une thrombocytopénie et une leucopénie. La procédure de séparation implique l'administration d'un anticoagulant (citrate de sodium) au donneur, ce qui n'exclut cependant pas l'activation par contact des plaquettes pendant la centrifugation extracorporelle. Ces facteurs créent des conditions pour le développement de complications infectieuses et hémorragiques. Un autre inconvénient de la méthode réside dans la variabilité considérable de la réponse de mobilisation, qui nécessite un suivi de la teneur en CSH chez les donneurs de sang périphérique, nécessaire pour déterminer leur taux maximal.

La transplantation autologue de CSH, contrairement à allogénique, exclut complètement le développement de la réaction de rejet. Néanmoins, un inconvénient important de l'autotransplantation des cellules hémopoïétiques souches, qui limite le spectre des indications à sa conduite, est une forte probabilité de réinjection des cellules clonales leucémiques avec une greffe. De plus, l'absence d'effet «greffe contre tumeur» immuno-médiée augmente significativement la fréquence des récurrences de maladie hématopoïétique maligne. Par conséquent, la seule façon radicale d'éliminer l'hémopoïèse clonale néoplasique et de restaurer l'hématopoïèse polyclonale normale dans les syndromes myélodysplasiques reste la polychimiothérapie intensive avec transplantation de GSK allogénique.

Mais même dans ce cas, le traitement de la plupart des hémoblastoses vise uniquement à augmenter le temps de survie des patients et à améliorer leur qualité de vie. Selon plusieurs études de grande envergure, la survie sans maladie prolongée après allotransplantation HSC est atteinte chez 40% des patients sous-hématologiques. Lors de l'utilisation de cellules souches de frères et soeurs compatibles avec l'HbA, les meilleurs résultats sont observés chez les jeunes patients avec un bref historique de la maladie, le nombre de blastes jusqu'à 10% et une cytogénétique favorable. Malheureusement, la mortalité associée à la procédure d'allotransplantation HSC chez les patients atteints de maladies myélodysplasiques reste élevée (dans la plupart des rapports - environ 40%). Les résultats des dix années de travail du Programme national des donneurs de moelle osseuse (510 patients, âge médian - 38 ans) indiquent que la survie sans maladie pendant deux ans est de 29% avec une probabilité de récidive relativement faible (14%). Cependant, la mortalité causée par la procédure d'allotransplantation GSC d'un donneur non apparenté est extrêmement élevée et atteint 54% sur une période de deux ans. Des résultats similaires ont été obtenus dans l'étude européenne (118 patients, âge médian 24 ans, survie sans récidive à 2 ans 28%, récidive 35%, mortalité 58%).

Lors d'une chimiothérapie intensive suivie d'une restauration de l'hématopoïèse par des cellules hématopoïétiques allogéniques, des complications immunohématologiques et transfusionnelles apparaissent souvent. À bien des égards, ils sont liés au fait que les groupes sanguins chez l'homme sont hérités indépendamment des molécules du CMH. Par conséquent, même si le donneur et le receveur sont compatibles avec les principaux antigènes HLA, leurs érythrocytes peuvent avoir un phénotype différent. Allouer « large » incompatibilité lorsque préexistent dans l'anticorps receveur aux antigènes de cellules sanguines rouges du donneur, et « petit », lorsque les anticorps donneurs à des antigènes de cellules sanguines rouges du receveur. Il y a des cas d'une combinaison de "grandes" et de "petites" incompatibilités.

Les résultats de l'analyse comparative de l'efficacité clinique de la moelle osseuse et les cellules souches hématopoïétiques de allogreffes de sang ombilical dans des tumeurs malignes hématologiques indiquent que les enfants allotransplantation GSK sang de cordon « greffon contre l'hôte » réduit significativement le risque de réaction, mais il y a une plus longue période de récupération de neutrophiles et de plaquettes une fréquence plus élevée d'une mortalité post-transplantation de 100 jours.

L'étude des causes de létalité précoce a permis de clarifier les contre-indications à la greffe allogénique de GSK, parmi lesquelles les plus importantes sont:

• présence chez le receveur ou le donneur de tests positifs pour l'infection par le cytomégalovirus (sans traitement préventif);
• maladie aiguë des rayonnements;
• présence ou même suspicion de la présence d'une infection mycotique chez le patient (sans prophylaxie précoce systémique avec des médicaments fongicides);
• les hémoblastoses, dans lesquelles les patients ont reçu un traitement prolongé par des cytostatiques (en raison de la forte probabilité d'un arrêt cardiaque soudain et d'une défaillance multiviscérale);
• la transplantation à partir de donneurs HLA non identiques (sans prévention de la réaction «transplantation contre hôte» aiguë par la cyclosporine A);
• l'hépatite virale C chronique (en raison d'un risque élevé de développer une maladie veino-occlusive du foie).

