Diagnostic de l'herpès

Le diagnostic de l'herpès repose sur l'isolement classique du virus sur des cultures cellulaires sensibles, l'immunofluorescence et les méthodes sérologiques, l'examen colposcopique et l'utilisation de méthodes de biologie moléculaire modernes (PCR, hybridation en points), qui permettent de diagnostiquer l'ensemble du groupe des virus de l'herpès, y compris les types HHV-6 et HHV-7.

Méthodes de diagnostic en laboratoire pour l'infection herpétique

Les principales méthodes visant à isoler le HSV ou à détecter des particules virales et/ou leurs composants	Méthodes auxiliaires visant à détecter les anticorps anti-HSV dans les fluides biologiques du corps humain
Isolement du HSV dans des cultures cellulaires et animales sensibles Microscopie électronique directe et immunitaire Variantes directes et indirectes de l'IPA IFA Méthodes de biologie moléculaire Réaction d'agglutination au latex	Réaction de neutralisation RSC Détermination des anticorps dirigés contre les protéines non structurales du HSV-1,2

Il a été démontré que l'herpès génital (HG) est causé par le HSV-2 chez 76 % des patients et par le HSV-1 chez 24 %. De plus, l'HG sous forme de monoinfection n'est apparue que chez 22 % des patients; des associations microbiennes ont été détectées dans 78 % des cas. Une parasitocénose due à deux agents pathogènes a été détectée chez 46 % des individus, dont 40 % à Chlamydia. Gardnerella, Trichomonas et gonocoques ont été moins fréquemment détectés dans les frottis.

Chez 27 % des patients, la parasitocénose était due à trois agents pathogènes, contre quatre chez 5,2 %. De plus, une association de chlamydia avec des champignons Gardnerella et Candida était le plus souvent observée. Ces données justifient la nécessité d'un examen bactériologique approfondi des patients atteints d'hypertrophie de la glande surrénale afin d'identifier les associations d'agents pathogènes, ainsi que d'une étude approfondie de la pathogénèse des infections mixtes de l'appareil urogénital, ce qui permettra un traitement complexe et différencié de l'infection herpétique.

Matériels étudiés pour l'isolement du HSV en fonction de la localisation des lésions herpétiques

Localisation des lésions	Contenu des vésicules	Grattage cellulaire				LCR	Aspirat bronchique	Biopsie	Sang
		1	2	3	4
Cuir	+								+
Yeux			+						+
Organes génitaux				+					+
Anus	+				+				+
Bouche	+	+							+
SNC	+					+		+	+
Poumons		+					+		+
Foie								+	+
Herpès congénital	+	+	+				+		+

Méthodes de diagnostic en laboratoire de l'infection à cytomégalovirus

Méthodes	Temps nécessaire pour obtenir des résultats	Remarques
VIROLOGIQUE
Microscopie électronique	3 heures	Pas très accessible
Isolement de virus en culture cellulaire (VCI)	4 à 20 jours	Standard, lent
Coloration par immunofluorescence des AG précoces à l'aide d'anticorps monoclonaux	6 heures	Moins spécifique
CYTOLOGIQUE	2-3 heures	Moins spécifique
SÉROLOGIQUE
RSC	2 jours	Standard
RGA	1 jour	Travail intensif
RÉCIF	6 heures	Simple, spécifique
NRIF	6 heures	Difficile
RIMP	6 heures	Difficile
ELISA (IgM, DO)	6 heures	Rapide, simple
Immunoblot	6 heures	Cher
BIOLOGIQUE MOLÉCULAIRE
MG	5 à 7 jours	Coûteux et exigeant en main-d'œuvre
PCR	3 heures	Cher

