Diagnostic en laboratoire de la tuberculose

La tuberculose est une maladie facile à diagnostiquer dans les conditions modernes et les réalisations scientifiques. Le diagnostic en laboratoire de la tuberculose est au cœur des autres méthodes de diagnostic, juste après les méthodes de recherche aux rayons X.

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Test sanguin clinique

Chez les patients atteints de tuberculose, les modifications de l'analyse générale du sang ne sont pas pathognomoniques. Avec les formes limitées et inactives de la tuberculose, l'érythrocyte est hypochrome en quantité normale. Lorsque infiltrats massives ou la pneumonie caséeuse, alors que la prévalence de la lymphadénite caséeuse, lésions intestinales spécifiques, ainsi que pour les grandes hémorragies pulmonaires ou post-opératoire et la note érythropénie microcytose, oligohromaziyu, polihromaziyu. La macrocytose, et en particulier les poikilotsitoz se rencontrent beaucoup moins souvent, habituellement avec une anémie sévère. Nombre de reticulocytes à la tuberculose de l'étape compensée varie de 0,1 à 0,6%, avec subcompensated - 0,6 à 1,0% et 1% est caractérisée par décompensée réticulocytes.

Lorsque la tuberculose dans certains cas, il peut y avoir une leucocytose modérée (jusqu'à 15 mille leucocytes.), Moins le rayonnement, qui se produisent dans 2-7% des patients présentant des formes de traitement limitées et faciles se produire et à 12,5% - par la tuberculose pulmonaire destructrice et progressive .

Les changements les plus fréquents se produisent dans la formule leucocytaire. Marquer à la fois la neutrophilie relative et absolue, un changement modéré de la formule leucocytaire à gauche avant les promyélocytes. Les myélocytes sont très rares dans le cas de la tuberculose non compliquée. L'augmentation du nombre de neutrophiles avec le grain anormal chez les patients atteints de tuberculose hémogramme indique toujours la durée du processus: chez les patients atteints de tuberculose sévère presque tous les neutrophiles contiennent anormale des grains. Lorsque l'épidémie tuberculeuse cesse, le déplacement nucléaire se rapproche rapidement de la normale. La granularité pathologique des neutrophiles persiste généralement plus longtemps que les autres changements de l'hémogramme.

La teneur en éosinophiles dans le sang périphérique varie également en fonction de la phase du processus et de l'état allergique de l'organisme. Leur nombre diminue jusqu'à aneozinofiliya en épidémie grave et prolongée de la maladie et, à l'inverse, augmente à mesure que les infiltrats de résorption et un épanchement pleural, ainsi que les premières formes de tuberculose primaire.

La plupart des formes de tuberculose primitive s'accompagnent d'une lymphopénie, parfois observée pendant plusieurs années, même après cicatrisation de modifications spécifiques. La tuberculose secondaire dans la phase d'exacerbation, en fonction de la gravité du processus, peut être accompagnée soit d'un nombre normal de lymphocytes, soit d'une lymphopénie.

Il occupe une place particulière à déterminer la vitesse de sédimentation érythrocytaire Des tests supplémentaires pour évaluer procédé tuberculeuse (ESR) ayant une valeur dans l'évaluation du processus de la tuberculose de l'écoulement et l'identification de ses formes actives. Augmentation de l'ESR indique la présence du processus pathologique (septique-inflammatoire infectieuse, suppurative, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Et est une indication de la gravité, mais des niveaux normaux ESR pas toujours indiquer l'absence de pathologie. L'accélération de la sédimentation contribuent à une augmentation des taux sanguins de globulines, le fibrinogène, le cholestérol et réduire la viscosité du sang. Lente caractéristique de sédimentation des conditions accompagné hémoconcentration, augmentation de la teneur des acides biliaires et l'albumine.

L'hémogramme chez les patients atteints de tuberculose change pendant le traitement. Les changements hématologiques disparaissent le plus rapidement, plus l'intervention thérapeutique est réussie. Cependant, il faut garder à l'esprit l'effet sur l'hémopoïèse de divers médicaments antibactériens. Ils provoquent souvent l'éosinophilie, dans certains cas - la leucocytose, et plus souvent la leucopénie jusqu'à l'agranulocytose et la réaction lymphoïde réticulaire. Un contrôle hématologique systématique et une analyse correcte des données obtenues sont essentiels pour évaluer l'état clinique du patient, la dynamique du processus et l'efficacité du traitement utilisé.

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L'analyse clinique de l'urine

Avec la tuberculose du système urinaire, l'analyse d'urine est la principale méthode de diagnostic en laboratoire. Vous pouvez observer une leucocytose, une érythrocytose, une protéinurie, une hypoisostenurie, une tuberculose mycobactérienne, une bactériurie non spécifique.

Leucocyturie - le symptôme le plus fréquent de la tuberculose du système urinaire avant la chimiothérapie et il n'y a pas seulement spécifique dans des cas exceptionnels, tels que oblitération complète de la lumière de l'uretère. Test Nechyporenko (détermination du nombre de leucocytes dans 1 ml d'urine) aide à évaluer plus objectivement le degré leucocyturie nefrotuberkuloze avec, dans certains cas, de l'identifier à la normale analyse d'urine. Cependant, il faut tenir compte du fait que la leucocytose peut survenir dans la pyélonéphrite aiguë et chronique, la cystite, l'urétrite, le rein et les calculs urétéraux.

Erythrocyturie. Ainsi que la leucocytose. Sont considérés comme l'un des signes de laboratoire les plus fréquents de la tuberculose du système génito-urinaire. La fréquence de l'hématurie dépend de la prévalence du processus, elle augmente à mesure que le processus de la tuberculose destructrice se développe dans les reins. L'érythrocyturie sans leucocyturie est plus typique des premiers stades de la tuberculose rénale. L'hématurie, qui prédomine sur la leucocytose, est un argument important en faveur de la tuberculose rénale dans sa différenciation avec la pyélonéphrite non spécifique.

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Test sanguin biochimique

Avec la tuberculose, les modifications de certains paramètres biochimiques dépendent principalement de la phase du processus, des complications et de diverses maladies concomitantes. Chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire et d'autres organes inactifs, les fractions protéiques et protéiques totales du sérum sanguin sont inchangées et déterminent leur contenu normal.

Dans les formes aiguës de la maladie, ainsi que dans l'exacerbation et la progression des formes chroniques de la tuberculose, le coefficient albumine-globuline diminue.

Essentiel dans l'évaluation de l'état fonctionnel des dommages organiques et le foie dans la tuberculose et ses complications est la détermination du total du sérum et de la bilirubine directe, AST (ACT), alanine aminotransferase (ALT). Détermination dynamique du taux d'aminotransférases. La bilirubine dans le traitement des patients atteints de tuberculose, en particulier dans les formes sévères, est une composante obligatoire d'un examen biochimique des patients atteints de tuberculose et est effectuée mensuellement.

L'évaluation de l'état fonctionnel des reins comprend la détermination de la créatinine sérique et le calcul du taux de filtration glomérulaire selon la formule de Cockcroft-Gault. Le calcul du taux de filtration glomérulaire à l'aide de l'échantillon de Reberg donne des résultats moins précis.

L'objectif principal des études biochimiques dynamiques des patients atteints de tuberculose est de suivre l'évolution du processus, la détection rapide des effets secondaires des médicaments et une correction adéquate des troubles homéostatiques qui en résultent.

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Application de méthodes biochimiques d'investigation dans la tuberculose extrapulmonaire

L'indicateur le plus informatif est la teneur en acide tuberculostéarique dans les fluides biologiques, mais sa définition est associée à des difficultés techniques (nécessité de la chromatographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse).

Mesure prospective de l'activité de l'adénosine désaminase - une enzyme, déterminée dans les liquides: synoviale, péricardique, ascitique ou spinale. Les principaux producteurs d'adénosine désaminase sont les lymphocytes et les monocytes. La détermination de l'activité de l'adénosine désaminase dans les liquides biologiques facilite le diagnostic de la synovite tuberculeuse, de la tuberculose des ganglions lymphatiques, de la tuberculose méningée, de la tuberculose séreuse.

Certains indicateurs biochimiques dus à leur non-spécificité ne sont déterminés que dans les fluides biologiques, proches du foyer lésionnel. Mesurer le niveau d'indicateurs en réponse à l'injection sous-cutanée ou intradermique de tuberculine (habituellement avant et 48 et 72 heures après). Après cela, le degré d'incrémentation du niveau du marqueur (en%) est calculé par rapport au niveau initial.

Détermination optimale dans l'urine de l'activité d'une enzyme spécifique de l'organe de la transamnidase, dont l'apparition est notée dans la défaite des reins de nature diverse. L'étude de la transamidinase n'est justifiée que dans des conditions d'injection sous-cutanée de tuberculine afin d'exacerber le processus inflammatoire local. Déterminer l'activité de la transamidine dans l'urine initialement et 24-72 heures après l'introduction de 50 TE tuberculine. L'élargissement de la fermente à 2 fois et plus permet dans 82% des cas de différencier la tuberculose active des reins de l'exacerbation de la pyélonéphrite chronique.

Avec la tuberculose des organes génitaux féminins, les concentrations d'haptoglobine et de dialdéhyde malonique dans le sang sont déterminées dans les conditions d'un test tuberculinique provocateur. La tuberculine injectée par voie sous-cutanée dans une dose de 50 TE et 72 heures plus tard a effectué une deuxième étude biochimique. Dans le cas de l'étiologie de la tuberculose, le taux d'augmentation du taux d'haptoglobine n'est pas inférieur à 28% et le taux de malondialdéhyde est de 39% ou plus. La détermination de l'activité de l'adénosine désaminase dans un liquide péritonéal obtenu à partir de l'espace de Douglas est également utilisée. Le point lacrymal est réexaminé 72 heures après l'injection intradermique de tuberculine à des doses de 0,1 TE et 0,01 TE dans la projection des organes génitaux internes sur la paroi abdominale antérieure. En faveur du processus tuberculeux, une augmentation de l'activité de l'adénosine désaminase est de 10% ou plus par rapport à l'activité initiale.

Lorsque l'œil est affecté, la réaction focale qui se produit dans l'œil en réponse à une stimulation antigénique est examinée. Il n'est pas souhaitable de développer une réponse prononcée, accompagnée d'une diminution des fonctions visuelles. Puisque l'évaluation des réactions focales minimales est souvent difficile, pour l'objectivation de la conclusion, il est recommandé d'orienter en parallèle et sur le degré de croissance dans le sérum sanguin de l'haptoglobine ou de l'adénosine désaminase.

Toutes les études biochimiques devraient être menées en conjonction avec d'autres méthodes.

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Recherche sur le système de coagulation sanguine

Pertinence de l'état de la recherche du système de coagulation du sang de la tuberculose est causée par la présence d'un certain nombre de patients atteints de tuberculose pulmonaire hémoptysies ou hémorragie pulmonaire, ainsi que les complications de hemocoagulation dans le traitement chirurgical de la tuberculose. De plus, coule hemocoagulation intravasculaire tuberculose latente naturellement liée influe sur le cours de la maladie et l'efficacité de la chimiothérapie.

Chez les patients ayant une prévalence de tuberculose pulmonaire de la composante inflammatoire exsudative de la baisse observée dans l'activité anticoagulation du sang. Chez les patients ayant une faible prévalence d'une lésion spécifique dans les poumons avec une prédominance de la composante inflammatoire intravasculaire hemocoagulation productive exprimé légèrement. Chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire avec hémoptysie et système pulmonaire de coagulation du sang de l'état de l'hémorragie est différente: chez les patients présentant une faible perte de sang au gemoptoe de hauteur ou immédiatement après la fin il y a une forte augmentation de la capacité de coagulation du sang en raison de l'intensification sévère de trombinoobrazovaniya tout en maintenant augmentation de la coagulation « structurel ». Chez les patients présentant une perte de sang massive, une diminution du potentiel de coagulation est observée en raison d'une diminution de la concentration de fibrinogène. Activité du facteur XIII, numération plaquettaire. Au stade du traitement chirurgical, les patients atteints de formes limitées de tuberculose ne présentent pas de troubles significatifs légers avec le système d'homéostasie. Les patients ayant procédé répandu dans l'exécution de pnevmon- ou plevropnevmonektomii développent fréquemment DIC, qui peut prendre la forme de la « deuxième maladie ».

Pour surveiller l'état de coagulation du sang chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire doit être effectuée la détermination du temps de thromboplastine partielle activée (aPTT), le fibrinogène, le temps de thrombine, la prothrombine et le temps de saignement index et le temps de coagulation.

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Recherche hormonale

Les observations expérimentales et cliniques modernes indiquent la présence de changements dans le statut hormonal dans une inflammation pulmonaire tuberculeuse spécifique. Il est prouvé que la correction du dysfonctionnement des systèmes de hypophyso-surrénalien, hypophyse-thyroïde et la fonction pancréatique en association avec le traitement anti-TB contribuent à l'activation de la fibrogenèse et la réparation à un lieu spécifique inflammation.

L'état fonctionnel du système hypophyso-thyroïdien est déterminé par la teneur dans le sérum sanguin de la triiodothyronine (T ₃ ), la thyroxine (T ₄ ), l' hormone stimulant la thyroïde pituitaire (TSH). Il a été constaté que l' hypothyroïdie infraclinique est détectée dans 38-45% des patients atteints de tuberculose pulmonaire, et le plus souvent il est diagnostiqué avec le processus de formulaires et disséminé fibro-caverneux. Dans ces mêmes formes niveaux les plus réduits de façon spectaculaire à la fois T ₃ et T ₄, et il arrive un déséquilibre de ces hormones sous la forme d'augmenter le rapport de T ₄ / T _s.