Ainsi, la transplantation GSK peut entraîner des complications graves, qui conduisent souvent à la mort. Au début des années (jusqu'à 100 jours après la greffe) période agit notamment les complications infectieuses, la réaction aiguë « greffon contre l'hôte », le rejet de greffe (neprizhivlenie donneur HSC), venookklyuzionnaya maladie du foie, ainsi que du fait de la toxicité du régime de conditionnement, des dommages aux tissus, pour lesquels la caractéristique élevée la vitesse de remodelage (peau, endothélium vasculaire, épithélium intestinal). Les complications de la fin de la période post-transplantation comprennent la réaction chronique de récidive « du greffon contre l'hôte » de la maladie sous-jacente, un retard de croissance chez les enfants, la fonction reproductrice et les maladies des yeux de la thyroïde.

Récemment, en liaison avec l'apparition de publications sur la plasticité des cellules de la moelle osseuse, l'idée d'utiliser GSK pour le traitement des crises cardiaques et d'autres maladies a été soulevée. Bien que certaines expériences sur des animaux soutiennent également cette possibilité, les conclusions sur la plasticité des cellules de la moelle osseuse doivent être confirmées. Ce fait doit être pris en compte par les chercheurs qui croient que les cellules de moelle osseuse humaine transplantées sont facilement transformés en cellules musculaires squelettiques, du myocarde ou du système nerveux central. L'hypothèse que les GSK sont une source cellulaire naturelle de régénération de ces organes nécessite des preuves sérieuses.

En particulier, a publié les premiers résultats d'un essai randomisé ouvert Belenkova V. (2003), dont le but - d'étudier l'effet du C-SIS (à savoir, la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques de sang autologue) sur clinique, l'état hémodynamique et neurohumorale des patients atteints de modérée à une insuffisance cardiaque chronique sévère, ainsi qu'une évaluation de son innocuité par rapport au traitement standard (inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine, bêta-bloquants, diurétiques, glycosides cardiaques). La première publication des résultats des auteurs du programme de recherche noter que le seul argument en faveur de la O-CBP sont les résultats du traitement d'un patient qui pendant le traitement par ce médicament ont trouvé une amélioration incontestable de tous les paramètres cliniques et hémodynamiques. Cependant, la théorie de la mobilisation CSHs dans la circulation sanguine suivie par la régénération du myocarde dans la zone post-infarctus n'a pas été confirmée - même chez les patients ayant une dynamique clinique positifs de échocardiographie dobutamine n'a pas révélé l'émergence de myocarde viable dans les zones cicatricielles du champ.

Il convient de noter que, à l'heure actuelle, les données qui permettent de recommander une thérapie cellulaire substitutive pour une introduction généralisée dans la pratique clinique quotidienne ne sont manifestement pas suffisantes. Une performance bien conçu et qualitative des études cliniques pour déterminer l'efficacité des différentes options de thérapie cellulaire de régénération, le développement des indications et contre-indications à elle, ainsi que des lignes directrices sur l'utilisation combinée de la thérapie régénérative et en plastique et un traitement conventionnel chirurgical ou conservateur. Jusqu'à présent, aucune réponse à la question de savoir quel genre d'une population de cellules de moelle osseuse (souches hématopoïétique ou stromales) peut donner lieu à des neurones et des cardiomyocytes, et ne sait pas quelles conditions contribuent à cette in vivo.

Des travaux dans ces domaines sont menés dans de nombreux pays. Dans le résumé du symposium sur l'insuffisance hépatique aiguë les instituts nationaux des États-Unis parmi les méthodes prometteuses de traitement de la santé, ainsi que la transplantation du foie, une greffe marquée au xénon ou allogéniques hépatocytes et connexion à bioréacteurs in vitro avec les cellules du foie. Il existe des preuves directes que seuls les hépatocytes actifs à l'étranger peuvent fournir un soutien efficace au foie du receveur. Pour l'utilisation clinique des hépatocytes isolés, il est nécessaire de créer une banque de cellules, ce qui permettra de réduire considérablement le temps entre la libération des cellules et leur utilisation. Le plus acceptable pour créer une banque d'hépatocytes isolés est la cryoconservation des cellules hépatiques dans l'azote liquide. Lors de l'utilisation de telles cellules dans la clinique chez des patients atteints d'insuffisance hépatique aiguë et chronique, un effet thérapeutique plutôt élevé a été révélé.

