Diagnostic de laboratoire de la tuberculose

La tuberculose est une maladie facile à diagnostiquer grâce aux progrès scientifiques et aux conditions modernes. Le diagnostic en laboratoire de la tuberculose occupe une place centrale parmi les autres méthodes diagnostiques, juste après les examens radiologiques.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Test sanguin clinique

Chez les patients atteints de tuberculose, les modifications du bilan sanguin général ne sont pas pathognomoniques. Dans les formes limitées et peu actives de tuberculose, une hypochromie des érythrocytes, avec un nombre normal, est caractéristique. En cas d'infiltration massive ou de pneumonie caséeuse, avec lymphadénite caséeuse étendue, de lésions intestinales spécifiques, ainsi qu'en cas d'hémorragies pulmonaires ou postopératoires importantes, on observe une érythropénie et une microcytose, une oligochromasie et une polychromasie. La macrocytose, et surtout la poïkilocytose, sont beaucoup plus rares, généralement en cas d'anémie sévère. Le nombre de réticulocytes au stade compensé de la tuberculose varie de 0,1 à 0,6 %, au stade sous-compensé de 0,6 à 1,0 %, et au stade décompensé, 1 % de réticulocytes est caractéristique.

Dans certains cas de tuberculose, une leucocytose modérée (jusqu'à 15 000 leucocytes) peut être observée, moins souvent une leucopénie, qui survient dans 2 à 7 % des cas chez les patients présentant des formes limitées et légères du processus et dans 12,5 % des cas de tuberculose pulmonaire destructrice et progressive.

Le plus souvent, des modifications de la formule leucocytaire sont observées. On observe une neutrophilie relative et absolue, ainsi qu'un déplacement modéré de la formule leucocytaire vers la gauche, au profit des promyélocytes. Les myélocytes sont très rares dans les cas de tuberculose non compliquée. Une augmentation du nombre de neutrophiles présentant une granularité pathologique sur l'hémogramme d'un patient tuberculeux indique toujours la durée du processus: chez les patients atteints de tuberculose sévère, la quasi-totalité des neutrophiles présentent une granularité pathologique. Lorsqu'une épidémie de tuberculose s'atténue, le déplacement nucléaire revient à la normale relativement rapidement. La granularité pathologique des neutrophiles persiste généralement plus longtemps que les autres modifications de l'hémogramme.

La teneur en éosinophiles dans le sang périphérique varie également en fonction de la phase du processus et de l'état allergique de l'organisme. Leur nombre diminue jusqu'à l'anéosinophilie lors des poussées sévères et prolongées de la maladie et, à l'inverse, augmente lors de la résorption des infiltrats et de l'épanchement pleural, ainsi que dans les formes précoces de tuberculose primaire.

La plupart des formes de tuberculose primaire s'accompagnent d'une lymphopénie, parfois observée pendant plusieurs années, même après la cicatrisation de lésions spécifiques. La tuberculose secondaire en phase aiguë, selon la gravité du processus, peut s'accompagner soit d'un nombre normal de lymphocytes, soit d'une lymphopénie.

Parmi les tests permettant d'évaluer le processus tuberculeux, la vitesse de sédimentation (VS) occupe une place particulière. Elle est importante pour évaluer l'évolution de la tuberculose et identifier ses formes actives. Une VS élevée indique la présence d'un processus pathologique (infectieux et inflammatoire, purulent, septique, hémoblastose, lymphogranulomatose, etc.) et sert d'indicateur de sa gravité. Cependant, une VS normale n'indique pas toujours l'absence de pathologie. L'accélération de la sédimentation est favorisée par une augmentation des taux sanguins de globulines, de fibrinogène et de cholestérol, ainsi que par une diminution de la viscosité sanguine. Un ralentissement de la sédimentation est caractéristique des affections accompagnées d'hémoconcentration, d'une augmentation des taux d'albumine et d'acides biliaires.

L'hémogramme des patients tuberculeux évolue au cours du traitement. Plus l'intervention thérapeutique est efficace, plus les modifications hématologiques disparaissent rapidement. Il convient également de prendre en compte l'effet de divers antibactériens sur l'hématopoïèse. Ils provoquent souvent une éosinophilie, parfois une leucocytose, et plus souvent une leucopénie pouvant aller jusqu'à l'agranulocytose et une réaction lymphoïde-réticulaire. Une surveillance hématologique systématique et une analyse précise des données obtenues sont essentielles pour évaluer l'état clinique du patient, la dynamique du processus et l'efficacité du traitement.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Analyse d'urine clinique

En cas de tuberculose urinaire, l'analyse d'urine est la principale méthode diagnostique en laboratoire. On peut observer une leucocyturie, une érythrocyturie, une protéinurie, une hypoisosthénurie, une mycobactériurie tuberculeuse et une bactériurie non spécifique.