La fonction du cortex surrénalien est évaluée par le taux de cortisol dans le sérum sanguin et la fonction incrémentale du pancréas par la concentration de l'insuline immunoréactive. Dans la phase aiguë de la maladie infectieuse, le besoin de cortisol endogène et d'insuline augmente. L'hyperinsulinémie témoigne également de la résistance à l'insuline des tissus corporels, ce qui est typique de tout processus inflammatoire actif, en particulier, spécifique. La détermination de la fonction glucocorticoïde des glandes surrénales avec tuberculose pulmonaire active permet de révéler la présence d'hypercorticisme chez la majorité des patients. Le taux normal de la concentration sanguine de cortisol chez le patient avec une inflammation infectieuse dans la période aiguë doit être considérée comme un échec relatif de la fonction glucocorticoïde du cortex surrénalien qui peut servir de base pour la tenue de doses thérapie de remplacement adéquat des glucocorticoïdes.

Près d'un tiers des patients atteints de tuberculose pulmonaire peuvent établir que le niveau d'insulinémie chez eux est assez faible et approche la limite inférieure de la norme, tandis que 13-20% observent une hyperinsulinisme significatif. L'hypo et l'hyperinsulinisme relatif sont tous deux des facteurs de risque élevés de développement de violations du métabolisme des glucides à divers degrés. Ces modifications de l'activité fonctionnelle des cellules B du pancréas nécessitent une surveillance régulière de la glycémie chez les patients atteints de tuberculose et une prévention rapide du diabète sucré. En plus. Ceci sert de justification supplémentaire à l'opportunité d'utiliser des doses physiologiques d'insuline dans la thérapie complexe de la tuberculose.

En général, les niveaux inférieurs d'hormones thyroïdiennes et leur déséquilibre hypercortisolémie et hyperinsulinisme plus portée chez les patients ayant cours sévère de processus tuberculeuse, avec des dommages pulmonaires et des symptômes graves d'intoxication de la tuberculose.

Diagnostic microbiologique de la tuberculose

Des études microbiologiques sont nécessaires pour identifier les patients atteints de tuberculose, vérifier le diagnostic, surveiller et corriger la chimiothérapie, évaluer les résultats du traitement, en d'autres termes, à partir du moment où le patient est inscrit à la tuberculose avant de le retirer.

Tous les programmes et projets épidémiologiques sont basés sur une évaluation du nombre d'excréteurs bactériens, ce qui ne peut être fait sans l'utilisation de méthodes de laboratoire pour détecter la mycobactérie tuberculeuse. Dans une enquête sur la population dite non organisée, le pourcentage d'envahisseurs bactériens atteint 70 ou plus, ce qui fait des méthodes de laboratoire un moyen suffisamment efficace pour identifier les patients tuberculeux dans ce groupe de population.

Les méthodes microbiologiques traditionnelles pour diagnostiquer la tuberculose sont des études bactérioscopiques et de culture. Les méthodes modernes considèrent la culture de mycobacterium tuberculosis dans des systèmes automatisés, la mise en place de la PCR. Cependant, toutes ces méthodes se combinent nécessairement avec des méthodes bactériologiques classiques.

Collection de matériel de diagnostic

L'efficacité des études de laboratoire dépend dans une large mesure de la qualité du matériel de diagnostic. Le respect des règles de collecte, de stockage et de transport du matériel diagnostique et la mise en œuvre exacte de l'algorithme d'évaluation du patient affectent directement le résultat et garantissent la sécurité biologique.

Pour tester sur la tuberculose, une variété de matériaux sont utilisés. En raison du fait que les lésions de forme la plus courante de la tuberculose, tuberculeuses le matériau de base pour la recherche et d'autres considèrent crachat types de trachéo détachable: sécrétions des voies respiratoires supérieures obtenues après inhalation d'aérosols: lavage bronchique; les rinçages broncho-alvéolaires; matériau obtenu par bronchoscopie, et des biopsies intrapulmonaire transtrachéaux des aspirations bronchiques, des tampons laryngés, des exsudats de plaies et de frottis al.

L'efficacité de la recherche augmente si une collecte contrôlée de matériel d'un patient est effectuée. A cet effet, une salle spécialement équipée est attribuée ou des taxis spéciaux sont achetés. La collecte de matériel est une procédure dangereuse, par conséquent, il est nécessaire de recueillir du matériel pour la recherche, en observant les règles de la sécurité infectieuse.

Le matériel pour les tests sur mycobacterium tuberculosis est recueilli dans des flacons stériles munis de bouchons bien vissés pour éviter la contamination de l'environnement et protéger le matériel collecté de la contamination.

Les flacons destinés à la collecte du matériel de diagnostic doivent satisfaire aux exigences suivantes:

• doit être fait de matériau résistant aux chocs;
• devrait facilement fondre pendant l'autoclavage;
• avoir un volume suffisant (40-50 ml):
• avoir une large ouverture pour la collecte des expectorations (diamètre d'au moins 30 mm);
• être facile à manipuler, transparent ou translucide, de sorte que vous puissiez évaluer la quantité et la qualité de l'échantillon collecté sans ouvrir le couvercle.

Pour obtenir des résultats de recherche optimaux, les conditions suivantes doivent être respectées:

• Recueillir le matériel avant le début de la chimiothérapie;
• le matériel pour l'étude doit être recueilli avant l'apport de nourriture et de médicaments du matin;
• Pour la recherche, il est souhaitable de recueillir au moins 3 échantillons de flegme matinal. Rassemblez les crachats pendant 3 jours consécutifs;
• le matériel collecté doit être livré au laboratoire dès que possible:
• dans le cas où il est immédiatement impossible de livrer le matériel au laboratoire, il est conservé au réfrigérateur à une température de l'air de 4 ° C pendant 48 heures au plus;
• Lors du transport du matériau, il est nécessaire de surveiller de près l'intégrité des flacons.

Les expectorations correctement collectées sont muqueuses ou mucopurulentes. Le volume optimal de l'expectoration testée est de 3 à 5 ml.

Les expectorations sont recueillies sous la supervision d'un professionnel de la santé. Les personnes responsables de la collecte des expectorations devraient suivre la mise en œuvre de certaines règles:

• il est nécessaire d'expliquer au patient le but de l'étude et la nécessité de cracher non pas la salive ou le mucus nasopharyngien, mais le contenu des voies respiratoires profondes. Cela peut être réalisé à la suite d'une toux productive qui se produit après plusieurs (2-3) respirations profondes. Il est également nécessaire d'avertir le patient qu'il doit se rincer la bouche avec de l'eau bouillie, pour enlever la partie principale de la microflore qui se développe dans la cavité buccale et les résidus alimentaires qui empêchent l'examen des expectorations;
• un travailleur médical participant à la collecte des expectorations, en plus d'un peignoir et d'un chapeau, doit porter un masque, des gants en caoutchouc et un tablier en caoutchouc;
• debout derrière le patient, il est recommandé de garder la bouteille le plus près possible de ses lèvres et de la séparer immédiatement en mucosités lorsqu'il tousse, et il faut prévoir que le flux d'air soit dirigé loin de l'agent de santé:
• À la fin de la collecte des expectorations, l'agent de santé doit soigneusement fermer le flacon avec un couvercle et évaluer la quantité et la qualité des expectorations recueillies. Ensuite, la bouteille est étiquetée et placée dans un bix spécial pour le transport au laboratoire.

Si le patient ne produit pas mucosités, la veille et tôt le matin le jour de la collecte du matériel nécessaire pour lui donner un expectorant :. Un extrait des racines de guimauve (mukaltin), bromhexine, ambroxol, etc. - ou appliquer une inhalation irritante utilisant un équipement installé dans la salle pour recueillir flegme. Le matériel ainsi collecté ne fait pas l'objet d'une conservation et devrait être examiné le jour de la collecte. Pour éviter son "abattage" dans le laboratoire dans le sens devrait faire une marque spéciale.

Si des études microbiologiques ne sont pas réalisées dans cette installation, le matériel diagnostique recueilli doit être livré de manière centralisée au laboratoire, à condition que le matériel soit conservé dans les intervalles entre les livraisons dans le réfrigérateur ou avec l'utilisation de conservateurs. Livrer le matériel au laboratoire dans des boîtes de transport, qui peuvent être facilement désinfectées. Chaque échantillon doit être muni de l'étiquette appropriée et le lot entier doit être rempli avec un formulaire d'accompagnement.

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Modes et fréquence d'examen des patients

Lors de l'examen initial, appelé diagnostic, du patient pour la tuberculose, il est nécessaire d'examiner au moins 3 portions d'expectorations pendant 2 ou 3 jours. Recueillies sous la supervision du personnel médical, ce qui augmente l'efficacité de la microscopie.

Le dépistage primaire de la tuberculose doit être effectué par tous les établissements de diagnostic médical du système de santé. Récemment, des centres de microscopie, équipés de microscopes modernes et d'équipements de sécurité épidémique, ont été organisés sur la base de laboratoires de diagnostic clinique pour améliorer l'efficacité de l'examen initial.

Dans les établissements de lutte contre la tuberculose, on utilise un test de dépistage qui comprend un examen des expectorations ou d'autres matériels diagnostiques pendant au moins 3 fois pendant 3 jours. Pendant le traitement, des études microbiologiques sont effectuées régulièrement au moins une fois par mois pendant la phase de chimiothérapie intensive. Au passage à la phase de traitement, les études sont réalisées moins souvent - avec un intervalle de 2-3 mois, tandis que la fréquence de l'étude est réduite à deux.

Caractéristiques de la collecte de matériel diagnostique pour la tuberculose extrapulmonaire

Feature matériel pathologique avec des formes extra-pulmonaires de la tuberculose - Mycobacterium tuberculosis faible concentration en elle, ce qui nécessite une des méthodes plus sensibles des études microbiologiques, principalement sur le milieu des techniques d'ensemencement.

Avec la tuberculose du système génito-urinaire, l'urine est le matériel d'étude le plus accessible. La collecte d'urine doit être effectuée par une infirmière spécialement formée.

Les organes génitaux externes sont lavés avec de l'eau avec du savon ou une solution faible de permanganate de potassium. L'ouverture externe de l'urètre est soigneusement traitée. Dans une fiole stérile, une partie moyenne de l'urine du matin est recueillie: chez les hommes, naturellement, chez les femmes, à l'aide d'un cathéter. L'urine du bassin rénal est recueillie dans des tubes stériles avec cathétérisme d'un ou deux reins, dans ce dernier cas - nécessairement séparément de chaque rein. Une petite quantité de cette urine est centrifugée, le sédiment est examiné.

Chez les hommes, les spermatozoïdes, les testicules ponctués, le secret de la prostate est soumis à une centrifugation pour obtenir un précipité. Avec n'importe quelle localisation d'un processus spécifique dans la région génitale chez les hommes, le massage de la prostate peut favoriser la sécrétion des sécrétions contenant mycobacterium tuberculosis.

Le sang menstruel chez les femmes est recueilli en suçant ou en utilisant un bouchon Kafka. Le matériel obtenu est débarrassé des globules rouges, lavé avec de l'eau distillée suivie d'une centrifugation. Le précipité est examiné.

Les allocations provenant du canal cervical de l'utérus sont recueillies dans une certaine capacité de Kafka ou capuchon, c'est-à-dire, il est souhaitable d'accumuler 1-2 ml de matériel pathologique.

Matériel obtenu à partir d'interventions chirurgicales sur les reins, les organes génitaux. Avec des biopsies, des raclures de l'endomètre, homogénéiser. Pour ce faire, il est placé dans un mortier stérile et soigneusement écrasé avec des ciseaux stériles. A cette suspension, on a ajouté du sable de rivière stérile en une quantité égale à son poids, puis rechargé avec une solution de chlorure de sodium isotonique 0,5-1.0 ml, et tout a été trituré jusqu'à ce qu'une masse pâteuse avec l'addition d'une solution de chlorure de sodium isotonique (4-5 ml). Ensuite, on laisse la masse se déposer pendant 1-1,5 minutes, le surnageant est examiné.

Tuberculose des os et des articulations. Le punctate (pus d'abcès) obtenu avec une seringue stérile est placé dans des boîtes stériles et immédiatement livré au laboratoire. Pipette stérile, préalablement humidifiée avec une solution de chlorure de sodium isotonique stérile, prendre 2-5 ml de pus, le transférer dans une bouteille de perles et ajouter un autre 2-3 ml de solution de chlorure de sodium isotonique. La bouteille est fermée avec un bouchon et secouée dans un joker pendant 8 à 10 minutes. La suspension homogénéisée est examinée.

Dans les formes fistuleuses de la tuberculose ostéo-articulaire, le pus de la fistule est pris. La décharge copieuse est recueillie directement dans un tube à essai. Dans les cas de fistule pyorrhée maigre lavée avec une solution de chlorure de sodium isotonique stérile, et les liquides de lavage ont été recueillis dans un tube à essai, ou la pièce de tampon imprégné de pus envoyé pour analyse.

Le matériel chirurgical obtenu au cours des interventions chirurgicales sur les os et les articulations peut comprendre des masses purulentes-nécrotiques, des granulations, du tissu cicatriciel, du tissu osseux, du tissu de la membrane synoviale et d'autres substrats. Son traitement est effectué, comme dans la tuberculose des reins.

