Cellules souches hématopoïétiques du sang du cordon ombilical

Le sang de cordon ombilical est une bonne source de cellules souches hématopoïétiques en termes de potentiel prolifératif et de capacités de repeuplement. Il a été démontré à maintes reprises qu'à la naissance, le sang de cordon ombilical contient un nombre suffisamment important de cellules progénitrices hématopoïétiques faiblement impliquées. Certains auteurs estiment que l'avantage de la greffe de cellules souches hématopoïétiques de cordon réside dans l'absence de recherche d'un donneur compatible avec les antigènes HLA. Selon eux, l'immaturité du système immunitaire du nouveau-né entraîne une réduction de l'activité fonctionnelle des cellules immunocompétentes et, par conséquent, une incidence plus faible de maladie du greffon contre l'hôte sévère qu'avec une greffe de moelle osseuse. Parallèlement, le taux de survie d'une greffe de cellules de cordon ombilical n'est pas inférieur à celui des cellules de moelle osseuse, même en cas d'utilisation d'un nombre inférieur de cellules souches hématopoïétiques administrées par kg de poids corporel du patient. Toutefois, à notre avis, les questions relatives au nombre optimal de cellules de sang de cordon transplantées nécessaires à une greffe efficace dans le corps du receveur, à leur compatibilité immunologique et à un certain nombre d'autres aspects du problème de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon nécessitent une analyse plus sérieuse.

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Obtention de cellules souches hématopoïétiques à partir du sang du cordon ombilical

La procédure d'obtention de cellules souches hématopoïétiques à partir du sang du cordon ombilical nécessite leur prélèvement immédiatement après la naissance de l'enfant et leur séparation du placenta, que celui-ci soit in utero ou ex utero, ainsi que lors d'une césarienne, mais aussi ex utero. Il a été démontré qu'en réduisant le délai entre la naissance et la séparation du nouveau-né du placenta à 30 secondes, le volume de sang du cordon ombilical obtenu augmente en moyenne de 25 à 40 ml. Si cette procédure est réalisée ultérieurement, la même quantité de sang est perdue. Il a été établi qu'une séparation précoce du placenta n'entraîne aucune conséquence négative pour le nouveau-né.

L'Institut russe de recherche en hématologie et transfusiologie a développé des technologies efficaces et peu coûteuses pour l'obtention de sang de cordon ombilical, aussi bien lors d'un accouchement normal ((70,2 + 25,8) ml) que lors d'une césarienne ((73,4 + 25,1) ml). Une méthode de séparation du sang de cordon ombilical avec un rendement suffisamment élevé en cellules nucléées et mononucléées a été proposée: (83,1 + 9,6) et (83,4 + 14,1) %, respectivement. Une méthode de cryoconservation du sang de cordon ombilical a été améliorée, garantissant une conservation élevée des cellules mononucléées et des CFU-GM ((96,8 + 5,7) et (89,6 + 22,6) %, respectivement. L'efficacité de la méthode de drainage pour la collecte du sang de cordon ombilical à l'aide du récipient Kompoplast-300 (Russie) a été démontrée. Français Les auteurs ont collecté du sang de cordon ombilical immédiatement après la naissance de l'enfant et sa séparation du placenta, dans des conditions de placement du placenta in utero ou ex utero. Avant la ponction de la veine ombilicale, le cordon ombilical a été traité une fois avec de la teinture d'iode à 5 %, puis deux fois avec de l'alcool éthylique à 70 %. Le sang s'est écoulé spontanément par les tubes de raccordement dans le récipient. La procédure de collecte n'a pas pris plus de 10 minutes. Le volume moyen de 66 échantillons de sang de cordon collectés par drainage était de (72 + 28) ml, et le nombre de leucocytes dans le volume total moyen de l'échantillon était de (1,1 + 0,6) x 107. Lors de l'analyse du sang de cordon pour la stérilité (contamination bactérienne, VIH-1, virus de l'hépatite B et C, syphilis et infection à cytomégalovirus), les anticorps IgG contre le virus de l'hépatite C n'ont été détectés que dans un seul échantillon. Français Dans une autre étude, le placenta a été placé face fœtale vers le bas sur un cadre spécial immédiatement après la naissance, le cordon ombilical a été traité avec une solution d'iode à 5 % et de l'alcool éthylique à 75 %. La veine ombilicale a été drainée à l'aide d'une aiguille d'un système de transfusion (G16). Le sang s'est écoulé spontanément dans le récipient. Le volume moyen de sang collecté de cette manière était de (55 + 25) ml. Dans les travaux de G. Kogler et al. (1996), le sang de cordon ombilical a été collecté par une méthode fermée et de grands volumes de sang ont été obtenus – en moyenne (79 + 26) ml. Les auteurs notent que parmi 574 échantillons de sang de cordon ombilical, environ 7 % contenaient moins de 40 ml de sang, ce qui ne permet pas leur utilisation pour une transplantation. K. Isoyama et al. (1996), en collectant du sang de cordon par exfusion active à l'aide de seringues, ont obtenu en moyenne 69,1 ml de sang (le volume de sang de cordon ombilical variait de 15 à 135 ml). Finalement, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) ont réussi à obtenir en moyenne 94 ml de sang de cordon ombilical (de 56 à 143 ml) par cathétérisme de la veine ombilicale.

Afin de réduire le risque d'infection iatrogène et de contamination par les sécrétions maternelles, un système de prélèvement sanguin fermé a été développé, basé sur le système de transfusion largement utilisé de Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois (États-Unis). Ce système contient 62,5 ml de CPDA (citrate-phosphate-dextrose avec adénine) comme anticoagulant. La technologie d'obtention du matériel est primordiale pour préparer un échantillon de haute qualité en termes de volume, de contenu et de pureté de la suspension cellulaire. Parmi les méthodes existantes de prélèvement du sang de cordon ombilical, classiquement classées en systèmes fermés, semi-ouverts et ouverts, la première méthode est à privilégier, car elle réduit considérablement le risque de contamination microbienne du matériel et de contamination de la suspension cellulaire par des cellules maternelles.

A. Nagler et al. (1998) ont mené une analyse comparative de l'efficacité des trois systèmes de prélèvement de sang de cordon ombilical. Dans la première variante, la procédure a été réalisée en système fermé par exfoliation du sang directement dans un récipient. Dans la deuxième variante, le sang de cordon a été obtenu par exfusion active de sang avec une seringue MP1, suivie d'un rinçage des veines placentaires et d'un drainage simultané du sang dans un récipient (méthode ouverte). Dans la troisième variante, le sang a été collecté dans un système semi-ouvert par extraction active avec des seringues et rinçage par l'artère ombilicale avec exfusion simultanée dans un récipient. Dans la première variante, les auteurs ont obtenu du sang de cordon ombilical dans un volume de (76,4 + 32,1) ml avec une teneur en leucocytes de (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ dans 1 ml de sang. Dans la deuxième variante, les indicateurs correspondants étaient (174,4 + 42,8) ml et (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ /ml; dans le troisième - (173,7+41,3) ml et (9,3+3,8) x 10 ⁶ /ml. L'infection la plus fréquente des échantillons de sang de cordon ombilical a été observée lors de l'utilisation d'un système ouvert. Une corrélation directe a été établie entre la masse du placenta et le volume de sang prélevé: plus la masse du placenta augmente, plus la quantité de sang prélevée augmente.