La leucocyturie est le symptôme le plus fréquent de la tuberculose urinaire avant chimiothérapie spécifique et n'est absente que dans des cas exceptionnels, comme l'oblitération complète de la lumière urétérale. Le test de Nechiporenko (détermination du nombre de leucocytes dans 1 ml d'urine) permet d'évaluer plus objectivement le degré de leucocyturie dans la néphrotuberculose et, dans certains cas, de la détecter grâce à une analyse d'urine générale normale. Il convient toutefois de noter qu'une leucocyturie peut survenir en cas de pyélonéphrite aiguë et chronique, de cystite, d'urétrite, de calculs rénaux et urétéraux.

L'érythrocyturie, comme la leucocyturie, est considérée comme l'un des signes biologiques les plus fréquents de la tuberculose génito-urinaire. La fréquence de l'hématurie dépend de la prévalence du processus; elle augmente avec le développement du processus tuberculeux destructeur dans le rein. Une érythrocyturie sans leucocyturie est plus fréquente aux stades précoces de la tuberculose rénale. L'hématurie, prédominante sur la leucocyturie, est un argument important en faveur de la tuberculose rénale pour la différencier d'une pyélonéphrite non spécifique.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Test sanguin biochimique

Dans la tuberculose, les modifications de certains paramètres biochimiques dépendent principalement de la phase du processus, des complications et de diverses maladies concomitantes. Chez les patients atteints d'une tuberculose pulmonaire et d'autres organes inactive, les protéines totales et les fractions protéiques du sérum sanguin ne sont pas modifiées et déterminent leur teneur normale.

Dans les formes aiguës de la maladie, ainsi que dans l'exacerbation et la progression des formes chroniques de tuberculose, le coefficient albumine-globuline diminue.

Le dosage sérique de la bilirubine directe et totale, de l'aspartate aminotransférase (ASAT) et de l'alanine aminotransférase (ALAT) est d'une importance capitale pour évaluer l'état fonctionnel et les lésions organiques du foie en cas de tuberculose et de ses complications. Le dosage dynamique de la bilirubine dans le traitement des patients atteints de tuberculose, notamment dans ses formes sévères, est un élément obligatoire de l'examen biochimique des patients atteints de tuberculose et est effectué mensuellement.

L'évaluation de l'état fonctionnel des reins comprend le dosage de la créatinine sérique et le calcul du débit de filtration glomérulaire selon la formule de Cockcroft-Gault. Le calcul du débit de filtration glomérulaire par le test de Reberg donne des résultats moins précis.

L’objectif principal des études biochimiques dynamiques des patients atteints de tuberculose est de surveiller l’évolution du processus, de détecter rapidement les effets secondaires des médicaments et de corriger adéquatement les troubles de l’homéostasie émergents.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Application des méthodes de recherche biochimique à la tuberculose extrapulmonaire

L'indicateur le plus informatif est considéré comme la teneur en acide tuberculostéarique dans les fluides biologiques, cependant, sa détermination est associée à des difficultés techniques (nécessité d'utiliser la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse).

La mesure de l'activité de l'adénosine désaminase, une enzyme présente dans les fluides synoviaux, péricardiques, ascitiques ou céphalorachidiens, est prometteuse. Les principaux producteurs d'adénosine désaminase sont les lymphocytes et les monocytes. La détermination de l'activité de l'adénosine désaminase dans les fluides biologiques facilite le diagnostic de la synovite tuberculeuse, de la tuberculose ganglionnaire, de la méningite tuberculeuse et de la sérite tuberculeuse.

Certains indicateurs biochimiques, en raison de leur non-spécificité, ne sont déterminés que dans les liquides biologiques proches de la lésion. Leur concentration est mesurée en réponse à l'administration sous-cutanée ou intradermique de tuberculine (généralement avant l'administration et 48 et 72 heures après). Ensuite, l'augmentation du taux du marqueur (en %) est calculée par rapport au taux initial.