L'étude microbiologique du liquide synovial dans une solution de citrate de sodium à 3% (rapport 1: 1) pour prévenir la coagulation est effectuée immédiatement après la ponction.

Tuberculose des ganglions lymphatiques. Le pus, extrait lors de la ponction des ganglions lymphatiques, est également examiné. Comme le pus des abcès. Les tissus des ganglions lymphatiques obtenus lors d'interventions chirurgicales, biopsies, sont examinés, comme d'autres formes de tuberculose.

L'étude des masses de selles sur mycobacterium tuberculosis est extrêmement rare, en raison de l'absence presque totale de résultats positifs.

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Microscopie à Mycobacterium

La microscopie des expectorations est une méthode relativement rapide, simple et peu coûteuse qui devrait être utilisée dans tous les cas de suspicion de tuberculose. En outre, cette étude est menée pour évaluer l'efficacité de la chimiothérapie et pour vérifier la récupération ou l'échec du traitement s'il n'y a pas de test de culture.

Deux méthodes d'examen microscopique sont utilisées:

• méthode de microscopie directe, lorsqu'un frottis est préparé directement à partir du matériel de diagnostic;
• méthode de microscopie d'un sédiment préparé à partir d'un matériau traité par décontamination pour la culture.

La première méthode est utilisée dans les laboratoires où seules des études microscopiques sont effectuées (laboratoires cliniques et de diagnostic du réseau médical général).

Les meilleurs résultats de l'examen microscopique sont obtenus en concentrant le matériel de diagnostic (par exemple, par centrifugation).

Pour détecter mycobacterium tuberculosis avec une probabilité de 50% lors de la réalisation de la microscopie, 1 ml d'expectorations devrait contenir plus de 5000 cellules microbiennes. L'expectoration des patients atteints de tuberculose pulmonaire contient généralement une quantité importante de bactéries acido-résistantes, ce qui permet de les détecter de manière fiable par bactérioscopie. La sensibilité diagnostique de cette méthode peut être améliorée en examinant plusieurs échantillons d'expectorations d'un patient. Un résultat négatif d'un examen bactérioscopique n'exclut pas le diagnostic de tuberculose, car l'expectoration de certains patients contient moins de mycobactéries que ce qui peut être détecté par microscopie. Une mauvaise préparation du frottis d'expectoration peut également entraîner un résultat négatif d'un examen bactérioscopique.

La méthode la plus commune pour la détection des mycobactéries acido-résistantes dans le frottis est la couleur selon Tsiol-Nelsen. La méthode est basée sur la pénétration de la fuchsine phénolique dans une cellule microbienne à travers une membrane qui comprend une couche de lipides cireux, tout en chauffant simultanément et une forte action de gravure du phénol. Une décoloration subséquente du frottis avec une solution à 25% d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique à 3% entraîne la décoloration de toutes les structures non acido-résistantes. Les éléments décolorés du frottis sont colorés avec une solution à 0,3% de bleu de méthylène. Les mycobactéries ne perçoivent pas les colorants à l'aniline habituels, à cause desquels les mycobactéries acido-résistantes sont colorées en rouge cramoisi, et d'autres microbes et éléments cellulaires - en bleu.

Pour les frottis colorés par Ziehl-Nelsenu utiliser microscope binoculaire lumière avec un objectif à immersion d'huile (90- ou une augmentation de 100 fois) et l'oculaire de la 7- ou un grossissement de 10 fois. Explorez 100 champs de vision, ce qui est suffisant pour identifier les mycobactéries uniques dans le frottis. Dans le cas où le résultat d'une telle étude est négatif, pour confirmation, il est recommandé de voir 200 autres champs de vision. Enregistrer les résultats, en indiquant le nombre de bacilles acido-résistants détectés (KUM).

En plus de cette technique, les fluorochromes de couleur sont utilisés pour la microscopie luminescente, ce qui permet d'obtenir les meilleurs résultats. L'utilisation de cette méthode augmente l'efficacité de la microscopie de 10-15%. Lors du traitement de mycobactéries avec des colorants luminescents (auramine, rhodamine, etc.), ces substances se lient également aux structures en forme de cire de la cellule microbienne. Lors de l'irradiation de cellules colorées avec une source de lumière excitante (un certain spectre de rayonnement ultraviolet), ils commencent à briller avec une lumière orange ou rouge vif sur un fond noir ou vert foncé. En raison de la forte luminosité et du contraste de l'image visible, le grossissement global du microscope peut être réduit de 4 à 10 fois, le champ de vision s'élargit et le temps de vision de la préparation diminue. Parallèlement à cela, en raison de la plus grande profondeur de champ, vous pouvez augmenter le confort de l'étude.

Lorsque la microscopie à fluorescence est utilisée pour visualiser la même zone, le frottis est beaucoup moins long qu'avec la microscopie optique de la coloration de Tsiol-Nelsen. Si pendant un jour de travail, un microscope examine environ 20 à 25 frottis, il peut, avec l'aide de la microscopie à fluorescence, examiner plus de 60 à 80 échantillons en même temps. Les microscopistes expérimentés savent que la coloration des cellules avec un mélange d'auramine et de rhodamine est en quelque sorte spécifique pour les bacilles acido-résistants, qui dans ce cas ressemblent à des bâtonnets dorés. Les saprophytes sont peints dans une couleur verdâtre.

Un autre avantage important de la méthode de microscopie à fluorescence - la capacité à détecter modifié mycobactérie, perdu sous l'influence de facteurs défavorables, notamment une chimiothérapie intensive, la propriété kislotousotoychivosti et ne sont pas détectés dans le cadre de cette coloration Ziehl-Nelsenu.

Les inconvénients de la méthode de microscopie à fluorescence comprennent le coût relativement élevé du microscope et son fonctionnement. Cependant, dans les grands laboratoires centralisés ou autres, où la charge dépasse la norme de 3 techniciens de laboratoire travaillant avec trois microscopes conventionnels, il est moins cher d'utiliser un microscope fluorescent à la place.

Les méthodes bactérioscopiques ont une spécificité plutôt élevée (89-100%). Environ 97% des résultats positifs obtenus par n'importe quelle méthode de microscopie sont confirmés sans ambiguïté par les résultats du semis.

Il convient de noter que lors de l'examen microscopique du frottis de matériel pathologique, il est impossible de déterminer l'espèce appartenant aux mycobactéries acido-résistantes identifiées. Méthode de microscopie permet de donner une opinion sur la présence ou l'absence d'acide dans la préparation des micro-organismes, ce qui peut être expliqué par l'existence dans la nature d'un grand nombre de morphologiquement semblables à tuberculeuses mycobactéries micro-organismes résistants complexes d'acide non tuberculeuse.

Les résultats de la microscopie sont évalués en unités semi-quantitatives.

Afin de pouvoir comparer les résultats de différentes méthodes de microscopie, des coefficients empiriques sont introduits. Par exemple, pour comparer les résultats des frottis colorés avec des colorants fluorescents, les données microscope optique de recherche (grossissement 1000 fois), il est nécessaire de diviser le nombre de bacilles acido-résistants détecté par le microscope à fluorescence, le coefficient correspondant à un grossissement de 250 fois - à 10, 450 fois - à 4, avec 630 fois - à 2.

Caractéristiques de la microscopie pour la tuberculose extrapulmonaire

La microscopie directe est réalisée, ainsi que la microscopie des frottis préparés après enrichissement, suivie d'une coloration de Tsiol-Nelsen ou de colorants luminescents. La microscopie directe des frottis est inefficace en raison d'une faible concentration de mycobactéries dans le matériel, et il est donc plus rationnel d'utiliser des méthodes d'enrichissement. Le plus efficace est la centrifugation. Si le matériel biologique est visqueux, la centrifugation est utilisée avec une homogénéisation et une liquéfaction simultanées du matériau, qui est effectuée en utilisant des centrifugeuses à grande vitesse avec une force de centrifugation de 3000 g et des solutions d'hypochlorite. D'autres méthodes d'enrichissement, telles que la micro-flottation, ne sont actuellement pas utilisées en raison de la formation d'aérosols biologiquement dangereux.

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La méthode culturelle du diagnostic de la tuberculose

La méthode d'ensemencement, ou la méthode de culture, est plus sensible que la microscopie des frottis et présente un certain nombre d'avantages par rapport à celle-ci. Il permet de détecter plusieurs douzaines de mycobactéries viables dans le matériel d'essai et a une grande valeur diagnostique. Ceci est particulièrement important lors de l'examen d'un matériel provenant de patients nouvellement diagnostiqués ou traités qui libèrent une petite quantité de mycobactéries.

Comparée à la microscopie, la recherche sur la culture permet d'augmenter le nombre de patients TB diagnostiqués par plus de 15-25%, ainsi que de vérifier la tuberculose dans les stades précoces, lorsque la maladie peut encore être traitée. Un avantage très important du test de culture est la possibilité d'obtenir une culture excitatrice qui peut être identifiée et étudiée en ce qui concerne la sensibilité aux médicaments, la virulence et d'autres propriétés biologiques.

Les inconvénients des méthodes de culture comprennent leur durée (le temps d'attente des matériaux atteint 10 semaines). Coût plus élevé, la complexité du traitement du matériel de diagnostic.

Principes du traitement de présemis du matériel diagnostique

Les méthodes microbiologiques conventionnelles ne peuvent pas être utilisées pour mener des études sur la tuberculose. C'est dû au fait. Que mycobacterium tuberculosis se développe très lentement, et la plupart des échantillons cliniques contiennent des micro-organismes pyogènes et putréfiants à croissance rapide, des champignons. Leur croissance rapide sur des milieux riches en nutriments interfère avec le développement de mycobactéries et ne permet pas d'isoler l'agent causal de la tuberculose, de sorte que le matériel diagnostique doit être prétraité avant l'ensemencement. En outre, les mycobactéries libérées par les voies respiratoires du patient sont généralement entourées d'une grande quantité de mucus, ce qui les rend difficiles à concentrer. À cet égard, avant de planter des expectorations et d'autres matériaux similaires, leur liquéfaction, la décontamination est nécessaire.

Tous les détergents et les décontamines ont un effet toxique plus ou moins prononcé sur les mycobactéries. À la suite du traitement, jusqu'à 90% des mycobactéries peuvent mourir. Pour garder assez de la population mycobactérienne, épargnant la nécessité d'utiliser des techniques de traitement qui permettent, d'une part, de supprimer les bactéries pyogènes croissance rapide et putride, et de l'autre - pour préserver la viabilité des mycobactéries présentes dans le matériau.

En fonction du matériau, de son degré d'homogénéité et de la pollution pour le pré-traitement en utilisant divers décontaminant: expectorations - 4% d'une solution d'hydroxyde de sodium, des solutions trohzameschonnogo phosphate de sodium à 10%, le chlorure de benzalkonium, le phosphate trisodique, NALC-NaOH (N-acétyl-L-cystéine l'hydroxyde de sodium) à une concentration finale de 1% de NaOH dans l'urine et d'autres matières liquides - solution d'acide sulfurique à 3%, pour les échantillons contaminés, des matières contenant de la graisse - solution d'acide oxalique à 5%. En outre, dans certains cas, des enzymes, des tensioactifs (détergents) sont utilisés. L'application des détergents Tween et un autre mort mycobactérienne est accompagnée de moins de cellules (40-50% survivent). Cependant, ils ne peuvent être utilisés que pour des matériaux liquides. La plus grande distribution au monde était NALC-NaOH. Produit dans des ensembles. Cette méthode permet d'allouer plus de 85% de la population de cellules mycobactériennes. Décontamination solides tkanesoderzhaschih plus difficiles à deviner, car le degré de dispersion du matériau pendant l'homogénéisation difficile. Par exemple, le traitement des biopsies des ganglions lymphatiques s'accompagne souvent d'une fréquence accrue de contamination par la flore étrangère. Dans ce cas, 1% d'etonium peut être utilisé.

Le matériau non homogène est homogénéisé avec des billes de verre en présence de décontaminants. Les matières liquides sont pré-centrifugées et seul un précipité est traité.

Techniques de semis et d'incubation

Après prétraitement, le matériel est centrifugé, ce qui précipite les mycobactéries et augmente leur teneur dans les sédiments («enrichissement des boues»). Le précipité résultant est neutralisé et inoculé (inoculé) avec un milieu nutritif dense ou des tubes avec un milieu liquide (semi-liquide). Du reste des sédiments, les frottis sont préparés pour un examen microscopique. La technique d'ensemencement devrait empêcher la contamination croisée du matériel de diagnostic.

Pour une interprétation clinique fiable des résultats d'une étude microbiologique, la règle suivante doit être observée: des études microscopiques et de culture doivent être effectuées en parallèle à partir du même échantillon de matériel diagnostique.

Les tubes inoculés sont placés dans un thermostat à 37 ^° C pendant 2 jours en position horizontale. Ceci assure une absorption plus uniforme du matériau dans le milieu de culture. Après 2 jours, les tubes sont transférés en position verticale et scellés hermétiquement avec des bouchons en caoutchouc ou en silicone pour empêcher le séchage des médias semés.

Les cultures sont incubées à 37 ^sur les C pendant 10-12 semaines avec l' affichage hebdomadaire. Pour chaque aperçu, les paramètres suivants sont enregistrés:

• la période observée visuellement depuis le jour de la croissance des semis;
• taux de croissance (nombre d'UFC);
• la contamination de la culture par une flore microbienne ou des champignons étrangers (ces tubes sont enlevés);
• manque de croissance visible. Les tubes sont laissés dans le thermostat jusqu'à la prochaine visualisation.