Après le prélèvement du sang de cordon, l'étape de séparation suit: l'isolement des cellules mononucléées et la purification de la suspension cellulaire à partir des érythrocytes. En conditions expérimentales, les cellules nucléées sont isolées par sédimentation à la méthylcellulose lors de la lyse des érythrocytes au chlorure d'ammonium. Cependant, la méthylcellulose ne doit pas être utilisée à des fins cliniques, car les pertes de cellules souches hématopoïétiques qu'elle contient atteignent 50 à 90 %. La lyse des érythrocytes est également rarement réalisée en clinique en raison des volumes importants de la solution de travail, bien que le pourcentage d'isolement de cellules nucléées présentant le phénotype CD34+, ainsi que de cellules progénitrices présentant les fonctions CFU-GM et CFU-GEMM, soit significativement plus élevé. L'émergence d'une nouvelle méthode d'isolement des cellules mononucléées en gradient de densité, la solution de densité Buyant (BDS72), est rapportée. Cette substance présente les paramètres physiologiques suivants: pH – 7,4, osmolalité – 280 mOsm/kg, densité – 1,0720 g/ml. Selon les auteurs, elle permet d'isoler jusqu'à 100 % des cellules CD34-positives et d'éliminer 98 % des érythrocytes. Cependant, le BDS72 n'est pas encore utilisé en clinique.

Dans les méthodes approuvées d'isolement des cellules nucléées du sang de cordon ombilical, on utilise généralement une solution d'hydroxyéthylamidon à 10 % ou une solution de gélatine à 3 %. L'efficacité de la sédimentation des érythrocytes et de l'isolement des cellules nucléées est approximativement équivalente dans les deux cas. Cependant, l'utilisation de la gélatine comme agent de sédimentation permet d'obtenir une quantité légèrement supérieure de CFU-GM qu'avec l'hydroxyéthylamidon. On suppose que les différences d'efficacité d'isolement des CFU-GM sont dues aux différences de vitesse de sédimentation des différentes fractions de cellules nucléées ou à la capacité des molécules d'hydroxyéthylamidon à être absorbées à la surface des récepteurs des cellules hématopoïétiques, bloquant ainsi leur sensibilité aux facteurs de stimulation des colonies utilisés pour la culture des CFU-GM in vitro. Néanmoins, les deux sédimentateurs pourraient convenir à l'isolement des cellules nucléées lors de la création de banques de sang de cordon à grande échelle.

Les méthodes de séparation et de cryoconservation du sang de cordon ombilical ne diffèrent fondamentalement pas de celles utilisées pour les cellules souches hématopoïétiques du sang périphérique et de la moelle osseuse de donneurs adultes. Cependant, lors de la préparation d'un grand nombre d'échantillons de sang de cordon ombilical destinés à des banques, les méthodes de séparation doivent avant tout être peu coûteuses. Par conséquent, pour les besoins cliniques, on utilise malheureusement actuellement des méthodes de routine déjà éprouvées d'isolement et de cryoconservation des cellules du sang de cordon, et des méthodes plus efficaces, mais coûteuses, restent l'apanage des expérimentateurs.

En général, les critères d'évaluation du nombre de cellules hématopoïétiques et les exigences relatives à l'examen des échantillons de sang de cordon pour identifier les agents infectieux ont été approuvés. Afin de garantir la sécurité de la transplantation de cellules hématopoïétiques de sang de cordon, tous les échantillons sanguins doivent être examinés en priorité pour détecter les infections transmissibles par voie hématogène et les maladies génétiques. Plusieurs auteurs recommandent des méthodes spécifiques supplémentaires d'examen du sang de cordon afin de diagnostiquer des maladies génétiques telles que l'a-thalassémie, la drépanocytose, le déficit en adénosine désaminase, l'agammaglobulinémie de Bruton, les maladies de Hurler et de Ponter.

Selon les recommandations de L. Ticheli et ses coauteurs (1998), chaque échantillon de sang de cordon doit être testé pour les cellules nucléées, les cellules CD34-positives et le CFU-GM, le typage HLA doit être effectué et le groupe sanguin doit être déterminé selon l'ABO et son facteur Rh. De plus, une culture bactériologique et des tests sérologiques pour le VIH et l'infection à cytomégalovirus, l'HBsAg, l'hépatite virale C, HTLY-I et HTLV-II (leucémie humaine à cellules T), la syphilis et la toxoplasmose doivent être effectués. La réaction en chaîne par polymérase pour l'infection à cytomégalovirus et l'infection à VIH est obligatoire.

La procédure de prélèvement de sang de cordon ombilical doit être réalisée dans le strict respect des principes de bioéthique médicale. Avant tout prélèvement, le consentement de la femme enceinte est requis. Un entretien préalable avec la femme enceinte afin d'obtenir son consentement éclairé pour toutes les manipulations, de l'exfusion sanguine à la constitution du dossier médical, est exclusivement assuré par du personnel médical. Ces procédures ne peuvent en aucun cas être réalisées par du personnel ayant suivi une formation en biologie, chimie, pharmacie ou autre formation non médicale, en raison d'une violation des normes établies de bioéthique et des droits de l'homme. En cas de test positif au portage de l'HBsAg, de présence d'anticorps dirigés contre les agents pathogènes de l'hépatite C, du VIH et de la syphilis, le sang de cordon ombilical n'est pas prélevé et les échantillons de sang déjà prélevés sont rejetés et détruits. Il convient de noter que le portage d'infections latentes chez les nouveau-nés est beaucoup moins fréquent que chez les adultes. Par conséquent, le risque de transmission hématogène et de développement de complications infectieuses lors des perfusions de cellules hématopoïétiques de sang de cordon ombilical est significativement plus faible qu'en cas de transplantation de moelle osseuse d'un donneur adulte.

Un aspect important de l'utilisation clinique du sang de cordon est l'évaluation de la transplantation, qui repose sur la détermination de la quantité de cellules souches hématopoïétiques dans un échantillon de sang de cordon et des doses de cellules nécessaires à la transplantation. À l'heure actuelle, aucune norme n'a encore été établie concernant la quantité optimale de cellules de sang de cordon requise pour la transplantation. Il n'existe pas de consensus général, même sur des paramètres de routine tels que le nombre de cellules CD34-positives et le CFU-GM. Certains auteurs évaluent le potentiel des cellules hématopoïétiques en analysant des cultures à long terme et en déterminant la teneur en unités formant colonie (CFU-GEMM) communes aux granulocytes, érythrocytes, monocytes et mégacaryocytes.

Cependant, dans un contexte clinique, l’évaluation standard d’une greffe de sang de cordon implique généralement uniquement la détermination du nombre de cellules nucléées ou mononucléaires.