Idéalement, l'activité de la transamidinase, une enzyme spécifique d'organe, est dosée dans les urines; son apparition est notée en cas de lésions rénales d'origines diverses. Le dosage de la transamidinase n'est justifié qu'en cas d'administration sous-cutanée de tuberculine afin d'exacerber le processus inflammatoire local. L'activité de la transamidinase est dosée dans les urines initialement et 24 à 72 heures après l'administration de 50 TE de tuberculine. Une augmentation de la fermenturie d'un facteur 2 ou plus permet, dans 82 % des cas, de différencier une tuberculose rénale active d'une exacerbation d'une pyélonéphrite chronique.

En cas de tuberculose des organes génitaux féminins, les concentrations sanguines d'haptoglobine et de malondialdéhyde sont déterminées par un test tuberculinique de provocation. La tuberculine est administrée par voie sous-cutanée à la dose de 50 TE et un nouvel examen biochimique est réalisé 72 heures plus tard. En cas d'étiologie tuberculeuse, l'augmentation du taux d'haptoglobine est d'au moins 28 % et celle du taux de malondialdéhyde est de 39 % ou plus. L'activité de l'adénosine désaminase est également déterminée dans le liquide péritonéal prélevé dans le cul-de-sac de Douglas. La ponction est réexaminée 72 heures après l'administration intradermique de tuberculine à des doses de 0,1 TE et 0,01 TE au niveau de la projection des organes génitaux internes sur la paroi abdominale antérieure. Une augmentation de l'activité de l'adénosine désaminase de 10 % ou plus par rapport à la valeur initiale indique un processus tuberculeux.

En cas de lésion oculaire, la réaction focale se produisant dans l'œil en réponse à une stimulation antigénique est examinée. Dans ce cas, l'apparition d'une réponse aiguë accompagnée d'une diminution des fonctions visuelles est indésirable. L'évaluation des réactions focales minimes étant souvent difficile, il est recommandé de se concentrer en parallèle sur le degré d'augmentation de l'haptoglobine ou de l'adénosine désaminase dans le sérum sanguin afin d'objectiver la conclusion.

Toutes les études biochimiques doivent être réalisées en combinaison avec d’autres méthodes.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Étude du système de coagulation sanguine

L'importance de l'étude de l'état du système de coagulation sanguine en phthisiologie s'explique par la présence d'hémoptysies ou d'hémorragies pulmonaires chez un certain nombre de patients atteints de tuberculose pulmonaire, ainsi que par les complications hémocoagulantes liées au traitement chirurgical de la tuberculose. De plus, l'hémocoagulation intravasculaire latente naturelle affecte l'évolution de la maladie et l'efficacité de la chimiothérapie.

Chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire avec une composante exsudative prédominante de l'inflammation, on observe une diminution de l'activité anticoagulante du sang. Chez les patients présentant une faible prévalence de lésions pulmonaires spécifiques avec une composante productive prédominante de l'inflammation, l'hémocoagulation intravasculaire est négligeable. Chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire avec hémoptysie et hémorragies pulmonaires, l'état du système de coagulation sanguine est différent: chez les patients présentant une perte sanguine mineure au plus fort de l'hémoptysie ou immédiatement après sa cessation, on observe une forte augmentation de la capacité de coagulation du sang due à une intensification marquée des processus de formation de thrombine, tout en maintenant une coagulabilité « structurelle » accrue. Chez les patients présentant une perte sanguine massive, on observe une diminution du potentiel de coagulation due à une diminution de la concentration de fibrinogène, de l'activité du facteur XIII et de la numération plaquettaire. Au stade du traitement chirurgical chez les patients atteints de formes limitées de tuberculose pulmonaire, on ne constate pas de perturbations significatives du système d'homéostasie. Chez les patients présentant des processus étendus, lors de la réalisation d'une pneumonectomie ou d'une pleuropneumonectomie, un syndrome DIC se développe souvent, qui peut prendre la forme d'une « seconde maladie ».

Pour surveiller l'état du système de coagulation sanguine chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire, il est nécessaire de déterminer le temps de thromboplastine partielle activée (APTT), le fibrinogène, le temps de thrombine, l'indice de prothrombine, ainsi que le temps de saignement et le temps de coagulation sanguine.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Études hormonales

Des observations expérimentales et cliniques récentes indiquent la présence de modifications du statut hormonal dans l'inflammation pulmonaire tuberculeuse spécifique. Il a été démontré que la correction des dysfonctionnements des systèmes hypophyso-surrénalien et hypophyso-thyroïdien et de la fonction pancréatique, associée à un traitement antituberculeux, contribue à l'activation de la fibrogenèse et des processus de réparation au niveau du foyer inflammatoire spécifique.