Média nutritif

Divers milieux nutritifs sont utilisés pour la culture de mycobactéries; dense, semi-liquide, liquide. Cependant, aucun des milieux nutritifs connus n'a des propriétés qui assurent la croissance de toutes les cellules mycobactériennes. En relation avec cela, il est recommandé d'utiliser simultanément 2-3 milieux nutritifs de composition différente pour augmenter l'efficacité.

L'OMS recommande l'environnement de Levenstein-Jensen comme milieu standard pour l'isolement primaire de l'agent causal de la tuberculose et pour déterminer sa sensibilité aux médicaments. Il s'agit d'un environnement d'œufs dense sur lequel la croissance des mycobactéries est obtenue au 20ème-25ème jour après l'ensemencement d'un matériau bactério-positif. Les cultures de matériel bactérioscopiquement négatif nécessitent une période d'incubation plus longue (jusqu'à 10-12 semaines).

Dans notre pays, le projet E.R. Environnement des œufs Finn Finn-II. Il diffère en ce que, au lieu de L-asparagine, il utilise le glutamate de sodium, qui déclenche d'autres façons de synthétiser les acides aminés des mycobactéries. La croissance apparaît sur ce milieu un peu plus tôt, et la fréquence d'attribution des mycobactéries est de 6 à 8% plus élevée que dans le milieu Lowenstein-Jensen.

Pour améliorer l'efficacité du diagnostic bactériologique de la tuberculose extrapulmonaire, il est conseillé d'inclure les milieux Finn-II modifiés dans le complexe de milieux nutritifs. Pour accélérer la croissance, un thioglycolate de sodium à 0,05%, qui réduit la concentration d'oxygène, est ajouté en plus au milieu nutritif Finn-II. Pour protéger les systèmes enzymatiques des mycobactéries des produits toxiques de la peroxydation des lipides dans le milieu nutritif Finn-II, de l'acétate d'α-tocophérol antioxydant est ajouté à une concentration de 0,001 μg / ml. L'ensemencement du matériel de diagnostic est effectué selon la procédure standard.

Dans les laboratoires antituberculeux de Russie, d'autres modifications des milieux nutritifs denses sont également utilisées; proposition G.G. Milieu nutritif mordovien "New", développé par V.A. Milieux nutritifs aniciques A-6 et A-9, etc.

En raison du fait que dans le processus de la chimiothérapie est des dommages à divers systèmes métaboliques des cellules microbiennes, une population mycobactérienne perd la capacité de se développer normalement dans des milieux nutritifs conventionnels et exige équilibre osmotique (ou semi-liquide) milieux de culture.

Évaluation et enregistrement des résultats de l'ensemencement du matériel de diagnostic

Certaines souches et espèces de mycobactéries se développent lentement, la croissance peut même apparaître au 90ème jour. Le nombre de ces cultures est faible, mais cela permet de résister aux cultures dans un thermostat pendant 2,5-3 mois.

Les cultures virulentes de mycobacterium tuberculosis se développent habituellement sur des environnements d'œufs denses sous la forme de colonies de formes R de différentes tailles et espèces. Colonies sèches, ridées, ivoire, légèrement pigmentées. Dans d'autres milieux, la colonie de mycobacterium tuberculosis peut être plus humide. Après une cure de chimiothérapie ou pendant le traitement, des colonies lisses à croissance humide (formes S) peuvent être attribuées.

Lors de l'isolement des cultures, un ensemble d'études spéciales est utilisé pour distinguer mycobacterium tuberculosis des mycobactéries non tuberculeuses et des saprophytes résistants aux acides.

Une réponse positive est donnée après un examen microscopique obligatoire du frottis de Tsiol-Nelsen coloré provenant des colonies cultivées. Dans le cas de la croissance de mycobactéries dans des frottis, on trouve des bâtonnets rouges vifs qui se trouvent seuls ou en groupes formant des grappes sous la forme de feutre ou de tresses. Chez les jeunes, en particulier les cultures isolées d'un traitement à long terme des patients atteints de la chimiothérapie, mycobactéries diffèrent le polymorphisme exprimé, jusqu'à ce que la présence de forme de tige, ainsi que des versions courtes, presque coccoid ou allongées qui ressemblent à mycelium.

Le taux de croissance des mycobactéries est indiqué par le schéma suivant: (+) - 1-20 ufc in vitro (excrétion bactérienne insuffisante); (++) - 20-100 UFC in vitro (excrétion bactérienne modérée); (+++) -> 100 UFC in vitro (excrétion bactérienne abondante). Dans le diagnostic de tuberculose en laboratoire, il ne suffit pas de savoir si la mycobactérie est détectée par l'une ou l'autre méthode. Avoir une compréhension détaillée de l'étendue et de la nature de la population mycobactérienne, de sa composition et de ses propriétés. Ce sont ces données qui nous permettent d'interpréter correctement l'état du processus, de planifier des tactiques et de corriger le traitement en temps opportun.

Ces dernières années, pour accélérer la croissance des mycobactéries, des milieux nutritifs à base d'agar avec divers additifs de croissance et l'utilisation d'un mélange gazeux spécial ont été proposés. Pour obtenir la croissance de mycobactéries sur ces milieux, pendant la culture, une atmosphère avec une teneur élevée en dioxyde de carbone (4-7%) est créée. Des incubateurs spéciaux au CO ₂ sont utilisés à cette fin . Cependant, les systèmes automatisés les plus développés pour la culture de mycobactéries: MGIT-BACTEC-960 et MB / Bact.

Un tel système - système MGIT (tube indicateur de croissance de mycobactéries), qui fait référence au développement de la haute technologie et destiné à un diagnostic bactériologique rapide de la tuberculose et de la sensibilité Mycobacterium aux médicaments de première ligne, et certains médicaments de deuxième ligne. MGIT se concentre sur son utilisation dans le cadre de l'appareil VASTES-960. Les microorganismes sont cultivés dans des tubes spéciaux avec un milieu nutritif liquide basé sur le milieu Middlebrook-7H9 modifié. Pour stimuler la croissance des mycobactéries et supprimer la croissance de la microflore externe, MGIT Growth Supplement et un mélange de médicaments antibactériens PANTA sont utilisés.

La croissance des micro-organismes est enregistrée optiquement. Il est basé sur la fluorescence, qui se produit lorsque l'oxygène est consommé par les mycobactéries au cours de la croissance. Le colorant fluorochrome dépendant de l'oxygène se trouve sur le fond d'un tube à essai spécial et recouvert d'une couche de silicone. Reproduction mycobactéries conduit à une diminution de la quantité d'oxygène dans le tube et réduire la concentration qui provoque une augmentation de la fluorescence, qui devient visible sous irradiation par des tubes de lumière ultraviolette et intégrée Les déchets-960 appareil automatiquement enregistré photocapteur. L'intensité de la luminescence est enregistrée en unités de croissance (unités de croissance GU). Les données de croissance sont enregistrées dans l'ordinateur, où elles peuvent être sauvegardées automatiquement. L'analyse par ordinateur des courbes de croissance peut fournir des informations sur la présence de divers pools de mycobactéries, y compris la non-tuberculose, et permet également d'évaluer les propriétés de croissance des mycobactéries.

À la suite de l'introduction de tels systèmes, la période de croissance des mycobactéries a diminué significativement, en moyenne 11 jours sur VASTES-960 et 19 jours sur MB / Bact contre 33 jours sur un milieu nutritif dense standard. Il convient de noter que ces systèmes nécessitent un personnel hautement qualifié. Le semis du matériel sur milieu liquide s'accompagne nécessairement d'un semis sur le milieu de Levenstein-Jensen, qui joue le rôle de duplicateur dans les cas où le mycobacterium tuberculosis ne donne pas naissance à d'autres milieux.

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Détermination de la sensibilité aux médicaments des mycobactéries

La détermination du spectre et du degré de sensibilité des mycobactéries aux médicaments antituberculeux est d'une grande importance clinique, de même que pour l'évaluation épidémiologique de la propagation de la tuberculose avec résistance aux médicaments. En outre, le suivi de la pharmacorésistance permet d'évaluer l'efficacité du programme antituberculeux dans son ensemble, étant un indicateur intégral de la performance de toutes les composantes des activités antituberculeuses.

Multiplicité et calendrier de la sensibilité aux médicaments:

• avant le début du traitement une fois pour déterminer la stratégie et les tactiques de traitement:
• Lorsqu'elles sont isolées de cultures malades à partir de divers matériaux (expectoration, liquide BAL, urine, exsudats, liqueur, etc.), toutes les souches isolées sont examinées:
• à la fin de la phase intensive de traitement en l'absence de dynamique clinique et radiologique:
• s'il est nécessaire de changer le schéma thérapeutique dans les cas suivants:
  • absence de frottis d'expectoration;
  • ré-isolement de culture après frottis d'expectoration négatif;
  • une augmentation drastique du nombre de CMU dans l'écouvillon après le déclin initial. Il est bien connu que les souches de mycobacterium tuberculosis, qui sont hétérogènes en termes de sensibilité aux médicaments, sont isolées du matériel provenant d'un patient atteint de tuberculose. La sensibilité des souches aux médicaments antituberculeux peut différer dans l'éventail des médicaments, le degré, la fréquence et le taux de résistance.

Le degré de pharmacorésistance de mycobacterium tuberculosis est déterminé selon des critères établis qui sont orientés vers la signification clinique de la résistance et dépendent de l'activité antituberculeuse du médicament, de sa pharmacocinétique, de sa concentration dans le foyer lésionnel. La dose thérapeutique maximale et ainsi de suite.

La détermination de la sensibilité aux médicaments des mycobactéries est actuellement effectuée par des méthodes microbiologiques:

• Concentrations absolues (méthode de dilution sur milieu nutritif dense ou liquide),
• proportions,
• coefficient de résistance.

Généralement, la stabilité se manifeste par la croissance des colonies visuellement observable de Mycobacterium tuberculosis, mais il existe des techniques qui induisent les premières étapes de la croissance des cellules en division de Mycobacterium sous la forme d'une réaction colorée. Ces méthodes raccourcissent le temps de test de 3-4 à 2 semaines.

Comme unifié en Russie a été étendue, recommandée par la méthode de la chimiothérapie Comité OMS des concentrations absolues, ce qui est d'un point de vue méthodologique, est le plus simple, mais il nécessite une grande précision et la standardisation des procédures de laboratoire. Le test de sensibilité aux médicaments consiste en un ensemble de tubes à essai avec un milieu nutritif modifié avec des médicaments antituberculeux. L'ensemble se compose de 2-3 tubes avec différentes concentrations de chacun des médicaments utilisés, l'un des tubes témoins sans médicament à l'environnement et un tube contenant 1000 ug / mL sodium Sali tsilovokislogo ou 500 ug / ml non tuberculeuse acide paranitrobenzoynoy pour détecter la croissance des mycobactéries.

Pour préparer un ensemble de milieux avec des préparations, un milieu de Levenstein-Jensen modifié (sans amidon) est utilisé, qui est versé dans des flacons. Dans chacun des flacons, un volume spécifique de dilution appropriée de la préparation antituberculeuse est ajouté. Le contenu des flacons est soigneusement mélangé, versé dans des tubes et plié en position inclinée pendant 40 minutes à une température de 85 ° C. Il est recommandé de bobiner le milieu dans une rebobineuse électrique avec contrôle automatique de la température. Mercredi avec des médicaments antituberculeux

Les séries 1-er peuvent être conservées au réfrigérateur à 2-4 ° C pendant 1 mois, avec des préparations de la deuxième rangée - pas plus de 2 semaines. Le stockage de milieux avec des préparations à température ambiante est inacceptable. Lors de la préparation de solutions de médicaments antituberculeux, leur activité est prise en compte, en calculant la concentration ajustée pour le poids moléculaire de la partie non spécifique de la préparation, la pureté, etc. Pour déterminer la sensibilité aux médicaments, seules des substances chimiquement pures sont utilisées.

Le principe de la méthode est de déterminer la concentration d'un médicament antituberculeux qui inhibe la croissance d'une partie importante de la population mycobactérienne. Si c'est fait correctement, cette méthode a une bonne fiabilité.

Avant le test, il est nécessaire de s'assurer que la culture isolée de mycobacterium tuberculosis n'a pas de microflore étrangère. A partir de la culture de mycobactéries dans une solution de chlorure de sodium à 0,9%, on prépare une suspension homogène contenant 500 millions de corps microbiens par ml (standard de turbidité optique de 5 unités). La suspension résultante est diluée avec une solution de chlorure de sodium à 0,9% (1:10) et 0,2 ml de suspension est ajouté à chaque tube de l'ensemble de milieux de culture. Les tubes ensemencés sont placés dans un thermostat à 37 ° C et maintenus dans une position horizontale pendant 2-3 jours de sorte que la surface inclinée du milieu de culture est uniformément inoculée avec la suspension de mycobacterium tuberculosis. Les tubes sont ensuite transférés en position verticale et incubés pendant 3-4 semaines. Les résultats sont enregistrés après 3-4 semaines.

Puisque le moment de l'excrétion excrétoire du matériel clinique sur les milieux nutritifs est d'au moins 1-1,5 mois, les résultats de la détermination de la sensibilité au médicament par cette méthode peuvent être obtenus au plus tôt 2-2,5 mois après le semis du matériel. C'est l'un des principaux inconvénients de la méthode.