Malgré les résultats optimistes et encourageants de la transplantation de cellules du foie dans l'expérience et la clinique, il y a encore de nombreux problèmes sont encore loin d'être résolu. Ceux-ci comprennent le nombre limité d'organismes appropriés pour obtenir des hépatocytes isolés méthodes insuffisamment efficaces de séparation, l'absence de méthodes normalisées de préserver les cellules du foie compréhension floue des mécanismes de régulation de la croissance et la prolifération des cellules transplantées, l'absence d'évaluation ou le rejet des méthodes adéquates prise de greffe de hépatocytes allogéniques. Cela devrait également inclure la présence d'une immunité de transplantation en utilisant des cellules allogéniques ou xénogéniques, bien que moindre que dans la transplantation orthotopique du foie, mais nécessitant l'application d'agents immunodépresseurs, l'encapsulation des hépatocytes isolés ou des enzymes de traitement spéciales. La transplantation d'hépatocytes conduit souvent à un conflit entre immunitaire receveur et le donneur dans une réaction de rejet, ce qui nécessite l'utilisation de cytostatiques. Une solution à ce problème est d'utiliser un support microporeux polymère pour isoler les cellules du foie, ce qui améliorera leur survie, car la membrane de la capsule protège efficacement les hépatocytes, en dépit de l'immunisation hôte.

Cependant, dans la transplantation hépatocytaire insuffisance hépatique aiguë telle n'a pas d'effet en raison du temps assez long nécessaire à la prise de greffe de cellules du foie dans le nouvel environnement avec l'accès à un pas un fonctionnement optimal. Une limitation potentielle est la sécrétion ectopique de transplantation biliaire des hépatocytes isolés, et l'utilisation de la barrière physiologique essentielle bioréacteurs agit différence d'espèce entre les protéines humaines et des protéines qui produisent des hépatocytes xénogéniques.

Il y a des rapports dans la littérature que la transplantation locale de cellules souches stromales de moelle osseuse contribue à la correction efficace des défauts osseux, avec la restauration du tissu osseux dans ce cas se produisant plus intensément qu'avec la régénération réparatrice spontanée. Dans plusieurs études précliniques dans des modèles animaux ont démontré de façon convaincante la possibilité d'utiliser des greffes de cellules stromales de la moelle osseuse en orthopédie, bien que pour optimiser ces méthodes, même dans les cas les plus simples, des travaux supplémentaires sont nécessaires. En particulier, les conditions optimales pour l'expansion des cellules stromales ostéogéniques ex vivo n'ont pas encore été trouvées, la structure et la composition de leur porteur idéal (matrice) restent non travaillées. Le nombre minimum de cellules requis pour la régénération osseuse en masse n'est pas déterminé.

Il est prouvé que les cellules souches mésenchymateuses présentent une plasticité transgermique - la capacité à se différencier en types cellulaires qui sont phénotypiquement sans rapport avec les cellules de la lignée originale. Dans des conditions optimales de culture de lignée de cellules souches polyclonal de cellules stromales de moelle osseuse maintenues in vitro pendant plus de 50 divisions, ce qui permet de recevoir les milliards de cellules stromales à partir de 1 ml d'aspirat de moelle osseuse. Cependant, la population de cellules souches mésenchymateuses, caractérisé par l'hétérogénéité, ce qui se manifeste par la variabilité de la taille des colonies, des vitesses de formation et de la diversité morphologique des types de cellules - broche en forme de fibroblaste de type à grandes cellules plates. Dans les 3 semaines de culture de cellules souches stromales observées hétérogénéité phénotypique: une colonie formant des nodules de tissu osseux, tandis que d'autres - groupes de adipocytes, et d'autres, plus rares, formant des îles du cartilage.

Pour le traitement des maladies dégénératives du système nerveux central, la transplantation de tissu nerveux embryonnaire a d'abord été utilisée. Au cours des dernières années, à la place du tissu du cerveau embryonnaire, les éléments cellulaires des neurosphères dérivées des cellules souches neurales ont été transplantés (Poltavtseva, 2001). Les neurosphères contiennent des précurseurs neuraux et des neuroglies, ce qui donne l'espoir de restaurer les fonctions cérébrales perdues après leur transplantation. Après la transplantation de cellules de neurosphères corps rat striatal du cerveau dispersé marqué leur prolifération et leur différenciation en neurones dopaminergiques, ce qui élimine l'asymétrie du moteur chez le rat avec gemiparkinsonizmom expérimentale. Cependant, dans certains cas, des cellules tumorales se sont développées à partir des cellules de la neurosphère, ce qui a entraîné la mort d'animaux (Bjorklund, 2002).