L'état fonctionnel du système hypophyso-thyroïdien est évalué par la teneur sérique en triiodothyronine (T3), thyroxine (T4) et thyréostimuline (TSH) _. Il _a été établi qu'une hypothyroïdie infraclinique est détectée chez 38 à 45 % des patients atteints de tuberculose pulmonaire, et qu'elle est le plus souvent diagnostiquée dans les formes disséminées et fibro-caverneuses de la maladie. Dans ces formes, les taux de T3 et de T4 sont fortement réduits _, et _un déséquilibre de ces hormones se manifeste par une augmentation du _{rapport T4/} T3.

La fonction corticosurrénale est évaluée par le taux de cortisol sérique, et la fonction endocrine du pancréas par la concentration d'insuline immunoréactive. En phase aiguë d'une maladie infectieuse, les besoins en cortisol et en insuline endogènes augmentent. L'hyperinsulinémie indique également une résistance des tissus à l'insuline, caractéristique de tout processus inflammatoire actif, en particulier d'un processus spécifique. La détermination de la fonction glucocorticoïde des glandes surrénales dans la tuberculose pulmonaire active permet de détecter la présence d'hypercorticisme chez la plupart des patients. Des concentrations sanguines normales de cortisol chez un patient présentant une inflammation infectieuse en phase aiguë doivent être considérées comme une insuffisance relative de la fonction glucocorticoïde du cortex surrénal, ce qui peut servir de base à un traitement substitutif par des doses adéquates de glucocorticoïdes.

Près d'un tiers des patients atteints de tuberculose pulmonaire présentent une faible insulinémie, proche de la limite inférieure de la norme, tandis que 13 à 20 % présentent un hyperinsulinisme significatif. L'hypo- et l'hyperinsulinisme relatif constituent tous deux des facteurs de risque élevés de troubles du métabolisme glucidique de gravité variable. Ces modifications de l'activité fonctionnelle des lymphocytes B pancréatiques nécessitent une surveillance régulière de la glycémie chez les patients atteints de tuberculose et une prévention précoce du diabète sucré. De plus, cela justifie l'utilisation de doses physiologiques d'insuline dans le traitement complexe de la tuberculose.

En général, la diminution des taux d'hormones thyroïdiennes, leur déséquilibre, l'hypercortisolémie et l'hyperinsulinisme sont plus prononcés chez les patients présentant une évolution sévère du processus tuberculeux, avec des lésions pulmonaires étendues et des symptômes prononcés d'intoxication tuberculeuse.

Diagnostic microbiologique de la tuberculose

Les études microbiologiques sont nécessaires pour identifier les patients atteints de tuberculose, vérifier le diagnostic, surveiller et corriger la chimiothérapie, évaluer les résultats du traitement, en d’autres termes, depuis le moment où un patient atteint de tuberculose est enregistré jusqu’à ce qu’il soit radié du registre.

Tous les programmes et projets épidémiologiques reposent sur l'évaluation du nombre de bactéries excrétrices, ce qui est impossible sans l'utilisation de méthodes de laboratoire pour la détection des mycobactéries de la tuberculose. Dans la population dite non organisée, le pourcentage de bactéries excrétrices atteint 70 ou plus, ce qui fait des méthodes de laboratoire un moyen relativement efficace d'identifier les patients atteints de tuberculose au sein de ce groupe de population.

Les méthodes microbiologiques traditionnelles de diagnostic de la tuberculose sont les études bactérioscopiques et les cultures. Les méthodes modernes incluent la culture de mycobactéries tuberculeuses dans des systèmes automatisés et la PCR. Cependant, toutes ces méthodes sont nécessairement combinées aux méthodes bactériologiques classiques.

Collecte de matériel de diagnostic

L'efficacité des tests de laboratoire dépend en grande partie de la qualité du matériel diagnostique. Le respect des règles de collecte, de stockage et de transport du matériel diagnostique, ainsi que la mise en œuvre précise de l'algorithme d'examen du patient, influencent directement le résultat et garantissent la sécurité biologique.