Interpréter les résultats de la détermination de la sensibilité aux médicaments des mycobactéries sur la base de certains critères. Sur les milieux de culture solide est considéré comme sensible à la concentration du médicament qui est contenu dans le milieu, si le nombre de colonies de mycobactéries cultivées in vitro avec ce médicament est pas plus de 20 avec une croissance abondante dans le tube de commande sans médicaments. Seulement en présence de plus de 20 colonies, la culture est considérée comme résistante à cette concentration. En pratique, lorsque l'obtention de la croissance conduit à des tubes à essai proches de 20 cfu. Il est nécessaire de signaler à l'unité clinique que la sensibilité ou la résistance est dans ce cas limite, car elle peut parfois expliquer la dynamique floue des indicateurs cliniques.

Pour divers médicaments on établit une certaine concentration, à laquelle on observe la reproduction de la proportion critique de la population mycobactérienne. Ces concentrations sont dites "critiques". En tant que critère de stabilité, la croissance de la population de mycobactéries sur un milieu nutritif avec une préparation à une concentration critique est utilisée.

Dans la pratique de la tuberculose domestique, pour déterminer la résistance aux médicaments, ils ne se limitent pas à déterminer uniquement les concentrations critiques. C'est dû au fait. Que le niveau de définition étendue de la résistance aux médicaments permet au clinicien de positionner plus précisément la chimiothérapie tactique en utilisant les connaissances de potentialiser l'action des associations de médicaments, Croisillon résistance attendue ou d'appliquer un groupe de médicaments plus efficace utilisé des médicaments antituberculeux.

La méthode de concentration absolue est la plus simple, mais elle est aussi la plus sensible aux erreurs commises lors de l'exécution. Plus fiable, en particulier dans la détermination de la sensibilité aux médicaments de deuxième ligne, et commun à l'extérieur de la Russie est la méthode des proportions. Il prend en compte les lacunes de la méthode des concentrations absolues, mais dans l'exécution c'est plus laborieux.

La méthode est très similaire à la méthode de concentration absolue. La préparation de tubes à essai avec des médicaments est effectuée de la même manière. Comme dans la méthode de concentration absolue. Cependant, la dose de semence de la suspension de mycobacterium tuberculosis est réduite d'un facteur 10. Ce qui élimine la fréquence de la résistance spontanée de certaines souches de mycobacterium tuberculosis à des médicaments tels que l'Etambutol, le protionamide, la capréomycine. Comme témoin, 2 ou 3 tubes avec une dose de semence égale dans les tubes à essai, successivement dilués 10 et 100 fois, sont utilisés. Le critère de stabilité est la proportion de croissance visuellement observée de mycobacterium tuberculosis. Pour les médicaments de la 1ère série, le critère de stabilité est l'excès de croissance de 1% de la population initiale, pour les médicaments de la deuxième rangée - une augmentation de 1 ou plus de 10% de l'initiale, en fonction de la concentration critique choisie.

En 1997, un groupe de travail de l'OMS et l'Union internationale pour l'identification de la bonne résistance aux antituberculeux de la tuberculose a fait des ajustements à ces critères, offrant mycobactéries résistants considérés, qui poussent sur un support d'oeuf solide Lowenstein-Jensen aux concentrations suivantes:

• dihydrostreptomycine - 4 μg / ml;
• isoniazide 0,2 μg / ml:
• rifampicine 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

En 2001, des concentrations critiques ont été proposées pour les médicaments de deuxième intention suivants (pour une proportion critique de 1%):

• la capréomycine - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• la kanamycine - 30 ug / ml;
• viomycine - 30 mcg / ml;
• la cyclosérine 40 ug / ml;
• acide aminosalicylique - 0,5 μg / ml;
• ofloxacine - 2 μg / ml.

Les résultats de croissance sont évalués après 4 semaines au préalable et après 6 semaines de culture - en dernier.

Pour déterminer la sensibilité du médicament au pyrazinamide, qui est largement utilisé dans la chimiothérapie moderne pour la tuberculose, la concentration critique recommandée est de 200 μg / ml. Cependant, il n'existe toujours pas de méthode généralement acceptée pour déterminer la résistance du médicament à ce médicament sur des milieux nutritifs solides, puisque son activité antibactérienne ne se manifeste que dans un milieu acide (pH <6), techniquement difficile à maintenir. En outre, de nombreuses cultures cliniques de mycobactéries tuberculeuses se développent à contrecœur sur des environnements d'œufs avec un environnement acide.

Pour évaluer la qualité des résultats de la détermination de la sensibilité aux médicaments des mycobactéries, il est recommandé de surveiller chaque nouveau lot de Levenstein-Jensen par une détermination parallèle de la sensibilité de la souche muséale standard H37Rv. De plus, certains critères microbiologiques doivent être maintenus pour que les techniques donnent un résultat bien reproductible et correctement interprété. Ceux-ci comprennent la viabilité de la culture de mycobacterium tuberculosis, les règles pour l'obtention d'une suspension et suspension homogène, les règles de sélection des cultures de mycobacterium tuberculosis, la représentativité de la masse bactérienne sélectionnée. La fiabilité de la détermination de la résistance aux médicaments diminue avec une libération bactérienne extrêmement rare.

Récemment, une méthode pour déterminer la sensibilité aux médicaments en utilisant des systèmes automatisés a été considérée prometteuse. Les plus perfectionnés dans ce domaine sont les développements basés sur VASTES MGIT-960. Dans ce cas, la sensibilité au médicament de mycobacterium tuberculosis est déterminée sur la base d'une méthode de proportions modifiée. Dans le processus de détermination, le taux de croissance de mycobacterium tuberculosis dans un tube témoin et dans des tubes à essai avec des médicaments est comparé. Pour déterminer la sensibilité à la streptomycine, à l'isoniazide, au rifamp picin et à l'éthambutol, des compléments d'enrichissement et des antibiotiques inclus dans le kit SIRE sont utilisés. Pour déterminer la sensibilité au pyrazinamide, utilisez le kit PZA. Au cours de l'essai de suspension des tubes à essai inoculés Mycobacterium tuberculosis avec des médicaments, ainsi que les tubes de commande de suspension reconstituée 100 fois pour tous les médicaments, à l'exception du pyrazinamide, dans lequel la suspension est une dilution de 10 fois. Le critère de stabilité est l'indicateur de croissance des mycobactéries de 100 GU lorsque la croissance est atteinte dans le tube témoin 400 GU (voir "Méthodes de culture pour isoler les mycobactéries"). La comptabilisation et l'interprétation des résultats sont effectuées automatiquement et sont définies par l'entrée ou le programme sélectionné.

En tant que concentrations critiques, les concentrations finales sont utilisées dans un tube à essai avec un milieu nutritif liquide. À l'heure actuelle, des concentrations critiques ont été établies pour les médicaments de première et de deuxième intention. Il convient de noter que la sensibilité de la mycobactérie tuberculeuse à la cyclosérine et à l'acide aminosalicylique est déterminée uniquement sur les milieux nutritifs des œufs.

Elaborer système décrit de protocole de travail permet d'étudier la sensibilité aux médicaments en tant que culture (milieu riche en nutriments) dédié, et en utilisant le primaire Mycobacterium MGIT croissance in vitro. Cette dernière option réduit considérablement le temps de la culture, ce qui vous permet d'obtenir les résultats complets de la culture de Mycobacterium tuberculosis (y compris des informations sur la sensibilité aux médicaments) après 3 semaines à compter de la date de la collecte de la matière, alors que la méthode traditionnelle, il est possible d'obtenir seulement le 3ème mois. Avec le temps, les résultats obtenus, lorsque le patient est en phase intensive de traitement, peuvent compenser le coût relativement élevé de la recherche.

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Différenciation des mycobactéries

Tenant compte du fait que les milieux nutritifs utilisés ne sont pas strictement sélectifs. La différenciation ultérieure des mycobactéries isolées est reconnue comme obligatoire. La nécessité d'une différenciation des mycobactéries est due à un certain nombre de caractéristiques des processus pathologiques causés par le genre: bien sûr différent et les résultats de la tuberculose et les mycobactérioses, la présence de la résistance aux médicaments naturels à certains médicaments antituberculeux.

Il est reconnu que l'identification primaire du complexe Mycobacterium tuberculosis M. Non tuberculeuse de mycobactéries est réalisée par les caractéristiques suivantes: le taux de croissance sur des milieux nutritifs solides, la pigmentation, la morphologie des colonies, la présence de la résistance aux acides et à la température optimale de croissance.

Malheureusement, il n'y a pas de méthode de laboratoire unique pour différencier de manière fiable M. Tuberculosis mycobactéries complexe d'autres BAAR, néanmoins la combinaison des caractéristiques décrites ci-dessus avec les résultats donnés ci-dessous d'un certain nombre de tests biochimiques permet l'identification du complexe Mycobacterium tuberculosis avec M. Probablement 95%.

Pour la différenciation complexe Mycobacterium M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii et d'autres) de les MCL utilisé des tests biochimiques de base non tuberculeuses qui détectent la présence des symptômes suivants:

• la capacité à produire de l'acide nicotinique (test à la niacine):
• l'activité nitrate réductase;
• catalase thermostable;
• croissance sur milieu avec du salicylate de sodium (1 mg / ml).

En tant que tests supplémentaires, la croissance sur un milieu contenant 500 ug / ml d'acide paranitrobenzoïque ou 5% de chlorure de sodium peut également être utilisée.

De nombreux laboratoires bactériologiques identifient ces micro-organismes uniquement au niveau du complexe, ce qui est dû aux capacités limitées des laboratoires et aux capacités méthodologiques des spécialistes.

Dans la plupart des cas, cependant, dans la pratique pour différencier M. Tuberculosis et M. Bovis est suffisante les tests suivants: la niacine, pour la présence de nitrate, l'enregistrement de la présence et de la croissance pirazinamidazy dans un milieu contenant 2 pg / ml d'hydrazide de l'acide thiophène-2-carboxylique. Il est pris en compte que les mycobactéries du complexe M. Tuberculosis sont caractérisées par l'ensemble des caractères suivants:

• croissance lente (plus de 3 semaines);
• température de croissance comprise entre 35 et 37 ^o C;
• absence de pigmentation (ivoire);
• couleur marquée acide-rapide;
• un test positif à la niacine;
• un test positif à la nitrate réductase;
• absence de catalase thermostable (68 ^° C).
• L'absence de croissance sur un milieu de Levenstein-Jensen contenant:
  • 1000 μg / ml de salicylate de sodium,
  • 500 μg / ml d'acide paranitrobenzoïque,
  • 5% de chlorure de sodium:
• croissance en présence de 1-5 μg / ml d'acide thiophène-2-carboxylique.

La pertinence de la différenciation des mycobactéries isolées augmentera nettement avec l'augmentation de la fréquence d'enregistrement des cas de VIH / SIDA associés à la tuberculose ou à la mycobactériose. À l'heure actuelle, il n'y a pas de certitude absolue quant à l'aptitude des laboratoires régionaux pratiques à effectuer correctement ce volume de travail.

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Diagnostic immunologique de la tuberculose

Il existe un certain nombre de phénomènes universels, de médicaments et de tests immunologiques qui ont été trouvés à l'origine précisément avec la tuberculose ou sur le modèle de la réponse immunitaire aux mycobactéries. Ceux-ci comprennent le BCG tuberculine, un tel phénomène DTH cutanée (tuberculine - réaction Pirquet et Mantoux), la réaction aux animaux sensibilisés à la tuberculine sous-cutanées (phénomène Koch). Un des premiers anticorps dans la maladie infectieuse a également été détecté dans la tuberculose. Bien sûr, plus la compréhension des mécanismes de bonne immunité contre la tuberculose et leur contrôle génétique, plus peut-être l'utilisation des méthodes immunologiques et des médicaments qui affectent le système immunitaire, pour résoudre les problèmes pratiques de la tuberculose.

Le problème pratique le plus important et le plus difficile est actuellement considéré comme la détection de la tuberculose dans le processus de dépistage de masse de la population. Cependant, malgré les nombreux rapports de "succès" (sur un matériel limité), il n'y a pas de méthode immunologique appropriée (reproductible dans "n'importe quel bras") et un médicament approprié à cet effet.

Les méthodes immunologiques, en particulier les études sérologiques (détermination des antigènes, anticorps) et les tests provoquant la tuberculine sont très largement utilisés en pratique clinique.

En premier lieu parmi les études immunologiques utilisées dans le diagnostic différentiel, il existe des méthodes sérologiques - la détermination des antigènes et des anticorps dans différents environnements du corps.

La spécificité des anticorps dirigés contre les mycobactéries tuberculeuses dépend des antigènes utilisés dans l'immunodosage. Une quantité significative d'antigènes est proposée, la toute première étant la tuberculine PPD:

• PAP et autres préparations complexes à partir du liquide de culture;
• désintégration ultrasonique;
• Extrait de Triton et autres préparations complexes de parois cellulaires;
• 5-antigène (Daniel);
• 60-antigène (Coccito);
• le lipoarabinomannane;
• facteur de cordon (tréhalose-6,6-di-mycollate);
• les glycolipides phénoliques et autres;
• les lipopolysaccharides;
• un antigène liant la fibronectine;
• les protéines (le plus souvent recombinantes); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA, etc.