Stockage des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon

La technologie de conservation des cellules hématopoïétiques issues du sang de cordon ombilical pose également certains problèmes. Lors de la cryoconservation de cellules souches hématopoïétiques, afin d'obtenir une congélation optimale, il est nécessaire de réduire au maximum le volume de sang de cordon ombilical et d'éliminer au préalable les érythrocytes afin d'éviter l'hémolyse et le risque de développer une réaction d'incompatibilité pour les antigènes érythrocytaires (ABO, Rh). Différentes méthodes d'isolement des cellules nucléées conviennent à ces fins. Au début des années 1990, la méthode la plus répandue consistait à isoler les cellules nucléées dans un gradient de densité à base de Ficoll (densité de 1,077 g/ml) ou de Percoll (densité de 1,080 g/ml). La séparation du sang du cordon ombilical dans un gradient de densité permet l'isolement de cellules majoritairement mononucléaires, mais conduit à des pertes importantes de cellules progénitrices hématopoïétiques - jusqu'à 30 à 50 %.

L'efficacité de la sédimentation de l'hydroxyéthylamidon dans le processus d'isolement des cellules hématopoïétiques du sang de cordon est évaluée différemment. Certains auteurs soulignent la faible qualité de séparation par cette méthode, tandis que d'autres, au contraire, privilégient, parmi toutes les méthodes possibles, l'isolement des CSH du sang de cordon à l'aide d'une solution d'hydroxyéthylamidon à 6 %. Parallèlement, l'efficacité élevée de la sédimentation des cellules hématopoïétiques est soulignée, atteignant, selon certaines données, entre 84 % et 90 %.

Les partisans d'un point de vue différent estiment que la quasi-totalité des méthodes de fractionnement sont associées à d'importantes pertes de cellules nucléées et proposent d'effectuer une séparation par centrifugation, divisant le sang du cordon ombilical en trois fractions: érythrocytes, anneau leucocytaire et plasma. En isolant les cellules de cette manière, les auteurs ont constaté que la teneur en cellules mononucléées, en cellules progénitrices hématopoïétiques précoces et en cellules présentant l'immunophénotype CD34+ s'élevait finalement respectivement à 90, 88 et 100 % du niveau initial. Des valeurs similaires pour l'augmentation des cellules du sang du cordon purifiées par cette méthode ont également été obtenues par d'autres chercheurs: après sédimentation, 92 % de cellules nucléées, 98 % de cellules mononucléées, 96 % de cellules CD34-positives et 106 % d'unités formant colonie ont été isolées.

À la fin des années 1990, la gélatine était largement utilisée comme agent de sédimentation. En pratique clinique, elle est utilisée pour isoler les cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ombilical depuis 1994. Avec une solution de gélatine à 3 %, l'efficacité d'isolement des cellules nucléées atteint 88 à 94 %. L'utilisation à grande échelle de la gélatine pour la création de banques de sang de cordon a confirmé ses avantages par rapport aux autres agents de sédimentation. Une analyse comparative de l'efficacité de toutes les méthodes susmentionnées pour l'isolement des cellules nucléées dans les conditions de leur utilisation séquentielle sur chacun des échantillons de sang de cordon ombilical testés a démontré qu'une solution de gélatine à 3 % est l'agent de sédimentation optimal en termes de rendement en cellules mononucléées de phénotype CD34+/CD45+, ainsi qu'en termes de nombre d'UFC-GM et d'UFC-GEMM. Les méthodes utilisant un gradient de densité de Ficoll, ainsi que l’utilisation d’hydroxyéthylamidon et de méthylcellulose, étaient significativement moins efficaces, avec des pertes de cellules hématopoïétiques atteignant 60 %.

L'augmentation des volumes de greffe de cellules souches de sang de cordon ombilical est liée non seulement au développement de méthodes d'acquisition, mais aussi de stockage. La préparation du sang de cordon ombilical pour une conservation à long terme et le choix de la technologie optimale de cryoconservation posent de nombreux problèmes. Parmi eux figurent la faisabilité des procédures de séparation, l'utilisation de différents milieux de cryoconservation et l'application de méthodes de préparation des cellules décongelées pour la transplantation. Le transport des échantillons de sang de cordon ombilical natif est souvent effectué depuis des régions éloignées des centres hématologiques. À cet égard, la question des durées de conservation acceptables du sang de cordon, entre son acquisition et le début de la cryoconservation, se pose, ce qui revêt une importance particulière lors de la création de banques de sang de cordon.

Une étude de l'activité fonctionnelle des cellules hématopoïétiques du sang de cordon ombilical après un stockage prolongé (jusqu'à 12 ans) dans l'azote liquide a montré qu'environ 95 % des cellules hématopoïétiques ne perdent pas leur forte capacité proliférative pendant cette période. Les travaux de S. Yurasov et ses coauteurs (1997) ont démontré que le stockage du sang de cordon ombilical à température ambiante (22 °C) ou à 4 °C pendant 24 et 48 heures ne réduit pas significativement la viabilité des cellules hématopoïétiques, qui est respectivement de 92 et 88 % du niveau initial. Cependant, si la période de stockage est prolongée à trois jours, le nombre de cellules nucléées viables dans le sang de cordon ombilical diminue significativement. Parallèlement, d'autres études ont montré qu'après un stockage de 2 à 3 jours à 22 ou 4 °C, c'est la viabilité des granulocytes matures, plutôt que celle des cellules hématopoïétiques, qui est la plus affectée.

La viabilité des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon peut être affectée négativement par les composants des systèmes de prélèvement. Une analyse de l'effet de divers anticoagulants dont le mécanisme d'action est dû à la liaison des ions calcium (ACD, EDTA, XAPD-1) sur les cellules progénitrices hématopoïétiques dans des conditions de conservation du sang de cordon de 24 à 72 heures a révélé leur effet négatif sur la viabilité des cellules nucléées. À cet égard, les auteurs recommandent l'utilisation de PBS (solution tampon phosphate) additionnée d'héparine native sans conservateur à une concentration de 20 U/ml, ce qui, selon eux, permet de prolonger la durée de conservation du sang de cordon non fractionné à 72 heures et de préserver l'activité fonctionnelle des unités formant colonie. Cependant, une étude sur la sécurité des CFU-GM et CFU-G a montré que la durée de conservation du sang de cordon avant cryoconservation ne doit pas dépasser neuf heures. De toute évidence, le principe qui devrait s’appliquer dans ce cas est qu’en présence de données contradictoires, la période de conservation minimale recommandée pour le sang de cordon doit être utilisée et la congélation programmée des cellules isolées doit être initiée dès que possible.

Lors de la congélation des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon, une solution de DMSO à 10 % est généralement utilisée comme cryoprotecteur. Cependant, outre son effet cryoprotecteur prononcé, le diméthylsulfoxyde à cette concentration a également un effet cytotoxique direct, même en cas d'exposition minimale aux cellules hématopoïétiques du sang de cordon. Pour réduire l'effet cytotoxique du DMSO, une température d'exposition nulle est utilisée, la vitesse de toutes les manipulations est augmentée et plusieurs lavages sont effectués après décongélation des échantillons de sang de cordon.

Depuis 1995, l'Institut d'hématologie et de transfusiologie de l'Académie des sciences médicales d'Ukraine développe une orientation scientifique visant à étudier en profondeur le sang de cordon ombilical comme source alternative de cellules souches hématopoïétiques. De nouvelles technologies de cryoconservation à basse température des cellules hématopoïétiques issues du sang de cordon ombilical non fractionné et fractionné ont notamment été développées. La polyvinylpyrrolidone médicale de faible poids moléculaire est utilisée comme cryoprotecteur. La méthode de cryoconservation du sang de cordon ombilical non fractionné repose sur une technologie originale de préparation des cellules pour la congélation et sur une méthode de traitement spécifique de la suspension cellulaire immédiatement avant la transplantation.