Méthodes de diagnostic du virus du zona

Méthodes de diagnostic	Techniques de laboratoire
INDIRECT
Sélection	Culture de tissus, embryons de poulet, animaux de laboratoire, co-culture avec des cellules permissives ou des virus auxiliaires
Identification des isolats	Réaction de neutralisation, RSC, IF, PIEF, réaction de précipitation des isolats, agglutination, IF
DIRECT
Cytologie	Frottis: immunofluorescence colorée
Histologie	Pathomorphologie de la cellule
Structure	Microscopie embryonnaire, microscopie immunoélectronique
Détermination des antigènes	SI, PIEF, RIM, IFA
Détermination de la production locale d'anticorps	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Approches de biologie moléculaire	Hybridation moléculaire, PCR

Diagnostic en laboratoire de l'infection causée par le virus du zona

Problèmes de diagnostic	Méthodes	Résultats attendus
Infection primaire aiguë	1	Détection en 2 heures
	2	Les niveaux d'anticorps augmentent lentement
	3	Présent 3 jours après l'infection
Infection aiguë réactivée	1	Détection de UUU après 2 heures
	2	Les niveaux d'anticorps augmentent lentement
	4	Présent 4 jours après l'apparition de l'éruption cutanée

1. détermination des vésicules du VEGF dans le liquide;
2. sérologie: CSC, ELISA, visant la détection
3. sérologie: ELISA visant à détecter les IgM;
4. sérologie: ELISA visant à détecter les IgA, IgM.

Méthodes permettant d'indiquer la réponse immunitaire à l'infection par le virus du zona

Approche	Méthode
Détection d'une augmentation du titre d'anticorps dans le deuxième sérum	RSK, RTGA, RPGA, réaction de neutralisation IF, RIM, ELISA
Détection d'anticorps spécifiques de classe Ig G et Ig A dans le premier échantillon de sérum	ELISA, IF, RIM, agglutination au latex

Interprétation des résultats de l'examen sérologique des sérums de patients pour les infections à herpèsvirus (ELISA)

Nom de l'infection/marqueur	Valeurs seuils moyennes pour les infections
	Résultats de l'analyse	Interprétation
Cytomégalie IgG anti-CMV (1-20 U/ml) IgM anti-CMV (100-300%)	Positif 1-6 Positif 6-10 Positif >10 Négatif Positif 100-300 Négatif <90 Douteux 90-100	Rémission Exacerbation de la maladie Phase aiguë de la maladie Pas d'infection (maladie) Phase aiguë de la maladie Répéter l'analyse dans 2 à 3 semaines
Herpès simplex 1,2 sérotypes Anti-HSV 1/2 total (100-900%)	Positif 100-400 Positif 400-800 Positif >800 Négatif <100	Rémission Exacerbation de la maladie Phase aiguë de la maladie Pas d'infection (maladie)

Le tableau présente les principales méthodes de diagnostic en laboratoire des infections à herpèsvirus, ainsi que les matériaux biologiques recommandés qui sont examinés lors de l'isolement du HSV, en tenant compte de la localisation des lésions herpétiques.

Isolement fiable des virus herpès simplex et CMV par infection de cultures cellulaires sensibles. Ainsi, lors de l'examen virologique de 26 patients en période de rechute, le HSV a été isolé sur une culture de cellules Vero sensibles dans 23 cas (88,4 %). Les cultures infectées présentaient un tableau d'action cytopathique typique du HSV: formation de cellules géantes multinucléées ou accumulation de cellules arrondies et élargies en amas. Dans 52,1 % des cas, des foyers d'action cytopathique du virus ont pu être détectés dès 16 à 24 heures après l'infection. Après 48 à 72 heures d'incubation des cultures infectées, le pourcentage de matériels provoquant une destruction spécifique des cellules atteignait 87 %. Et seulement 13 % des cas ont été positifs 96 heures ou plus après l'infection ou lors de passages répétés.