En conséquence des années de recherche par les scientifiques russes et étrangers ont révélé les lois fondamentales et l'efficacité du diagnostic sérologique anticorps de la tuberculose: l'antigène plus complexe, la plus grande sensibilité et une spécificité plus faible du test. Spécificité dans différents pays varie en fonction de la population de l'infection par M. Tuberculosis et les mycobactéries non tuberculeuses de transport vaccination par le BCG et d'autres. Chez les enfants, le contenu de l'information de sérodiagnostic est plus faible que chez les adultes. Dans la tuberculose primaire (plus souvent chez les enfants), la définition des IgM est plus informative. Avec IgG secondaire. Chez les patients infectés par le VIH, la valeur informative du sérodiagnostic dans la détermination des anticorps est réduite. Détermination de l'efficacité d'anticorps dépend du nombre des « aspects cliniques »: l'activité de traitement (la présence ou l'absence de mycobactéries désintégration de présence « d'isolement » des cavités, le degré d'infiltration), la prévalence du procédé, la durée de son écoulement.

La sensibilité de la méthode d'immunodosage enzymatique (ELISA) est d'environ 70%. L'efficacité insuffisante de l'étude est due à sa faible spécificité. Auparavant, la possibilité d'utiliser le dépistage sérologique dans les groupes à haut risque, en particulier chez les personnes présentant des changements post-tuberculeux dans les poumons, a été envisagée.

Pour augmenter la spécificité d'ELISA, les recherches d'antigènes plus spécifiques, y compris ceux obtenus par génie génétique: ESAT-6, etc. (voir ci-dessus) se poursuivent. L'utilisation d'antigènes strictement spécifiques (38 kDa, ESAT) augmente la spécificité. Mais réduit considérablement la sensibilité de l'analyse. Avec IFA (systèmes de test de laboratoire expérimental. Par ex kit ELISA Pathozyme) fournit également des kits avec filtration immunochromatographique latérale (Mycodot), ainsi que d'autres tests similaires (points d'analyse sur la membrane) avec une évaluation visuelle du résultat du test. Lors de ces tests, l'analyse est effectuée pendant 10-30 minutes; ils ne nécessitent pas d'équipement particulier, ils nécessitent une évaluation visuelle des résultats, ce qui est associé à une certaine subjectivité. Ces méthodes ont approximativement les mêmes caractéristiques de sensibilité et de spécificité (70% et 90-93%, respectivement) que l'ELISA traditionnel.

L'utilisation de procédés de dosage immunologique a une certaine valeur en tant que complexe supplémentaire, pris en compte dans les méthodes, le diagnostic différentiel de la tuberculose, en particulier dans le diagnostic des formes extra-pulmonaires de celui-ci. La méthode ELISA la plus efficace est dans le diagnostic de la méningite tuberculeuse dans l'étude du liquide céphalo-rachidien. Dans ce cas, la sensibilité de l'analyse est de 80-85%, et la spécificité est de 97-98%. Il existe des données sur l'efficacité de la détection des anticorps dirigés contre les mycobactéries tuberculeuses dans le liquide lacrymal dans le diagnostic de l'uvéite tuberculeuse.

Induction de la synthèse de l'interféron gamma in vitro

L'interféron gamma (IFN-γ) est un facteur de défense immunitaire spécifique réalisé par l'activation de systèmes enzymatiques de macrophages. L'induction de la synthèse de l'IFN-γ par les lymphocytes T sensibilisés provoque leur interaction avec les antigènes des mycobactéries.

Comme antigènes utilisés comme tuberculine PPD. Et les antigènes spécifiques obtenus par génie génétique, en particulier des antigènes ESAT-6 (début sécrétées antigène ayant un poids moléculaire de 6 kDa) et CFP-10 (protéine de culture filtrat 10 kDa). Le génie génétique ou les antigènes recombinants sont absents des cellules du vaccin BCG et d'autres mycobactéries. Lors de l'utilisation de la tuberculine, les résultats du test d'induction IFN-γ sont comparables aux résultats du test cutané à la tuberculine (corrélation directe). Lors de l'utilisation d'antigènes génétiquement modifiés, les résultats des tests sont plus spécifiques et ne dépendent pas de la vaccination antérieure par le BCG. Lors du test de personnes vaccinées n'ayant pas été en contact avec une infection tuberculeuse, la spécificité du test est de 99%. La sensibilité du test chez les patients tuberculeux varie de 81 à 89%.

Tests et outils de diagnostic ont été développées sur la base de la culture à court terme de cellules ou de l'ensemble des cellules mononucléaires de sang isolé à partir du sang avec des antigènes de la tuberculose in vitro de Mycobacterium avec détermination subséquente de la concentration d'IFN-γ ou en comptant le nombre de lymphocytes T qui synthétisent l'IFN-γ. La concentration d'interféron synthétisé dans un tube à essai est déterminée par ELISA en utilisant des anticorps monoclonaux se liant à IFN-y. Ensuite, en étalonnant l'IFN-γ standard, sa concentration est déterminée dans le tube à essai ou les puits de la plaque.

Lors de la réalisation du test Elispot, le nombre de T-limocytes synthétisant IFN-γ. Sont comptés sur la surface d'une plaque revêtue d'anticorps anti-IFN-γ.

Développeurs de diagnostic sur la base de l'induction de l'IFN-γ in vitro, qui est approuvé par l'Agence américaine des médicaments et des produits, soutiennent qu'il est impossible de différencier l'infection tuberculeuse latente de la tuberculose active avec l'aide du test. Par conséquent, dans les régions où le taux d'infection est élevé, le test n'est pas directement diagnostique. Cependant, dans notre pays, il peut être utilisé pour différencier l'infection tuberculeuse chez les enfants de l'allergie post-vaccination, et pour évaluer le niveau d'immunité spécifique dans le processus de traitement.

Actuellement, le système de test domestique pour déterminer l'induction de la synthèse d'IFN-γ par des antigènes spécifiques de la tuberculose in vitro est en cours d'étude.

Statut immunitaire et évolution de la tuberculose, immunocorrection

Dans le processus de traitement de la tuberculose chez l'homme, il y a des changements dans l'antigénémie et l'état du système immunitaire.

Les données sur les changements dans les exsudats et les tissus sont en grande partie contradictoires. La seule chose qui peut être notée avec raison est que dans les granulomes tuberculeux, en règle générale, un nombre important de lymphocytes T activés sont détectés.

Il est logique d'insister sur deux autres dispositions qui sont nécessaires pour comprendre le rôle des mécanismes immunologiques dans le traitement de la tuberculose chez l'homme:

• Les patients atteints du SIDA ont une incidence particulièrement élevée de multirésistance aux médicaments;
• avec une résistance multiple aux médicaments (et en l'absence d'infection par le VIH), les troubles immunitaires (en particulier le lien entre les cellules T) sont particulièrement importants.

Lorsque la tuberculose applique largement différentes méthodes de immunomodulation: ce sont principalement des médicaments agissant principalement sur l'immunité des lymphocytes T et un système de phagocytes mononucléaires (hormones thymiques, isophorone, likopid, polioksidony et al.). Ainsi que les mycobactéries entières (atténuées) et leurs composants.

Diagnostic moléculaire-biologique de la tuberculose

Pour les méthodes de biologie moléculaire dans le diagnostic des maladies infectieuses comprennent, principalement, les méthodes basées sur la manipulation de la matière génomique des agents pathogènes bactériens et viraux pour identifier le matériel génétique spécifique - segments d'ADN ayant une séquence nucléotidique spécifique d'une des souches de type particulier ou d'agents pathogènes à analyser spécifique Séquences d'ADN dans les gènes qui déterminent la sensibilité de l'agent pathogène à certaines substances médicamenteuses, ainsi que pour l'analyse fonctionnelle activité de certains gènes du pathogène. Techniques de biologie moléculaire ont été largement dans la recherche scientifique et l'application pratique dans le diagnostic et le suivi des diverses infections bactériennes et virales après l'ouverture en 1985, Carrie Myullisom (lauréat du Prix Nobel. 1989) Réaction en chaîne par polymérase.

Principes et possibilités de la méthode de réaction en chaîne de la polymérase

La PCR permet d'amplifier (multiplier) in vitro une séquence nucléotidique (fragment d'ADN du pathogène) pendant plusieurs heures, en millions de fois. La réaction en présence de chaînes d'ADN uniques détermine la sensibilité extrêmement élevée du test.

La séquence nucléotidique de certaines régions de la chaîne d'ADN détermine l'identité génétique du micro-organisme, ce qui explique la grande spécificité de la PCR.

L'importance de cette méthode pour la détection et l'investigation des caractéristiques de la mycobactérie tuberculeuse est due aux caractéristiques biologiques du microorganisme, qui a une croissance très lente: le temps de doublement de l'ADN de mycobacterium tuberculosis pendant la culture est de 12-24 heures.

Le principe de la méthode PCR consiste en une amplification multiple, des millions de fois. Multiplier les sections d'une séquence d'ADN spécifique dans un microvolume à tube pendant une récurrence cyclique des trois étapes de réaction suivantes, dont chacune passe dans un régime de température différent:

• Stade I - dénaturation de l'ADN double brin par chauffage avec une divergence de ses chaînes;
• II stade - liaison complémentaire (hybridation) des amorces (oligonucléotides d'amorçage) avec des sections terminales de chaînes de rigoureusement spécifiques, choisies pour la multiplication du fragment d'ADN;
• Stade III - achèvement de la chaîne du fragment d'ADN à l'aide d'une ADN polymérase thermostable.

Pour l'amplification in vitro, il doit y avoir des molécules d'ADN matriciel. Quatre types de désoxynucléoside triphosphates (nucleotides) contenant les bases azotées appropriées: l' adénine (A), la thymine (T), guanine (G), la cytosine (C); des oligonucléotides d'amorçage artificiellement synthétisés (amorces) constitués de 18 à 20 paires de bases; Enzyme ADN polymérase thermostable ayant une température optimale de 68 à 72 ^{sur le} C, et les ions magnésium.

La spécificité de la PCR dépend du choix du fragment d'ADN. Conformément à cela, des oligonucléotides de flancs sont synthétisés. La spécificité d'hybridation et d'achèvement de la chaîne d'ADN est due au principe de complémentarité des paires de bases azotées suivantes: adénine-thymine, guanine-cytosine.

Pour déterminer le complexe de mycobactéries tuberculeuses génomique d'amplification de la cible la plus efficace dans la plupart des systèmes d'essai choisis fragment d'ADN de IS6110, qui, dans la plupart des souches de génome de Mycobacterium tuberculosis a un nombre important (10 à 20) de répétitions, qui fournit, en même temps que la spécificité, la sensibilité du dosage. En même temps, des souches de Mycobacterium tuberculosis avec un petit nombre de répétitions ou l'absence de fragment IS6110 sont décrites.

Isolement de molécules d'ADN à partir d'un échantillon biologique

Pour effectuer la PCR, les molécules d'ADN du pathogène doivent être isolées du matériel biologique dans un volume minimal, avec une quantité minimale d'ADN non spécifique et divers inhibiteurs de l'enzyme-ADN polymérase.

La préparation des échantillons doit être effectuée dans des conditions qui empêchent la contamination croisée des échantillons par les molécules d'ADN isolées. Pour ce faire, il est nécessaire de prétraiter la pièce à l'ultraviolet, les sols et les surfaces de travail des bureaux et des appareils avec des solutions contenant du chlore. Également l'utilisation obligatoire des gants propres, des tubes à essai jetables et des conseils aux pipettes automatiques.

Pour isoler l'ADN de Mycobacterium tuberculosis à partir d' échantillons cliniques (liquide céphalo - rachidien, lavage bronchique) ne contenant pas un grand nombre de cellules, débris cellulaires, ou des sels de ceux - ci, suffisante pour centrifuger l'échantillon à 3-4000. Rpm, ajouter à la boue 20-30 ul de solution à 2% triton X-100 et chauffé à 90 ^environ C pendant 30 min.

Pour la préparation d'échantillons de crachats doit être liquéfaction efficace, ce qui est généralement utilisé pour une solution à 4% d'hydroxyde de sodium et de N-acétyl-L-cystéine (NALC) en une quantité de 50 à 80 mg par échantillon - en fonction de la viscosité de l'échantillon. La solution NALC doit être préparée ex tempore ou la poudre NALC peut être ajoutée directement à l'échantillon. Après la liquéfaction, les échantillons doivent être centrifugés pendant 15 minutes à 3,5-4 000 tr / min (3000 g) dans des flacons de 50 ml avec des bouchons à vis, par exemple. Dans les mêmes conditions que celles recommandées pour la préparation des flegmatiques.

Pour l'extraction d'ADN à partir du procédé de pastille est utilisé le plus souvent basés sur l'utilisation d'une solution 6.5 M de réactif de lyse d'isothiocyanate de guanidine en tant que particules microporeuses et l'oxyde de silicium ( « de la terre de diatomées ») sorption molécule d'ADN. Substances non spécifiques, y compris les inhibiteurs possibles, puis lavé dans une solution 2,5 molaire d'isothiocyanate de guanidinium et une solution d'éthanol, après quoi la molécule d'ADN est désorbé dans l'eau, et ces échantillons ont été utilisés pour effectuer la PCR. Pour simplifier la technologie d'extraction de l'ADN, la "terre de diatomées" est souvent remplacée par des microparticules magnétiques revêtues d'oxyde de silicium. Dans ce cas, un support magnétique spécial pour les microtubes est utilisé à la place de la centrifugation pour précipiter les particules.