L'un des facteurs les plus importants influençant le niveau d'activité fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques cryoconservées est la vitesse de refroidissement de la suspension cellulaire, notamment pendant la phase de cristallisation. Une approche logicielle permettant de résoudre le problème de la vitesse et du temps de congélation offre de grandes possibilités de création de méthodes de cryoconservation simples et très efficaces, sans lavage de la suspension cellulaire des cryoprotecteurs avant la transplantation.

Les étapes les plus dangereuses pour la viabilité des cellules lors de leur préparation sont la congélation et la décongélation directes. Lors de la congélation des cellules hématopoïétiques, une partie importante d'entre elles peut être détruite lors du passage du milieu intercellulaire de la phase liquide à la phase solide (cristallisation). Pour réduire le pourcentage de mort cellulaire, on utilise des cryoprotecteurs, dont les mécanismes d'action et l'efficacité cryoprotectrice sont largement décrits dans la littérature scientifique.

Une direction prometteuse pour l'optimisation des méthodes de cryoconservation des cellules de moelle osseuse et du sang du cordon ombilical est la combinaison de faibles concentrations de plusieurs cryoprotecteurs avec différents mécanismes d'action dans une même solution, par exemple, le DMSO agissant au niveau intracellulaire et l'hydroxyéthylamidon ou l'albumine, qui ont un effet protecteur extracellulaire.

Pour la cryoconservation des cellules du sang de cordon ombilical, on utilise traditionnellement une solution de DMSO à 20 %. Cette solution est versée lentement dans la suspension cellulaire sous agitation mécanique constante dans un bain de glace jusqu'à obtention d'un rapport égal (1:1) entre le cryoprotecteur et la suspension cellulaire. La concentration finale en diméthylsulfoxyde est de 10 %. La suspension cellulaire est ensuite refroidie dans une unité cryogénique programmée à une vitesse de GS/min jusqu'à -40 °C, puis la vitesse de refroidissement est augmentée à 10 °C/min. Après -100 °C, le récipient contenant la suspension cellulaire est placé dans de l'azote liquide (-196 °C). Grâce à cette technique de cryoconservation, la conservation des cellules mononucléaires fonctionnellement actives après décongélation atteint 85 % du niveau initial.

Des modifications des méthodes de cryoconservation visent à réduire la concentration de DMSO par l'ajout d'hydroxyéthylamidon (les concentrations finales de diméthylsulfoxyde et d'hydroxyéthylamidon sont respectivement de 5 et 6 %). Une telle combinaison de cryoprotecteurs est très efficace lors de la congélation d'une suspension de cellules myéloïdes, avec une cytoprotection équivalente à celle obtenue avec une solution à 10 % de diméthylsulfoxyde. Le nombre de cellules nucléées viables a atteint 96,7 % du niveau initial, et leur activité fonctionnelle, estimée par le nombre d'UFC-GM, était de 81,8 %.

Français Lors de l'utilisation d'une solution de diméthylsulfoxyde à des concentrations de 5 à 10 % en association avec 4 % d'hydroxyéthylamidon (concentration finale), il a été constaté que la sécurité des cellules CD34-positives dans ces plages de diméthylsulfoxyde reste pratiquement inchangée. Parallèlement, lorsque la concentration de diméthylsulfoxyde diminue de 5 à 2,5 %, on observe une mort massive des cellules du sang de cordon ombilical: le nombre d'unités cellulaires viables diminue de 85,4 à 12,2 %. D'autres auteurs sont également arrivés à la conclusion que ce sont les solutions de diméthylsulfoxyde à 5 et 10 % (dans la version de l'auteur, en association avec du sérum autologue) qui assurent une cytoprotection maximale lors de la cryoconservation des CSH du sang de cordon ombilical. De plus, une bonne conservation des cellules congelées et décongelées successivement est observée dans le cas d'une combinaison de diméthylsulfoxyde à 5 ou 10 % avec une solution d'hydroxyéthylamidon à 4 %, notamment à une vitesse de refroidissement contrôlée de GS/min. Dans une autre étude, une solution cryoprotectrice composée de trois ingrédients – DMSO, albumine humaine purifiée et milieu RPMI dans un rapport de 1:4:5 – a été utilisée. Cette solution a été ajoutée à la suspension cellulaire dans un rapport volumique égal (la concentration finale en diméthylsulfoxyde était de 5 %). Après décongélation au bain-marie à une température de +4 GS, la conservation des CFU-GM a dépassé 94 %.

Certains auteurs suggèrent d'utiliser du sang de cordon non fractionné pour la cryoconservation, car des quantités importantes de cellules hématopoïétiques sont perdues lors du processus d'élimination des globules rouges. Dans cette variante, une solution à 10 % de diméthylsulfoxyde est utilisée pour protéger les cellules mononucléaires des effets néfastes de la cryocristallisation. La congélation est effectuée à une vitesse de refroidissement constante de GS/min jusqu'à -80 °C, après quoi la suspension de cellules de sang de cordon est plongée dans de l'azote liquide. Cette méthode de congélation entraîne une lyse partielle des globules rouges, de sorte que les échantillons sanguins ne nécessitent pas de fractionnement. Après décongélation, la suspension cellulaire est lavée de l'hémoglobine libre et du diméthylsulfoxyde dans une solution d'albumine humaine ou dans le sérum sanguin autologue du patient, puis utilisée pour la transplantation.

La conservation des cellules souches hématopoïétiques après décongélation du sang de cordon non fractionné est certes supérieure à celle du sang de cordon fractionné. Cependant, en raison de la cryostabilité de certains érythrocytes, de graves problèmes post-transfusionnels peuvent survenir suite à la transfusion d'érythrocytes ABO-incompatibles. De plus, le volume de sang non fractionné stocké augmente significativement. D'un point de vue clinique, la cryoconservation des cellules hématopoïétiques du sang de cordon préalablement isolées et purifiées à partir d'autres fractions cellulaires reste préférable.

En particulier, une méthode de cryoconservation de cellules sanguines de cordon ombilical fractionnées a été développée, permettant l'élimination des érythrocytes au stade de la préparation à la congélation. Une solution d'hydroxyéthylamidon à 6 % est utilisée comme composant de la solution de substitution plasmatique « Stabizol ». Après décongélation, la suspension cellulaire ainsi obtenue est prête à l'emploi clinique sans manipulations supplémentaires.

Il existe aujourd'hui de nombreuses méthodes très efficaces de cryoconservation du sang de cordon ombilical. Leur principale différence réside dans le fait que les échantillons sanguins sont congelés non fractionnés ou soumis à une séparation en fractions cellulaires lors de la préparation, et que des cellules nucléées sont préparées sans mélange d'érythrocytes.