Méthodes de diagnostic en laboratoire de l'infection herpétique généralisée

Les principales méthodes visant à détecter (isoler) les virus de l'herpès, leurs particules et leurs composants

Méthodes auxiliaires visant à détecter les anticorps dirigés contre les virus de l'herpès dans les fluides biologiques, à détecter les changements enzymatiques dans le sérum sanguin

Isolement des virus de l'herpès sur des cultures cellulaires et animales sensibles Microscopie électronique directe et immunitaire Variantes directes et indirectes de la méthode d'immunoperoxydase Variantes directes et indirectes de la méthode des anticorps fluorescents Variantes du dosage immunoenzymatique en phase solide Variantes de la méthode d'hybridation moléculaire (ADN-ADN) Réaction en chaîne par polymérase Réaction d'agglutination au latex

Test de neutralisation Test de fixation du complément Test d'agglutination au latex Version indirecte de la méthode des anticorps fluorescents Version indirecte de la méthode de l'immunoperoxydase Variantes du dosage immunoenzymatique en phase solide Méthode d'immunotransfert Méthode de fixation radiale du complément Détermination des taux d'alanine et d'aspartate aminotransférase

Les méthodes sérologiques sont utilisées pour diagnostiquer la mononucléose infectieuse (infection causée par le virus EBV). La réaction de Paul-Bunnell avec des globules rouges de bélier, un titre diagnostique de 1:28 ou plus lors d'un seul test sérique, ou une multiplication par quatre des anticorps lors de l'examen de sérums appariés, est utilisée. La réaction de Hoff-Bauer avec une suspension à 4 % de globules rouges de cheval formalisés est utilisée. Le résultat est pris en compte après 2 minutes; dans la mononucléose infectieuse, la réaction est très spécifique.

Actuellement, une méthode de dosage immunoenzymatique (EIA) pour le diagnostic de la mononucléose infectieuse est en cours de développement. Dans ce cas, les anticorps IgG et IgM présents dans le sérum du patient sont dosés par incubation avec des lymphoblastes infectés par le virus EBV, puis traités par des anticorps fluorescents. En phase aiguë de la maladie, les anticorps dirigés contre l'antigène de la capside virale sont dosés à un titre de 1:160 et plus.

Grâce à l'utilisation de plusieurs systèmes de test commerciaux importés, le test ELISA permet de détecter: les anticorps dirigés contre l'enveloppe du virus EBV, les anticorps dirigés contre l'antigène précoce du virus EBV, les anticorps totaux dirigés contre l'antigène précoce du virus EBV, déterminés en phase aiguë de la maladie, tant dans le noyau que dans le cytoplasme cellulaire, les anticorps limités dirigés contre l'antigène précoce du virus EBV, déterminés au plus fort de la maladie, uniquement dans le cytoplasme cellulaire, et les anticorps dirigés contre l'antigène nucléaire du virus EBV. L'utilisation de ces systèmes de test permet le diagnostic différentiel de nombreuses maladies associées au virus EBV.

Après un test ELISA positif qui révèle des anticorps contre l'EBV, une réaction d'immunoblotting de confirmation est réalisée, qui détermine la présence d'anticorps contre les protéines marqueurs individuelles de l'EBV (protéines p): p23, p54, p72 (la présence de cette protéine indique la possibilité de reproduction de l'EBV), p 138. Les méthodes de laboratoire ci-dessus sont également utilisées pour surveiller l'efficacité du traitement.

La sensibilité des méthodes virologiques est de 85 à 100 %, leur spécificité de 100 %, et la durée de l'étude est de 2 à 5 jours. La méthode d'immunofluorescence directe (IFD) avec des anticorps polyclonaux ou monoclonaux contre les HSV-1 et HSV-2 est souvent utilisée en pratique. La méthode IFD est facilement reproductible en laboratoire clinique classique, peu coûteuse, sa sensibilité est supérieure à 80 %, sa spécificité est de 90 à 95 %. La microscopie par immunofluorescence a révélé la présence d'inclusions cytoplasmiques, les caractéristiques morphologiques et le pourcentage de cellules infectées dans les frottis-grattages de l'urètre, du canal cervical, du col de l'utérus et du rectum.