En Russie, une méthode originale de séparation immunomagnétique des mycobactéries a été développée, suivie de l'extraction de l'ADN du pathogène. Pour Mycobacterium tuberculosis séparation immunomagnétique en utilisant la taille de ferroparticles de 3-5 microns, revêtu de silice, sur lesquels sont fixés par les anticorps polyclonaux de liaison chimique (de lapin) à Mycobacterium tuberculosis. Les échantillons d'expectorations après lyse alcaline sont neutralisés avec une solution de tris-HCl acide et incubés avec un sorbant immunomagnétique. Ensuite, les immunoferroparticules sont recueillies avec une tige magnétique avec une pointe remplaçable, transférées dans un microtube et précipitées. Ajouter 20-30 μl d'une solution de Triton X-100 à 2% et chauffer pendant 30 minutes à 90 ^° C. Le surnageant est utilisé comme matrice d'ADN pour l'analyse PCR.

Un problème difficile est l'isolement de l'ADN de mycobacterium tuberculosis à partir d'échantillons de biopsie. Pour la biopsie enzymatique, l'enzyme protéinase K est utilisée à une concentration finale de 200-500 mg / l à une température de 56 ^° C pendant la nuit. En outre, l'une des méthodes connues est utilisée. L'excès d'ADN non spécifique dans l'analyse PCR des biopsies provoque souvent l'inhibition de la réaction, ce qui nécessite une extraction répétée de l'ADN.

Méthodes de détection des résultats

Après achèvement de la réaction, les fragments d'ADN amplifiés de l'agent pathogène sont identifiés par diverses méthodes.

La méthode d'électrophorèse sur gel est bien connue. Le fragment d'ADN résultant est identifié par un contrôle positif contenant le fragment d'ADN spécifique désiré, ou selon une taille connue (le nombre de paires de nucleotides) du fragment, qui est déterminée en utilisant un marqueur moléculaire standard.

En présence d'un colorant spécifique, le bromure d'éthidium est inclus dans l'ADN double brin. Le fragment d'ADN synthétisé est détecté sous la forme d'une bande lumineuse sous l'action de l'ultraviolet.

La taille du fragment d'ADN, déterminée par électrophorèse à partir de la distance de départ, doit correspondre à un marqueur de poids moléculaire connu ou à un témoin positif.

D'autres méthodes de détermination des résultats de PCR basées sur l'hybridation d'une seule chaîne des produits de PCR avec un oligonucléotide complémentaire à celle-ci - sonde d'ADN marqué à la biotine, suivie d'une détection par des réactions enzymatiques, par exemple en se liant à la phosphatase alcaline streptavidine-biotine.

Sur la base du type conçu pour détecter les analyseurs de PCR dans laquelle les résultats de la détection de PCR effectués automatiquement à la suite de la lecture de la densité optique des échantillons après le développement de la réaction enzymatique.

Les inconvénients de ces méthodes sont les possibilités de contamination intralaboratoire par des fragments de molécules d'ADN plutôt courts. Lorsque les molécules entrent dans de nouveaux échantillons, elles deviennent une matrice pour la PCR et conduisent à des résultats faussement positifs.

A cet égard, pour éviter les résultats faussement positifs, des règles strictes de séparation et d'isolation des locaux sont introduites: extraire l'ADN des échantillons biologiques; locaux pour la détection des résultats (électrophorèse) de la zone propre. Ces locaux sont une zone de contamination probable. Une autre zone isolée est une salle blanche pour introduire les échantillons d'ADN à tester dans des tubes avec un mélange réactionnel pour PCR. Enfin, il est supposé que le dispositif principal - l'amplificateur d'ADN - devrait être placé dans une pièce séparée, éventuellement de bureau.

Pour éviter la contamination des produits des réactions précédentes - certains test du système PCR Likon-ampère à la place dezoksinukleozidtimidina contient dezoksinukleoziduridin qui, lorsque le circuit de synthèse in vitro incorporé à la place dans la bonne position, à savoir, La base azotée de la thymine présente dans l'ADN natif est remplacée par l'uracile. L'uracil-ADN glycosylase, ajoutée au mélange réactionnel au matériau analysé, ne détruit que les fragments contaminants avec la désoxyuridine, mais pas l'ADN natif à analyser. Lt; / RTI & gt; Un chauffage subséquent à 94 ^° C inactive cette enzyme et n'interfère pas avec l'amplification en PCR.

Il existe un système de test basé sur l'amplification isotherme de l'ARNr, pour lequel la transcription inverse et la synthèse des molécules d'ADN sont effectuées en premier. Qui, à son tour, est une matrice pour la synthèse ultérieure des molécules d'ARN. Les amplicons d'ARN sont détectés en utilisant une sonde d'ADN colorée à l'acridine lorsqu'ils sont hybrides dans une solution de tube de réaction. Cette méthode, en plus de la haute sensibilité, a l'avantage d'analyser dans un tube, ce qui empêche la contamination. Selon les auteurs, la sensibilité de cette méthode dans les échantillons respiratoires atteint 90% avec une spécificité de 99-100%.

De nouvelles méthodes de détection sont implémentées dans la PCR en temps réel. Ces méthodes diffèrent principalement en ce que la PCR et la détection de ses résultats sont effectuées simultanément dans un tube fermé. Ceci non seulement simplifie technologiquement la technique d'analyse, mais empêche également la contamination des salles de laboratoire et des échantillons d'essai avec les produits de la PCR précédente.

Avec la PCR en temps réel, la détection des résultats est due à la fluorescence provenant de l'hybridation d'une sonde d'ADN fluorogène avec un fragment d'ADN spécifique amplifié pendant la PCR. Structure des sondes d'ADN fluorogènes construit de telle sorte que le marqueur fluorescent est libéré à la suite de la réaction enzymatique ou éloignée de la fluorescence de la molécule extinctrice que dans une hybridation spécifique avec la molécule d'ADN désirée à amplifier au cours de la PCR. Avec l'augmentation du nombre de molécules hybridées avec la sonde, l'augmentation de la fluorescence au niveau détectable est proportionnelle au nombre de molécules du produit amplifié. Puisque le nombre de molécules du fragment d'ADN est doublé pendant chaque cycle de PCR, le nombre de cycles à partir duquel la fluorescence est déterminée et augmente est inversement proportionnel au nombre de molécules d'ADN dans l'échantillon original. Si plusieurs concentrations moléculaires connues du fragment d'ADN correspondant de mycobacterium tuberculosis sont introduites dans la réaction en tant que calibrateur, alors, par le programme informatique, le nombre de génomes d'ADN dans le matériau d'essai peut être calculé.

Chaque échantillon standard est dupliqué. Le critère quantitatif est le nombre minimum de cycles de PCR nécessaires pour le début et la croissance de la fluorescence déterminée. En abscisse - le nombre de cycles; l'ordonnée est la valeur de fluorescence. Les concentrations d'ADN sont inversement proportionnelles au nombre de cycles requis pour l'apparition de la fluorescence. Dans la colonne de droite (21-32), les numéros de cycles pour les concentrations correspondantes sont marqués. Différences entre les concentrations de 10 fois des fragments d'ADN 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cycles. Pour deux patients, les concentrations de fragments IS6110 étaient d'environ 10 ³ / ml et 10 ⁴ / ml. En tenant compte du nombre de répétitions (6-20) des fragments analysés dans le génome de Mycobacterium tuberculosis, le nombre de mycobactéries dans les échantillons cliniques est d'environ 100 et 1000 cellules, respectivement.

L'utilisation de la PCR dans le diagnostic de la tuberculose

La méthode PCR est la plus utilisée pour le diagnostic accéléré de la tuberculose - détection de mycobacterium tuberculosis dans des échantillons cliniques: expectorations. L'irrigation bronchique, l'exsudat pleural, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, le point lacrymal d'ostéolyse, l'aspiration des voies génitales féminines et divers spécimens de biopsie. Lors de l'étude d'environ 500 échantillons d'expectorations et de bouffées bronchiques chez 340 patients présentant un diagnostic confirmé de tuberculose pulmonaire aux Pays-Bas, la sensibilité comparative de la PCR, de la culture et de la microscopie des frottis a été étudiée. La sensibilité de l'analyse était de 92,6.88,9 et de 52,4%, respectivement. La spécificité de toutes les méthodes était d'environ 99%.

L'efficacité de la détection de mycobacterium tuberculosis par microscopie des frottis, ensemencement sur milieu Levenstein-Jensen, système de test VASTES et analyse PCR a été comparée. La PCR a montré une sensibilité de 74,4%, la microscopie - 33,8%, l'ensemencement sur un milieu dense - 48,9% et VASTES - 55,8%. La durée moyenne de détection pour l'ensemencement sur un milieu Levenstein-Jensen est de 24 jours. VASTES - 13 jours, PCR - 1 jour.

Les possibilités d'utiliser la PCR en tant que méthode sensible et rapide pour surveiller l'efficacité du traitement de la tuberculose sont également discutées.

La détection de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis par PCR avec une chimiothérapie efficace déterminée sur une période plus longue - en moyenne 1,7 mois par rapport à frottis défini en microscopie par fluorescence et de 2,5 mois par rapport à l'examen bactériologique.

Diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose

L'importance de la PCR en tant que méthode sensible est particulièrement importante pour les formes extrapulmonaires, car c'est avec ces formes que les méthodes clinico-radiologiques et les méthodes bactériologiques traditionnelles pour déterminer les mycobactéries de la tuberculose dans les matériels de diagnostic sont inefficaces.

Dans l'étude des échantillons d'urine, les résultats de l'analyse PCR étaient positifs chez 16 des 17 patients atteints de tuberculose active du système urinaire et négatifs chez 4 patients atteints de tuberculose rénale inactive et 39 patients atteints de maladies non tuberculeuses du système urinaire.

L'efficacité de l'analyse par PCR dans l'étude des aspirats de moelle osseuse chez des patients présentant une fièvre d'origine inconnue a été démontrée dans des cas de tuberculose présumée. Pour diagnostiquer une lymphadénite tuberculeuse, 102 enfants aspirés par ponction et un échantillon de 67 enfants ayant une lymphadénite tuberculeuse suspectée ont été étudiés chez des enfants. Des résultats positifs ont été obtenus: 71,6% de PCR en temps réel. Microscopie à fluorescence - 46,3%. Recherche sur la culture - 41,8%. Dans l'étude de 50 biopsies de ganglions lymphatiques chez des patients atteints de la maladie du "chat gratter", tous les résultats étaient négatifs. Ainsi, une spécificité de 100% de l'analyse PCR a été démontrée. Dans le même travail, avec une ponction biopsie des ganglions lymphatiques, la possibilité de détection de M. Avium a été démontrée.

Le diagnostic de la tuberculose de l'infertilité de la région génitale féminine, comme on le sait, est l'un des problèmes de diagnostic les plus difficiles. Dans une étude par PCR sur des biopsies de l'endomètre, des aspirats endométriaux et des échantillons de fluides de l'espace Douglas, 14 (56%) des 25 patients examinés par laparoscopie avec suspicion de tuberculose ont reçu des résultats positifs. En utilisant la microscopie des frottis et la culture, les résultats 1 et 2 ont été obtenus, respectivement. Ces cas étaient également positifs à la PCR. La plupart des résultats positifs à la PCR étaient liés à des cas avec des signes caractéristiques de tuberculose selon l'étude histologique; un plus petit nombre - avec suspicion de tuberculose selon les données de laparoscopie. Un seul résultat positif de l'analyse PCR a été obtenu en l'absence de données laparoscopiques pour la tuberculose.

Lors du diagnostic de formes extrapulmonaires de tuberculose, les cliniciens se posent souvent la question de la possibilité de détecter un agent pathogène lors de l'analyse d'échantillons de sang par la méthode PCR. Les données littéraires indiquent que la détection de l'ADN de mycobacterium tuberculosis à partir d'échantillons sanguins est possible avec des formes profondes d'infection par le VIH. L'ADN de mycobacterium tuberculosis a été détecté seulement avec la tuberculose généralisée de divers organes chez les patients avec rein transplanté et immunosuppression.

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Identification des espèces de mycobactéries

La méthode PCR peut être très efficace pour l'identification rapide des mycobactéries du complexe de la tuberculose et certaines espèces de mycobactéries non tuberculeuse après avoir reçu leur croissance initiale. Dans ce cas, l'utilisation de la PCR peut sauver 7-10 jours, nécessaires à l'identification culturelle ultérieure d'un résultat positif. Le test de PCR est techniquement très simple, car il ne nécessite pas de préparation d'échantillon compliquée du matériel clinique pour atteindre une sensibilité élevée. Dans l'étude 80 positif dans ce système de test (MB Vasto. La société Organon) toutes les cultures positives de PCR étaient strictement spécifiques et maintenue pendant 1 jour. Pour identifier d'autres espèces de mycobactéries dans la préparation de l'ADN de la culture de l'agent pathogène hybridées avec des sondes d'ADN spécifiques marqués à l'acridine et les souches détectées par l'apparition d'une chimioluminescence par l'intermédiaire de bandes de nitrocellulose chemiluminomètre ou avec une évaluation visuelle après hybridation. A l'aide d'un tel ensemble, un nombre limité d'espèces sont identifiées: le complexe mycobacterium tuberculosis. M. Avium, complexe M. Avium, M. Kansasii et M. Gordonae.

A.Telenti et al. également mis au point une méthode relativement simple et peu coûteuse de l'identification des espèces d'espèces de mycobactéries cliniquement importants par PCR et le traitement subséquent avec deux enzymes de restriction (enzymes ayant des propriétés coupe une molécule d'ADN en des points spécifiques). Le fragment d'ADN est amplifié. Qui code pour une protéine de choc thermique (65 kDa), puis le fragment PCR de 439 paires de nucléotides produites par PCR est traité séparément avec deux enzymes, Bste II et Nae III. Ensuite analysé en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose a obtenu deux produits, la détermination de leur taille (nombre de paires de bases) en utilisant un ensemble standard de fragments d'ADN (ADN de marqueurs moléculaires) d'une longueur de 100 à 1000 paires de bases. Dans chacun des types spécifiques (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) détecter deux ou trois fragments d'ADN de taille différente pour chaque enzyme de restriction. La combinaison des différentes tailles d'ADN obtenues permet de différencier ces espèces entre elles.