Greffe de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon

À la fin des années 1980 et au début des années 1990, il a été établi que le sang de cordon ombilical, qui assure le maintien en vie du fœtus pendant la grossesse, contient une forte concentration de cellules souches hématopoïétiques. La relative simplicité d'obtention de ces cellules et l'absence de problèmes éthiques évidents ont contribué à leur utilisation en médecine. La première greffe réussie de sang de cordon chez un enfant atteint d'anémie de Fanconi a servi de point de départ à l'augmentation du volume des greffes de cellules souches de sang de cordon et à la création d'un système de conservation de ces cellules. Parmi les banques de sang de cordon mondiales, la plus importante est le New York Placental Blood Center, qui figure au bilan de l'Institut national de la santé des États-Unis. Le nombre d'échantillons de sang de cordon ombilical conservés dans cette banque approche les 20 000. Le nombre de receveurs (principalement des enfants) ayant bénéficié d'une greffe réussie est également en augmentation. Selon le ministère américain de la Santé, la période sans rechute après la transplantation des receveurs de sang de cordon dépasse déjà 10 ans.

Cela n'est pas surprenant, car de nombreuses études sur le potentiel hématopoïétique du sang de cordon ombilical ont montré qu'en termes de quantité et de qualité des premières cellules souches, il n'est non seulement pas inférieur à la moelle osseuse d'un adulte, mais le dépasse même à certains égards. Le potentiel prolifératif plus élevé des cellules souches du sang de cordon ombilical est dû aux caractéristiques ontogénétiques de la signalisation cellulaire, à la présence de récepteurs pour des facteurs de croissance spécifiques sur les CSH, à la capacité des cellules du sang de cordon à produire automatiquement des facteurs de croissance, ainsi qu'à la taille et à la longueur importantes des télomères.

Ainsi, les caractéristiques génomiques et phénotypiques des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon prédéterminent une greffe de haute qualité du greffon avec un fort potentiel de restauration de l'hématopoïèse du donneur dans le corps du receveur.

Avantages des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon

Parmi les avantages réels de l'utilisation de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon pour la transplantation par rapport à d'autres sources de cellules hématopoïétiques, il convient de noter le risque quasi nul pour la santé du donneur (hors placenta) et l'absence d'anesthésie générale. L'utilisation du sang de cordon élargit les possibilités de transplantation cellulaire grâce à des greffes partiellement HLA-compatibles (incompatibilité d'un à trois antigènes). Une méthode de conservation à long terme des cellules hématopoïétiques du sang de cordon à l'état congelé a été développée, ce qui augmente la probabilité d'obtenir des types HLA rares et réduit le temps de recherche d'une greffe HLA-compatible pour une allogreffe. Parallèlement, le risque de développer certaines infections latentes transmissibles est considérablement réduit. De plus, l'utilisation de cellules du sang de cordon pour une autogreffe offre une forme peu coûteuse d'assurance-vie biologique.

Cependant, en raison des faibles volumes de sang qui peuvent être collectés à partir du placenta (en moyenne pas plus de 100 ml), le problème d'obtenir la quantité maximale possible de sang à partir de la veine du cordon ombilical se pose tout en respectant strictement la condition de risque minimal de contamination bactérienne des échantillons de sang de cordon ombilical obtenus.

Les cellules hématopoïétiques primitives du sang de cordon ombilical sont généralement identifiées par la présence de la glycophosphoprotéine CD34 à leur surface, ainsi que par leurs propriétés fonctionnelles, en étudiant la clonogénicité ou la formation de colonies in vitro. Une analyse comparative a montré que dans le sang de cordon et la moelle osseuse, la teneur maximale en cellules CD34-positives dans la fraction mononucléaire est respectivement de 1,6 et 5,0 %, le niveau maximal d'unités formant des colonies dans la sous-population cellulaire CD34+ est de 80 et 25 %, l'efficacité totale de clonage des cellules CD34+ est de 88 et 58 %, et la teneur maximale en cellules formant des colonies à fort potentiel de prolifération (HPP-CFC dans la population CD34+) est de 50 et 6,5 %. Il convient d'ajouter que l'efficacité du clonage des cellules CD34+CD38 et la capacité à répondre à la stimulation par cytokines sont également plus élevées dans les cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon.

La combinaison des antigènes phénotypiques Thy-1, CD34 et CD45RA confirme le fort potentiel prolifératif des cellules hématopoïétiques du sang de cordon, et l'expression de ces trois antigènes à la surface des cellules du sang de cordon indique leur appartenance à des cellules souches. De plus, il a été constaté que le sang de cordon contient des cellules de phénotype CD34+ dépourvues de marqueurs de différenciation linéaire. Le taux de sous-populations cellulaires présentant le profil phénotypique CD34+/Lin dans le sang de cordon représente environ 1 % du nombre total de cellules CD34-positives. Les cellules progénitrices hématopoïétiques du sang de cordon ombilical donnent naissance à la lignée cellulaire lymphoïde et à la série myéloïde pluripotente de différenciation cellulaire linéaire, ce qui indique également leur appartenance à des cellules souches.

Comme mentionné précédemment, les différences significatives entre la moelle osseuse et le sang de cordon ombilical résident dans la quantité de cellules hématopoïétiques utilisées pour la transplantation, obtenue lors d'une même procédure de prélèvement. Si, lors d'une transplantation de moelle osseuse, la perte de masse cellulaire lors de la séparation, de la cryoconservation, de la décongélation et des analyses est acceptable entre 40 et 50 %, pour le sang de cordon ombilical, ces pertes cellulaires sont très importantes, car une quantité insuffisante de CSH peut rendre la transplantation inefficace. Selon G. Kogler et al. (1998), pour une transplantation cellulaire chez un receveur pesant 10 kg, tous les échantillons de sang de cordon ombilical peuvent être des transplantations potentielles (le nombre total d'échantillons de sang de cordon collectés est de 2 098), pour un poids de 35 kg - 67 %, et seulement 25 % des échantillons peuvent permettre une transplantation efficace chez les patients pesant entre 50 et 70 kg. Cette situation clinique souligne la nécessité d'optimiser et d'améliorer l'efficacité des méthodes existantes de collecte, de reproduction et de conservation des cellules du sang de cordon ombilical. Par conséquent, la littérature discute actuellement largement des questions de normalisation des méthodes de collecte, de test, de séparation et de cryoconservation du sang de cordon ombilical pour créer des banques de sang, de son utilisation en clinique, et stipule également les conditions et modalités de stockage des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ombilical.

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Utilisation des cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon en médecine

^{Habituellement, il est possible d'isoler jusqu'à 106} cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ombilical, rarement plus. À cet égard, la question de savoir si une telle quantité de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ombilical est suffisante pour restaurer l'hématopoïèse chez un receveur adulte reste ouverte à ce jour. Les avis sont partagés. Certains chercheurs estiment qu'une telle quantité est largement suffisante pour une transplantation chez l'enfant, mais insuffisante pour une transplantation chez l'adulte, pour lequel la quantité optimale est l'introduction de (7-10) x 106 ^cellules CD34-positives par kg de poids corporel, soit une moyenne de 7 x ¹⁰⁸ par transplantation. Ces calculs montrent qu'un échantillon de sang de cordon ombilical contient 700 fois moins de cellules souches hématopoïétiques que ce qui est nécessaire pour une transplantation chez un patient adulte. Cependant, cette évaluation quantitative est réalisée par analogie avec le nombre de cellules de moelle osseuse transfusées et ne prend absolument pas en compte les caractéristiques ontogénétiques de l'hématopoïèse.