La clinique étude minutieuse des deux groupes de patients où ni les patients ni les médecins ne savaient les regarder (en double aveugle), qu'un groupe de patients transplantés tissus embryonnaires avec des neurones qui produisent la dopamine, un second groupe de patients a fait un faux pas, a donné des résultats inattendus . Les patients qui ont été transplantés du tissu neural embryonnaire, se sentaient pas mieux que les patients du groupe témoin. En outre, 5 patients sur 33 après 2 ans après la transplantation de tissu neural embryonnaire développé une dyskinésie persistante, qui n'a pas de patients de contrôle du groupe (cellules souches: progrès scientifiques et les orientations futures de la recherche Nat Inst, de la Santé Etats-Unis ...). L'un des problèmes non résolus des études cliniques de cellules souches neurales du cerveau est l'analyse des perspectives réelles et les limites de leurs dérivés transplantation pour la correction des troubles du système nerveux central. Il est possible que l'activité épileptique prolongée induite neyronogenez dans l'hippocampe, ce qui conduit à ses changements structurels et fonctionnels peuvent être un facteur dans le développement progressif de l'épilepsie. Cette conclusion est particulièrement remarquable, car elle souligne les effets négatifs possibles de la génération de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, et la formation de connexions synaptiques aberrantes.

Il ne faut pas oublier que dans les médias de culture avec des cytokines (mitogènes) se rapproche des caractéristiques des cellules souches à celle des cellules tumorales, car ils se produisent près de changements dans la régulation des cycles cellulaires, la détermination de la capacité de se diviser indéfiniment. Il est stupide de transplanter chez l'homme des dérivés précoces de cellules souches embryonnaires, puisque dans ce cas la menace de développement de néoplasmes malins est très grande. Il est beaucoup plus sûr d'utiliser leur progéniture plus engagée, c'est-à-dire des cellules précurseurs de lignées différenciées. Cependant, à l'heure actuelle, une technique fiable permettant d'obtenir des lignées cellulaires humaines stables qui se différencient dans la bonne direction n'a pas encore été mise au point.

L'utilisation des technologies de la biologie moléculaire pour la correction de la pathologie héréditaire et des maladies humaines à l'aide de la modification des cellules souches est d'un grand intérêt pour la médecine pratique. Les caractéristiques du génome des cellules souches permettent le développement de schémas de transplantation uniques dans le but de corriger les maladies génétiques. Mais dans ce sens, il y a aussi un certain nombre de limites qui doivent être surmontées avant que l'application pratique du génie génétique des cellules souches ne commence. Tout d'abord, il est nécessaire d'optimiser le processus de modification du génome des cellules souches ex vivo. Il est connu qu'une prolifération prolongée (3-4 semaines) de cellules souches réduit leur transfection, de sorte que plusieurs cycles de transfection sont nécessaires pour atteindre un niveau élevé de modification génétique. Cependant, le problème principal est lié à la durée d'expression du gène thérapeutique. Jusqu'à présent, dans aucune des études, la période d'expression effective après la transplantation des cellules modifiées ne dépassait pas quatre mois. Dans 100% des cas au cours du temps, l'expression des gènes transfectés est réduite en raison de l'inactivation des promoteurs et / ou de la mort des cellules avec un génome modifié.

Un problème important est le coût de l'utilisation des technologies cellulaires en médecine. Par exemple, le besoin de financement annuel estimé pour les dépenses médicales d'un service de greffe de moelle osseuse, conçu pour effectuer 50 transplantations par année, est d'environ 900 000 $.

Le développement des technologies cellulaires en médecine clinique est un processus complexe et en plusieurs étapes impliquant une coopération constructive de centres scientifiques et cliniques multidisciplinaires et de la communauté internationale. Dans le même temps, une attention particulière est accordée à l'organisation scientifique de la recherche dans le domaine de la thérapie cellulaire. Les plus importants sont le développement de protocoles pour les essais cliniques, le contrôle de la validité des données cliniques, la constitution d'un registre national de recherche, l'intégration dans les programmes internationaux d'essais cliniques multicentriques et l'introduction des résultats dans la pratique clinique.

Conclusion de l'introduction aux problèmes de transplantation cellulaire, je voudrais exprimer l'espoir que les efforts conjoints des plus grands experts de l'Ukraine de différents domaines de la science assureront des progrès significatifs dans les études expérimentales et cliniques et permettront dans les années à venir de trouver des moyens efficaces pour aider les personnes gravement malades dans le besoin de transplantations d'organes , tissus et cellules.

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