La technologie des biopuces à ADN biologique est en cours de développement. Qui aidera à identifier plus de 100 espèces de mycobactéries dans une étude.

L'identification des espèces peut également être réalisée par amplification PCR de la région variable de l'ARNr 16S, suivie d'un séquençage d'amplicon par rapport à la structure primaire correspondante, ce qui permet l'identification de plus de 40 espèces de mycobactéries.

A l'aide de la PCR, une identification des espèces dans le complexe mycobacterium tuberculosis peut également être réalisée, y compris la différenciation de M. Bovis et de M. Bovis BCG. Pour ce faire, la présence ou l'absence de certains gènes dans les régions génomiques de RD1 est analysée. RD9 et RD10. RD1 est absent chez M. Bovis BCG, mais il est présent chez les espèces virulentes, y compris M. Bovis.

Détermination de la sensibilité aux médicaments de Mycobacterium tuberculosis par PCR

Objectifs de méthodes génétiques moléculaires pour la sensibilité aux médicaments ou la résistance de Mycobacterium tuberculosis réduisent pour identifier des mutations dans des séquences nucléotidiques spécifiques des gènes connus. Méthodes de base sont basées soit sur prochityvanii direct (séquençage) de ces séquences après l'amplification ou l'hybridation de fragments d'ADN amplifiés marqués à la biotine au cours des sondes d'ADN par PCR. Ces deux solutions consistent à identifier les substitutions de nucleotides dans les séquences en utilisant des sondes d'ADN conduisent à l'absence ou l'hybridation incomplète sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un conjugué enzyme (phosphatase alcaline streptavidine) - méthode LiPA Rif-TB.

Procédé pour mesurer la fluorescence dans un fixé localement sur microsections ADN sondes complémentaires de mutations connues dans les régions de gènes amplifiés par PCR responsables de la sensibilité ou la résistance à la drogue, méthode appelée mikrobiochipov. L'algorithme principal pour effectuer cette recherche est le suivant. Après isolement de l'ADN à partir d'un échantillon clinique ou d'une culture de mycobactéries est nécessaire de procéder à une amplification par PCR de fragments pertinents du gène rpoB responsable de la sensibilité aux médicaments à la rifampicine ou de gènes katG et inhA codant pour des protéines de Mycobacterium sont responsables de la sensibilité à l'isoniazide. Résultats de la PCR ont été évalués par électrophorèse sur gel d'agarose, dans lequel confirmer la réception de fragments d'ADN appropriés de la longueur désirée. Ensuite, un second cycle de PCR est effectué pour introduire un marqueur fluorescent dans l'ADN. Les résultats de la PCR sont à nouveau confirmés par électrophorèse sur gel. Par la suite, l'hybridation a été effectuée (incubation pendant une nuit), suivi par le lavage de la matière résultante sur la biopuce, ce qui est un grand nombre de fixe dans une petite plaque de verre courtes brins d'ADN (sondes) qui sont complémentaires des séquences nucléotidiques de la Mycobacterium tuberculosis de type sensible à la drogue au niveau des points de mutations possibles. Ainsi qu'aux séquences mutantes responsables de la résistance aux médicaments. Localisation des sondes d'ADN sur la plaque - strictement défini, et le niveau de fluorescence observée lors de l'hybridation pour déterminer le résultat en utilisant un dispositif de lecture spécial est installé. A cet égard, les résultats de l'analyse sont déterminés au moyen d'un programme informatique spécial.

Ces dernières années, des méthodes alternatives pour déterminer la sensibilité aux médicaments de la mycobactérie tuberculeuse sur la base de la technologie de PCR en temps réel ont été développées, ce qui permet de réaliser ces études dans un essai en tube fermé.

Dans la Fig. 13-13 présente le résultat de l'analyse des cultures cliniques de mycobacterium tuberculosis dans la détermination de la pharmacorésistance à la rifampicine par PCR en temps réel: 218 - un échantillon témoin (sensible à la rifampicine); 93 - contrôle positif de la mutation de Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - contrôle positif pour la mutation de Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - échantillons expérimentaux. Résultat du calcul des courbes cinétiques d'amplification sur 4 canaux: canal 1: 393 - contrôle positif pour la mutation de Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4482 - contrôle positif pour la mutation de Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - échantillons expérimentaux; canal 4: courbes cinétiques d'amplification de tous les échantillons participant à l'expérience. Contrôle positif de la réaction d'amplification. Conclusions: Sur la base des résultats de l'analyse, les mutations suivantes déterminant la résistance à la rifampicine ont été identifiées: dans les échantillons 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Le même principe a été utilisé pour déterminer la résistance du médicament à l'isoniazide pour les gènes katG et inhA, qui détermine les mutations les plus fréquentes.

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Identification de souches de mycobacterium tuberculosis

Le procédé le plus étudié à fond de l'identification de souches de Mycobacterium tuberculosis est une technique appelée polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP RFLP,. Ou dans la version anglaise), et qui est basé sur fragmentirovanin (restriction) de l'enzyme de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis Pvu II et les fragments obtenus à l'hybridation ultérieure avec certaines séquences spécifiques sur l'ADN son élément répété IS6110. La variabilité intraspécifique est réalisée en raison du nombre différent de répétitions de IS6110 et de leur localisation sur l'ADN. Ainsi que la variété des distances entre certains points d'attaque de l'enzyme de restriction enzymatique (sites de restriction) et l'élément IS6110. Cette technologie est très compliquée et prend beaucoup de temps. Après traitement avec l'ADN extrait à partir d'une culture de Mycobacterium tuberculosis, l'électrophorèse sur gel est réalisée avec une enzyme de restriction, puis transféré des fragments d'ADN de différentes longueurs sur une membrane de nitrocellulose, l'hybridation a été réalisée avec des fragments de IS6110-élément et détecté au moyen de réactions enzymatiques. Le profil spécifique des bandes qui en résulte caractérise l'ADN d'une souche spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Avec l'aide de l'analyse informatique, l'identité ou la parenté des souches est révélée. Malgré le fait que la méthode RFLP est la plus discriminatoire, c'est-à-dire identifie le plus grand nombre de différences dans les souches analysées, il est inefficace pour un petit nombre (moins de 5) IS6110-répétitions observées dans certaines souches. Dans la Fig. 13-14 montre les résultats du typage RFLP des souches.

Une alternative peut être la méthode de spoligotypage - l'analyse du polymorphisme des séquences d'ADN d'espaceur - intermédiaire entre les répétitions directes de la région DR. Lors de la réalisation du spoligotypage des souches, la PCR est réalisée avec des amorces délimitant la région DR, après quoi des fragments de longueur différente sont formés qui s'hybrident avec les régions intermédiaires variables de l'ADN. L'analyse des séquences d'espacement de la région DR est présentée. Selon les chercheurs, plus simple, productif et adapté pour le dépistage primaire des souches et l'analyse épidémiologique préliminaire, ainsi que la recherche directement du matériel clinique.

De toute évidence, une méthode plus efficace et technologiquement accessible est VNTR (abréviation de mots anglais), ou une méthode pour déterminer le nombre variable de répétitions en tandem exactes dans l'ADN de mycobacterium tuberculosis. Cette méthode est basée uniquement sur l'utilisation de la PCR et ne nécessite aucune manipulation supplémentaire. Comme le nombre de répétitions en tandem dans différentes souches et dans différents locus est différent, les fragments de différentes tailles sont déterminés et analysés sur l'électrophorégramme résultant des produits de PCR. Selon les chercheurs, l'utilisation de VNTR permet d'obtenir un plus grand degré de discrimination des souches qu'avec la méthode RFLP.

Une grande attention a été accordée ces dernières années à la distribution de souches de Mycobacterium tuberculosis de la famille W-Beijing (parfois appelée la souche de Beijing), qui sont en grande partie résistantes aux médicaments.

Exigences de base pour la qualité de la recherche en biologie moléculaire

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Documents réglementaires de base pour la PCR

Les commandes du ministère russe de la Santé: №45 de 07/02/2000 g .. Nombre 109 de 21.03.2003 g .. N ° 64 de 21.02.2000, les lignes directrices: 1.3.1888-04 « Organisation des travaux dans les études en utilisant du matériel infecté par PCR biologique pathogène les agents des groupes III-IV de la pathogénicité "; 1.3.1794-03 "Organisation de travaux dans l'étude de matériel PCR, infecté par des microorganismes des groupes de pathogénicité I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 « Décontamination du matériel, les bactéries infectées par des groupes de pathogénicité I-IV lors de l'utilisation de PCR, » 2001 L'annexe 11 aux instructions unifiées pour les méthodes d'examen microbiologiques dans l'identification, le diagnostic et le traitement de la tuberculose.

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Le personnel

L'exécution de la recherche biologique moléculaire peut détenir les médecins de diagnostic de laboratoire clinique, bactériologistes médecins, virologues, médecins, biologistes, laboratoire de diagnostic clinique, ainsi que des spécialistes ayant une formation médicale secondaire, passé la spécialisation et de formation avancée de la manière prescrite.

Aménagement des locaux du laboratoire

Les salles de laboratoire suivantes sont requises:

• Zone de manipulation des échantillons est un laboratoire adapté pour travailler avec des agents infectieux des groupes de pathogénicité III-IV, selon les instructions méthodiques 13.1888-04.
• Zone pour la préparation des mélanges réactionnels PCR - salle de laboratoire, qui fournit une protection contre la contamination interne du laboratoire - zone "propre".
• • Si l'électrophorèse ou l'hybridation est utilisée pour analyser les produits de PCR. Salle de laboratoire, dans lequel les fragments d'ADN sont extraits multipliés à partir des tubes et l'amplification, respectivement, peut passer dans l'environnement, en conformité avec les exigences pour les laboratoires de PCR (1.3.1794-03 lignes directrices, orientation 1.3.1888-04) doit être pleinement est isolé des locaux indiqués dans les paragraphes précédents. Il devrait être exclu de la zone de mouvement à la zone électrophorèse pour la manipulation des échantillons et une zone « propre » de tout le personnel, l'équipement, des matériaux et des objets, ainsi que le transfert d'air à travers le système de ventilation, ou à la suite de projets. Cette zone n'est pas requise pour la détection fluorimétrique des produits de PCR.
• La salle de documentation et de traitement des résultats est équipée d'ordinateurs et d'équipements de bureau nécessaires. Cette pièce peut contenir un équipement permettant la détection de produits PCR sans ouvrir le tube. - des détecteurs PCR fluorescents et des thermocycleurs pour la PCR en temps réel.

Les exigences sanitaires et épidémiologiques pour le traitement primaire des expectorations sont similaires aux exigences microbiologiques standard pour le traitement des mycobactéries tuberculeuses.

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Achèvement de l'équipement de laboratoire pour le diagnostic par PCR

Le laboratoire inclut l'équipement pour les salles suivantes.

• salle de préparation des échantillons, contient l'équipement suivant: laminaire de la classe de protection II "SP-1.2": thermostat à semi-conducteurs avec couvercle chauffant pour tubes à essai du type "Eppendorf"; microcentrifugeuse à 13 000 tr / min; une centrifugeuse (Vortex); réfrigérateur avec une gamme de température de -20 ^à 10 ° C à ^environ C; pipettes de volume variable de la série "Rroline"; une pompe avec un flacon piège OM-1; un trépied pour pipettes; trépied poste de travail 200x0.5 ml; poste de travail trépied 50x1.5 ml; Supports pour stocker des tubes à essai 80x1.5 ml;
• Chambre de préparation du mélange réactionnel: chambre de protection Boîte PCR ("Laminar-C., 110 cm); centrifugeuse - Vortex; Pipettes à volume variable de la série Proline; un trépied pour pipettes; trépied poste de travail 200x0,2 ml; Supports pour stocker des tubes à essai 80x1.5 ml; réfrigérateur avec une gamme de température allant de -20 ^à C à + 10 ^de C;
• salle d'électrophorèse: caméra pour électrophorèse horizontale; alimentation électrique; transilluminateur;
• Amplificateurs d'ADN ou analyseur d'acide nucléique (PCR en temps réel) avec un ordinateur et un logiciel; peut être placé dans n'importe quelle pièce de rechange. Si la technologie de PCR en temps réel est utilisée. Salle pour l'électrophorèse n'est pas nécessaire.

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Contrôle de qualité externe

Pour être sûrs d'obtenir des résultats objectivement fiables, les laboratoires devraient participer au système d'évaluation externe de la qualité de la recherche en laboratoire.

Les participants au système de contrôle de qualité reçoivent; 12 flacons de suspensions de cellules bactériennes lyophilisées, dont deux contiennent le E. Coli E. Coir, 3 flacons de Mycobacterium tuberculosis (souche avirulente) à 10 ² / ml; 3 ampoules avec des cellules d'une souche similaire à une concentration de 10 ⁴ / ml; 2 ampoules avec des mycobactéries non tuberculeuses M. Avium-intracellulare et M. Kansasii à une concentration de 10 ⁵ / ml.

Des tests distribués pour l'évaluation externe de la qualité sont pré-testés dans deux laboratoires indépendants ayant une vaste expérience dans ce domaine.

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