Français En particulier, le fait que les cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon ombilical présentent un potentiel prolifératif supérieur à celui des cellules progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse est ignoré. Les résultats d'études in vitro sur le potentiel de formation de colonies suggèrent qu'une dose de sang de cordon ombilical est capable de reconstituer l'hématopoïèse du receveur adulte. D'autre part, il ne faut pas oublier que le nombre de cellules souches du sang de cordon ombilical diminue même pendant le développement embryonnaire: la teneur en cellules CD34-positives dans le sang de cordon ombilical diminue linéairement de 5 fois entre 20 semaines (le sang utilisé pour l'étude a été prélevé lors d'une interruption prématurée de grossesse) et 40 semaines de gestation (période de travail physiologique), ce qui s'accompagne d'une expression parallèle et en constante augmentation des marqueurs de cytodifférenciation linéaire.

En raison de l'absence d'approche standardisée pour la détermination quantitative des cellules progénitrices dans les échantillons de sang de cordon, les débats sur la dose optimale de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon se poursuivent. Certains chercheurs pensent que le nombre de cellules nucléées et de cellules mononucléées recalculé en fonction du poids corporel du receveur, c'est-à-dire leur dose, peut être utilisé comme critère de sélection des échantillons de sang de cordon. Certains auteurs estiment que le seuil quantitatif minimal de cellules CD34+, même pour l'autotransplantation de CSH, est de 2 x 10 ⁶ /kg. Parallèlement, une augmentation de la dose de cellules hématopoïétiques à 5 x 10 ⁶ cellules/kg (soit seulement 2,5 fois) assure déjà une évolution plus favorable de la période post-transplantation précoce, réduit l'incidence des complications infectieuses et raccourcit la durée de l'antibiothérapie préventive.

Selon E. Gluckman et al. (1998), en oncohématologie, la condition de réussite d'une greffe de cellules souches hématopoïétiques est l'introduction d'au moins 3,7 x 10 ⁷ cellules nucléées par kg de poids corporel du receveur. Lorsque la dose de cellules souches hématopoïétiques est réduite à 1 x 10 ⁷ cellules nucléées ou moins par kg de poids corporel du patient, le risque d'échec de la greffe et de récidive du cancer du sang augmente fortement. Il convient de reconnaître que le nombre minimal de cellules progénitrices nécessaire à une restauration rapide de l'hématopoïèse après allotransplantation de CSH est encore inconnu. Théoriquement, cela peut être obtenu en utilisant une seule cellule, mais dans la pratique clinique de la greffe de moelle osseuse, une prise de greffe rapide et stable est garantie par la transfusion d'au moins (1-3) x 10 ⁸ cellules nucléées par kg de poids corporel du patient.

Une étude détaillée récente visant à déterminer le nombre optimal de CSH en oncohématologie a consisté à observer des patients répartis en trois groupes, répartis en fonction de la teneur en cellules CD34-positives du matériel transplanté. Les patients du premier groupe ont reçu (3-5) x 10 ⁶ cellules/kg. La dose de CSH chez les patients du deuxième groupe était de (5-10) x 10 ⁶ cellules/kg, et les patients du troisième groupe ont reçu plus de 10 x 10 ⁶ cellules CD34+/kg. Les meilleurs résultats ont été observés dans le groupe de receveurs ayant reçu une greffe avec un nombre de cellules CD34-positives égal à (3-5) x 10 ⁶ /kg. Avec une augmentation de la dose de cellules transplantées au-delà de 5 x 10 ⁶ /kg, aucun avantage statistiquement significatif n'a été mis en évidence. Dans ce cas, une teneur très élevée en cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans le greffon (> 10 x 10 ⁶ /kg) est associée à la réinjection d'un nombre significatif de cellules tumorales résiduelles, ce qui entraîne une rechute de la maladie. Aucune relation directe entre le nombre de cellules progénitrices allogéniques transplantées et le développement de la réaction du greffon contre l'hôte n'a été établie.

L'expérience mondiale accumulée en matière de transplantation de sang de cordon confirme son fort potentiel de repopulation. Le taux de prise de greffe est corrélé au nombre de cellules nucléées introduites. Les meilleurs résultats sont observés avec une transplantation de 3 x 107 ^/ kg, tandis que pour la moelle osseuse, cette dose est de 2 x 108 ^/ kg. Selon les données des centres coordinateurs, fin 2000, 1 200 transplantations de cellules de sang de cordon ont été réalisées dans le monde, principalement à partir de donneurs apparentés (83 %). Il est évident que le sang de cordon devrait être considéré comme une alternative à la moelle osseuse pour la transplantation chez les patients atteints d'hémoblasoses.

Parallèlement, la nature néonatale de la source de tissu hématopoïétique du cordon ombilical inspire l'optimisme en raison de la présence de caractéristiques fonctionnelles de ses CSH. Par ailleurs, seule l'expérience clinique peut répondre à la question de la suffisance d'un seul échantillon de sang de cordon pour restaurer l'hématopoïèse chez un receveur adulte atteint d'aplasie hématopoïétique. La transplantation de cellules sanguines du cordon ombilical est utilisée dans les programmes de traitement de nombreuses maladies tumorales et non tumorales: leucémies et syndromes myélodysplasiques, lymphomes non hodgkiniens et neuroblastomes, anémie aplasique, anémies congénitales de Fanconi et de Diamond-Blackfan, déficit d'adhésion leucocytaire, syndrome de Barr, maladie de Gunther, syndrome de Hurler, thalassémie.

Les aspects immunologiques de la transplantation de cellules hématopoïétiques du sang de cordon méritent une attention particulière et une étude distincte. Il a été démontré que les transplantations de cellules souches du sang de cordon provenant de donneurs présentant une compatibilité HLA incomplète donnent des résultats plutôt satisfaisants, ce qui, selon les auteurs, indique une immunoréactivité plus faible des cellules du sang de cordon que de la moelle osseuse.

Une étude détaillée de la composition cellulaire du sang de cordon ombilical a révélé les caractéristiques du spectre phénotypique des cellules effectrices du système immunitaire et de leur activité fonctionnelle, ce qui a permis de considérer le sang de cordon comme une source de CSH présentant un risque relativement faible de développer une réaction du greffon contre l'hôte. Parmi les signes d'immaturité fonctionnelle des cellules immunocompétentes du sang de cordon ombilical, il convient de noter un déséquilibre dans la production de cytokines et une diminution de la sensibilité à la régulation de la réponse immunitaire par les cytokines. L'inhibition de l'activité des lymphocytes cytotoxiques qui en résulte est considérée comme un facteur contribuant à la formation d'une tolérance immunologique au tissu hématopoïétique transplanté. Dans la population de lymphocytes du sang de cordon ombilical, contrairement au sang périphérique et à la moelle osseuse des donneurs adultes, les lymphocytes inactifs et immatures et les cellules suppressives prédominent. Cela indique une moindre capacité des lymphocytes T du sang de cordon ombilical à une réponse immunitaire. Une caractéristique importante de la population monocytaire de cellules sanguines du cordon ombilical est la faible teneur en cellules présentatrices d’antigènes fonctionnellement complètes et actives.