Divers matériaux sont utilisés pour dépister la tuberculose. La tuberculose pulmonaire étant la forme la plus courante d'infection tuberculeuse, les principaux matériaux à analyser sont les expectorations et autres types d'écoulements trachéobronchiques: écoulements des voies respiratoires supérieures obtenus après inhalation d'aérosols: eaux de lavage bronchique; lavages broncho-alvéolaires; matériel obtenu lors d'une bronchoscopie, d'une biopsie transtrachéale et intrapulmonaire: aspirat bronchique, frottis laryngés, exsudats, frottis de plaie, etc.

L'efficacité de la recherche est accrue par un prélèvement contrôlé du matériel du patient. À cet effet, une salle spécialement équipée est prévue ou des cabines spéciales sont achetées. Le prélèvement de matériel est une procédure dangereuse; par conséquent, le matériel destiné à la recherche doit être collecté conformément aux règles de sécurité en matière d'infection.

Le matériel destiné aux tests de dépistage de Mycobacterium tuberculosis est collecté dans des flacons stériles munis de bouchons bien vissés pour éviter la contamination de l'environnement et protéger le matériel collecté de toute contamination.

Les flacons destinés à recueillir du matériel de diagnostic doivent répondre aux exigences suivantes:

• doit être fabriqué dans un matériau résistant aux chocs;
• devrait fondre facilement lorsqu'il est autoclavé;
• être d'un volume suffisant (40-50 ml):
• avoir une large ouverture pour recueillir les expectorations (diamètre d'au moins 30 mm);
• être facile à manipuler, transparent ou translucide, de sorte que la quantité et la qualité de l'échantillon collecté puissent être évaluées sans ouvrir le couvercle.

Pour obtenir des résultats de recherche optimaux, les conditions suivantes doivent être remplies:

• la collecte du matériel doit être effectuée avant le début de la chimiothérapie;
• le matériel pour l'étude doit être collecté avant de manger ou de prendre des médicaments le matin;
• Pour l'étude, il est conseillé de recueillir au moins trois échantillons d'expectorations matinales. Les expectorations sont collectées pendant trois jours consécutifs;
• Le matériel collecté doit être livré au laboratoire le plus rapidement possible:
• dans les cas où il est impossible de livrer le matériel au laboratoire immédiatement, il est conservé dans un réfrigérateur à une température de l'air de 4 °C pendant 48 heures maximum;
• Lors du transport du matériel, il est nécessaire de porter une attention particulière à l'intégrité des bouteilles.

Les expectorations correctement recueillies présentent un caractère muqueux ou mucopurulent. Le volume optimal de la portion d'expectoration examinée est de 3 à 5 ml.

Le recueil des expectorations est effectué sous la supervision d'un professionnel de santé. Les personnes chargées du recueil des expectorations doivent veiller au respect de certaines règles:

• Il est nécessaire d'expliquer au patient le but de l'examen et la nécessité d'expectorer non pas de la salive ou du mucus nasopharyngé, mais le contenu des voies respiratoires profondes. Cela peut être obtenu par une toux productive après plusieurs respirations profondes (2 à 3). Il est également nécessaire d'avertir le patient qu'il doit d'abord se rincer la bouche à l'eau bouillante afin d'éliminer la majeure partie de la microflore buccale et les débris alimentaires qui compliquent l'examen des expectorations.
• Le professionnel de santé chargé de recueillir les expectorations doit, en plus d’une blouse et d’une charlotte, porter un masque, des gants en caoutchouc et un tablier en caoutchouc;
• debout derrière le patient, il lui est conseillé de tenir le flacon le plus près possible de ses lèvres et d'y séparer immédiatement les expectorations lorsqu'il les crache, tout en veillant à ce que le flux d'air soit dirigé loin de l'agent de santé:
• Une fois le recueil des expectorations terminé, l'agent de santé doit refermer soigneusement le flacon et évaluer la quantité et la qualité des expectorations recueillies. Le flacon est ensuite étiqueté et placé dans une boîte spéciale pour être transporté au laboratoire.

Si le patient ne produit pas d'expectorations, il faut lui administrer un expectorant la veille et tôt le matin du jour du prélèvement: extrait de racines de guimauve (mucaltine), bromhexine, ambroxol, etc., ou recourir à une inhalation irritante, à l'aide du matériel installé dans la salle de prélèvement. Le matériel ainsi prélevé n'est pas susceptible d'être conservé et doit être examiné le jour du prélèvement. Pour éviter tout rejet au laboratoire, une mention spéciale doit être portée sur la demande d'admission.