La méthode PIF permet d'évaluer les propriétés morphologiques des cellules et les modifications de la localisation des antigènes du VHS. Outre les signes directs de lésions cellulaires causées par les virus de l'herpès (détection d'une luminescence spécifique), les données PIF révèlent des signes indirects d'infection herpétique:

• agrégation de matière nucléaire, détachement du caryolemme;
• la présence de noyaux dits « trous », lorsqu’il ne reste qu’un seul caryolemme du noyau cellulaire;
• la présence d'inclusions intranucléaires - corps de Cowdry.

Lors de la réalisation d'un test d'immunofluorescence (PIF), le médecin reçoit une évaluation qualitative et quantitative de l'état des cellules infectées, que nous avons utilisée pour évaluer l'efficacité du traitement antiviral par acyclovir (AC). Ainsi, 80 patients atteints d'herpès génital simple (GH) ont été examinés selon la méthode PIF en dynamique. Il a été démontré que si, avant le traitement par acyclovir, 88 % des patients présentaient un pourcentage élevé de cellules infectées (50 à 75 % et plus) dans les frottis, après un traitement par acyclovir, des cellules saines ont été détectées dans les frottis de 44 % des patients, dans 31 % des cas, des cellules infectées isolées ont été observées et chez 25 % des patients, jusqu'à 10 % de cellules infectées.

Teneur en cellules infectées dans les frottis (réaction PIF) de patients atteints d'herpès génital traités par acyclovir

Périodes de maladie	Pourcentage de teneur dans les frottis
	Cellules infectées					Cellules normales
	Plus de 75%	50-75%	40-50%	10%	Cellules individuelles dans le champ de vision
Rechute (avant traitement)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Rémission (après traitement)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

L'utilisation du PIF et de la méthode d'hybridation en points depuis de nombreuses années a permis de constater une concordance des résultats dans presque 100 % des cas. Il est important de noter que pour accroître la fiabilité du diagnostic de l'herpès, notamment dans les formes subcliniques et peu manifestes, il est recommandé d'utiliser deux ou trois méthodes de diagnostic en laboratoire, notamment lors de l'examen des femmes enceintes, des femmes ayant des antécédents obstétricaux défavorables et des personnes dont le diagnostic gynécologique n'est pas précisé.

Ainsi, lors du diagnostic par PCR des infections virales et bactériennes de l'appareil urogénital, il est nécessaire d'évaluer les résultats positifs obtenus en tenant compte de l'anamnèse et de la présence (ou de l'absence) de symptômes cliniques spécifiques de la maladie. Si la détection de chlamydia par PCR est avérée, la probabilité d'infection est élevée et le traitement peut être adapté en conséquence. En cas de détection de mycoplasmes (ureaplasmas), micro-organismes opportunistes, des cultures complémentaires sont nécessaires pour confirmer le diagnostic, à savoir l'ensemencement de matériel du patient sur des cultures cellulaires sensibles. Ce n'est qu'en cas de résultats positifs à l'analyse de culture que l'on peut parler de confirmation en laboratoire du diagnostic de mycoplasmose. La même méthode permettra, si nécessaire, de déterminer la sensibilité des mycoplasmes isolés aux formes galéniques fréquemment utilisées (antibiotiques, fluoroquinolones, etc.).

Une infection simultanée par plusieurs virus de la famille des Herpesviridae est possible. Nous avons souvent détecté une infection chez un même patient par les virus HSV-1, HSV-2 et CMV. Les patients présentant des manifestations cliniques et biologiques de syndrome de détresse respiratoire aiguë secondaire (patients oncohématologiques, oncologiques, infectés par le VIH) étaient significativement plus souvent infectés par plusieurs herpèsvirus. Ainsi, il a été démontré que les troubles cliniques et immunologiques évoluant dans l'infection par le VIH s'accompagnent d'une augmentation du nombre d'herpèsvirus détectés par la méthode d'hybridation moléculaire. Dans ce cas, la détection simultanée complexe d'ADN de type HSV-1, CMV et HHV-6 peut être considérée comme le facteur pronostique le plus significatif.

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