D'une part, la faible maturité des cellules effectrices du système immunitaire dans le sang de cordon élargit les indications cliniques de ce médicament, car ces caractéristiques permettent de réduire l'intensité du conflit immunitaire entre les cellules du donneur et du receveur. D'autre part, il existe une corrélation avérée entre le degré de développement de la réaction « greffe contre hôte » et l'effet antitumoral de la transplantation, c'est-à-dire le développement de l'effet « greffe contre leucémie ». À cet égard, une étude a été menée sur la cytotoxicité antitumorale des cellules du sang de cordon. Les résultats obtenus indiquent que, malgré la réponse nettement affaiblie des cellules du sang de cordon immunocompétentes à la stimulation antigénique, les lymphocytes principalement activés sont des cellules tueuses naturelles et des cellules de type « killer-like » qui participent activement aux mécanismes de mise en œuvre de la cytotoxicité antitumorale. De plus, des sous-populations de lymphocytes présentant les phénotypes CD16+CD56+ et CD16"TCRa/p+ ont été détectées dans le sang du cordon ombilical. On suppose que ces cellules, sous leur forme activée, mettent en œuvre la réaction « greffe contre leucémie ».

À l'Institut d'oncologie de l'Académie des sciences médicales d'Ukraine, des cellules hématopoïétiques cryoconservées issues du sang de cordon ombilical ont été administrées à des patients atteints de cancer présentant une hypoplasie hématopoïétique persistante due à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Chez ces patients, la transplantation de cellules souches hématopoïétiques issues du sang de cordon ombilical a permis de restaurer efficacement l'hématopoïèse, comme en témoignent l'augmentation persistante du taux d'éléments figurés matures dans le sang périphérique, ainsi que l'amélioration des indicateurs caractérisant l'état de l'immunité cellulaire et humorale. La stabilité de l'effet de repopulation après transplantation de cellules hématopoïétiques issues du sang de cordon ombilical permet de poursuivre la radiothérapie et la chimiothérapie sans interrompre le traitement. Des données font état d'une efficacité accrue de l'allotransplantation de cellules souches issues du sang de cordon ombilical chez les patients atteints d'oncohématologie: le risque annuel de récidive tumorale avec leur utilisation était de 25 %, contre 40 % chez les patients ayant reçu une greffe de moelle osseuse allogénique.

Le mécanisme d'action des cellules souches du sang de cordon cryoconservées doit être considéré comme le résultat d'une stimulation humorale de l'hématopoïèse du receveur, induite par la capacité unique des cellules néonatales à produire de manière autocrine des facteurs de croissance hématopoïétiques, ainsi que comme une conséquence de la greffe temporaire des cellules du donneur (comme en témoigne une augmentation fiable de la teneur en hémoglobine fœtale dans le sang périphérique des receveurs entre le 7e et le 15e jour après la transfusion, par rapport aux données initiales). L'absence de réactions post-transfusionnelles chez les receveurs de sang de cordon est le résultat de la tolérance relative de ses cellules immunocompétentes, ainsi qu'un critère de confiance pour l'adéquation biologique du matériel cryoconservé.

Les cellules progénitrices tueuses de lymphocytes T du sang de cordon ombilical sont capables d'être activées par stimulation exogène de cytokines, ce qui permet de développer de nouvelles méthodes ex vivo et in vivo pour induire une cytotoxicité antitumorale des éléments lymphoïdes transplantés en vue d'une immunothérapie ultérieure. De plus, l'immaturité du génome des cellules immunocompétentes du sang de cordon ombilical permet de les utiliser pour renforcer l'activité antitumorale par des méthodes de modélisation moléculaire.

Aujourd'hui, le sang de cordon est largement utilisé, principalement en hématologie pédiatrique. Chez les enfants atteints de leucémie aiguë, l'allotransplantation de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon, comparée à l'allotransplantation de moelle osseuse, réduit significativement l'incidence de la maladie du greffon contre l'hôte. Cependant, cette situation s'accompagne d'une période plus longue de neutro- et thrombocytopénie et, malheureusement, d'un taux de mortalité post-transplantation plus élevé à 100 jours. Un rétablissement plus long des taux de granulocytes et de plaquettes dans le sang périphérique pourrait être dû à une différenciation insuffisante des sous-populations de cellules du sang de cordon CD34-positives, comme en témoignent le faible niveau d'absorption de la rhodamine radioactive et la faible expression des antigènes CD38 à leur surface.

Parallèlement, la transplantation de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical à des patients adultes, réalisée en raison de l'absence d'un donneur de moelle osseuse compatible non apparenté et de la possibilité de mobiliser des CSH autologues, a montré une survie sans récidive élevée à un an dans le groupe des patients de moins de 30 ans (73 %). L'élargissement de la tranche d'âge des receveurs (18-46 ans) a conduit à une diminution de la survie à 53 %.

Français L'analyse quantitative des cellules avec le phénotype CD34+ dans la moelle osseuse et le sang de cordon a révélé leur teneur plus élevée (3,5 fois) dans la moelle osseuse, mais une prédominance significative de cellules avec le profil phénotypique CD34+HLA-DR a été notée dans le sang de cordon. Il est connu que les cellules sanguines avec les marqueurs immunologiques CD34+HLA-DR prolifèrent plus activement que les cellules avec l'immunophénotype CD34+HLA-DR+, ce qui a été confirmé par des études expérimentales sur la croissance à long terme de cultures de cellules hématopoïétiques in vitro. Les précurseurs cellulaires primitifs avec le phénotype CD34+CD38 sont présents à la fois dans le sang de cordon et la moelle osseuse, mais les cellules du sang de cordon avec l'ensemble de marqueurs CD34+CD38 ont une activité clonogénique plus élevée que les cellules hématopoïétiques du même phénotype isolées de la moelle osseuse de donneurs adultes. De plus, les cellules du sang de cordon avec l'immunophénotype CD34+CD38 prolifèrent plus rapidement en réponse à la stimulation des cytokines (IL-3, IL-6, G-CSF) et produisent 7 fois plus de colonies dans les cultures à long terme que les cellules de la moelle osseuse.

Banques de cellules souches de sang de cordon

Pour le bon développement d'un nouveau domaine de la médecine pratique – la greffe de cellules souches du sang de cordon – ainsi que pour la mise en œuvre de greffes de cellules souches hématopoïétiques de moelle osseuse, il est nécessaire de disposer d'un vaste réseau de banques de sang, déjà créé aux États-Unis et en Europe. Les réseaux nationaux de banques de sang de cordon sont regroupés au sein de la Netcord Bank Association. L'opportunité de créer une association internationale de banques de sang de cordon est conditionnée par le fait qu'un grand nombre d'échantillons de sang de cordon typés sont nécessaires pour réaliser des greffes non apparentées, ce qui permet de sélectionner un donneur HLA-identique. Seule la mise en place d'un système de banques permettant le stockage d'échantillons sanguins de différents types HLA peut réellement résoudre le problème de la recherche du donneur nécessaire. L'organisation d'un tel système de banques de sang de cordon nécessite l'élaboration préalable de normes éthiques et juridiques, actuellement en discussion au niveau international.

Afin de créer des banques de sang de cordon en Ukraine, toute une série de réglementations et de documents doivent être élaborés.

Il s'agit tout d'abord de normaliser les méthodes de collecte, de fractionnement et de congélation du sang de cordon ombilical. Il est nécessaire de réglementer les règles de collecte du sang de cordon ombilical dans les maternités, conformément aux exigences de l'éthique médicale, afin de déterminer le volume minimal de sang de cordon ombilical garantissant le succès de la transplantation. Il est nécessaire de comparer et de normaliser différents critères d'évaluation de la qualité et de la quantité des cellules souches hématopoïétiques, ainsi que les méthodes de typage HLA et de diagnostic des maladies génétiques et infectieuses susceptibles d'être transmises lors de la perfusion de cellules de sang de cordon ombilical, afin d'établir des critères communs pour la sélection des donneurs sains. Il convient également d'examiner la question de la création d'installations de stockage distinctes pour le sérum, les cellules et l'ADN issus du sang de cordon ombilical.

Il est absolument nécessaire d'organiser un réseau informatique de données sur le sang de cordon ombilical afin de le relier aux registres de donneurs de moelle osseuse. Pour le développement de la transplantation cellulaire, il est nécessaire de développer des protocoles spécifiques permettant de comparer les résultats des greffes de sang de cordon et de moelle osseuse provenant de parents HLA-identiques et de donneurs non apparentés. La standardisation de la documentation, incluant le consentement éclairé des parents, ainsi que la notification à la mère ou à la famille des maladies génétiques et/ou infectieuses détectées chez l'enfant, peuvent contribuer à résoudre les problèmes éthiques et juridiques liés à l'utilisation clinique des cellules du sang de cordon.

La condition déterminante pour le développement de la transplantation cellulaire en Ukraine sera l'adoption du Programme national de don de cellules souches et le développement de la coopération internationale avec d'autres pays par l'intermédiaire de la World Marrow Donor Association (WMDA), du National Marrow Donor Program (NMDP) des États-Unis et d'autres registres.

Pour résumer l'histoire encore récente du développement de la greffe de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, notons que les premières hypothèses sur la possibilité d'utiliser le sang de cordon en clinique, formulées au début des années 70, ont été confirmées dans les années 80 par les résultats d'études expérimentales sur des animaux. En 1988, la première transplantation mondiale de cellules hématopoïétiques de sang de cordon à un humain a été réalisée, ce qui a donné naissance à un réseau mondial de banques de sang de cordon. En 10 ans, le nombre de patients ayant bénéficié d'une greffe de cellules hématopoïétiques de sang de cordon a atteint près de 800. Parmi eux se trouvaient des patients atteints de diverses maladies, tumorales (leucémie, lymphome, tumeurs solides) et non tumorales (déficits immunitaires congénitaux, anémie, maladies associées à des troubles métaboliques).

La teneur en précurseurs cellulaires précoces et confirmés du sang du cordon ombilical est supérieure à celle du sang périphérique d'un adulte. En termes de nombre d'unités formant des colonies de granulocytes-macrophages et de leur potentiel prolifératif, le sang du cordon ombilical dépasse significativement celui du sang périphérique d'un adulte, même après introduction de facteurs de croissance. Dans les cultures cellulaires in vitro à long terme, une activité proliférative et une viabilité supérieures des cellules du sang du cordon ombilical ont été observées par rapport aux cellules de la moelle osseuse. Les points critiques de la greffe de cellules souches du sang du cordon ombilical sont le nombre et le potentiel hématopoïétique des cellules nucléées, la présence d'une infection à cytomégalovirus, la compatibilité HLA du donneur et du receveur, le poids corporel et l'âge du patient.

Cependant, la greffe de cellules souches du sang de cordon devrait être envisagée comme une alternative à la greffe de moelle osseuse pour le traitement des maladies sanguines graves, principalement chez les enfants. Les problèmes cliniques liés à la greffe de cellules souches du sang de cordon sont progressivement résolus: des méthodes efficaces de collecte, de séparation et de cryoconservation des cellules du sang de cordon sont déjà disponibles, les conditions de constitution de banques de sang de cordon sont réunies et les méthodes de test des cellules nucléées sont améliorées. Une solution de gélatine à 3 % et une solution d'hydroxyéthylamidon à 6 % devraient être considérées comme optimales pour la séparation lors de l'approvisionnement à grande échelle de cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon lors de la constitution de banques.

P. Perekhrestenko et ses coauteurs (2001) soulignent à juste titre que la greffe de cellules souches du sang de cordon devrait occuper la place qui lui revient dans l'ensemble des mesures thérapeutiques visant à surmonter les dépressions hématopoïétiques d'origines diverses, car les cellules souches du sang de cordon présentent un certain nombre d'avantages significatifs, parmi lesquels les plus importants sont la relative simplicité de leur obtention, l'absence de risque pour le donneur, la faible contamination des cellules néonatales par des virus et le coût relativement faible de la transplantation. Certains auteurs soulignent que la greffe de cellules du sang de cordon ombilical s'accompagne moins souvent de complications liées à la réaction du greffon contre l'hôte que la greffe de cellules de moelle osseuse, ce qui est dû, selon eux, à la faible expression des antigènes HLA-DR sur les cellules du sang de cordon et à leur immaturité. Cependant, la principale population de cellules nucléées dans le sang du cordon ombilical est constituée de lymphocytes T (cellules CD3-positives), dont la teneur est d'environ 50 %, soit 20 % de moins que dans le sang périphérique d'un adulte, mais les différences phénotypiques dans les sous-populations de cellules T provenant de ces sources sont insignifiantes.

Parmi les facteurs influençant directement le taux de survie après une greffe de cellules souches du sang de cordon, il convient de noter l'âge des patients (les meilleurs résultats sont observés chez les receveurs âgés de un à cinq ans), la précocité du diagnostic et la forme de leucémie (l'efficacité est significativement plus élevée en cas de leucémie aiguë). La dose de cellules souches du sang de cordon ombilical nucléées, ainsi que leur compatibilité HLA avec le receveur, sont également d'une importance capitale. Ce n'est pas un hasard si l'analyse de l'efficacité clinique de la greffe de cellules souches du sang de cordon en oncohématologie montre les meilleurs résultats thérapeutiques avec les greffes apparentées: la survie sans récidive à un an atteint 63 %, contre seulement 29 % avec les greffes non apparentées.

Ainsi, la présence d'un grand nombre de cellules souches dans le sang de cordon et la forte capacité de repopulation des cellules souches hématopoïétiques néonatales permettent leur utilisation pour la transplantation allogénique chez les patients oncohématologiques. Cependant, il convient de noter que la récapitulation de l'hématopoïèse après transplantation de cellules hématopoïétiques du sang de cordon est « étirée dans le temps »: la restauration du contenu en neutrophiles dans le sang périphérique est généralement observée vers la fin de la 6e semaine, et la thrombocytopénie disparaît généralement après 6 mois. De plus, l'immaturité des cellules hématopoïétiques du sang de cordon n'exclut pas les conflits immunologiques: une réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique sévère est observée chez 23 et 25 % des receveurs, respectivement. Des rechutes de leucémie aiguë à la fin de la première année suivant la transplantation de cellules du sang de cordon sont observées dans 26 % des cas.

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