Si les études microbiologiques ne sont pas réalisées dans un établissement donné, le matériel diagnostique collecté doit être livré au laboratoire de manière centralisée, à condition qu'il soit conservé au réfrigérateur ou avec des conservateurs entre les livraisons. Le matériel est livré au laboratoire dans des boîtes de transport facilement désinfectables. Chaque échantillon doit être muni d'une étiquette appropriée et l'ensemble du lot doit être accompagné d'un formulaire d'accompagnement dûment rempli.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Modes et fréquence d'examen des patients

Lors de l'examen initial, dit diagnostique, d'un patient atteint de tuberculose, il est nécessaire d'examiner au moins 3 portions d'expectorations recueillies sous la surveillance du personnel médical sur une période de 2 ou 3 jours, ce qui augmente l'efficacité de la microscopie.

Le dépistage primaire de la tuberculose devrait être effectué par tous les établissements médicaux et diagnostiques du système de santé. Afin d'accroître l'efficacité de ce dépistage, des centres de microscopie ont récemment été créés sur la base de laboratoires de diagnostic clinique, équipés de microscopes et d'équipements modernes pour garantir la sécurité épidémique.

Les institutions antituberculeuses utilisent un protocole d'examen prévoyant au moins trois examens des expectorations ou d'autres éléments diagnostiques en trois jours. Pendant le traitement, des analyses microbiologiques sont réalisées régulièrement, au moins une fois par mois pendant la phase de chimiothérapie intensive. Lors du passage à la phase de suivi, les analyses sont espacées de deux à trois mois, la fréquence des analyses étant réduite à deux.

Caractéristiques de la collecte de matériel diagnostique pour la tuberculose extrapulmonaire

Une caractéristique du matériel pathologique dans les formes extrapulmonaires de tuberculose est la faible concentration de mycobactéries tuberculeuses, ce qui nécessite des méthodes de recherche microbiologique plus sensibles, principalement des méthodes de semis sur un milieu nutritif.

En cas de tuberculose génito-urinaire, l'urine est le matériel d'examen le plus accessible. Le recueil d'urine doit être effectué par une infirmière spécialement formée.

Les organes génitaux externes sont lavés à l'eau et au savon ou avec une solution diluée de permanganate de potassium. L'orifice externe de l'urètre est soigneusement traité. La partie médiane de l'urine matinale est recueillie dans un flacon stérile: chez l'homme, naturellement, à l'aide d'une sonde urinaire chez la femme. L'urine du bassinet est recueillie dans des tubes à essai stériles lors du cathétérisme d'un ou deux reins, et dans ce dernier cas, séparément de chaque rein. Une petite quantité de cette urine est centrifugée et le sédiment est examiné.

Chez l'homme, le sperme, les ponctions testiculaires et les sécrétions prostatiques sont centrifugés afin d'obtenir un sédiment. En cas de localisation d'un processus spécifique dans la région génitale masculine, le massage prostatique peut favoriser la libération de sécrétions contenant des mycobactéries de la tuberculose.

Le sang menstruel est prélevé chez la femme par aspiration ou à l'aide d'une cape de Kafka. Le sang obtenu est débarrassé des érythrocytes par lavage à l'eau distillée, puis centrifugé. Le sédiment est ensuite examiné.

Les sécrétions du canal cervical de l'utérus sont collectées dans un récipient ou un bouchon Kafka, c'est-à-dire qu'il est souhaitable d'accumuler 1 à 2 ml de matériel pathologique.

Le matériel obtenu lors d'interventions chirurgicales sur les reins, les organes génitaux, de biopsies et de grattages endométriaux est homogénéisé. Pour ce faire, il est placé dans un mortier stérile et soigneusement broyé avec des ciseaux stériles. Du sable de rivière stérile est ajouté à la suspension obtenue en quantité égale à sa masse, puis 0,5 à 1,0 ml de solution isotonique de chlorure de sodium est ajouté et le tout est broyé jusqu'à formation d'une masse pâteuse avec l'ajout de solution isotonique de chlorure de sodium (4 à 5 ml). La masse est ensuite laissée à décanter pendant 1 à 1,5 minute, puis le surnageant est examiné.

Tuberculose ostéo-articulaire. Le pus prélevé à l'aide d'une seringue stérile est placé dans un récipient stérile et immédiatement acheminé au laboratoire. À l'aide d'une pipette stérile, préalablement humidifiée avec une solution isotonique stérile de chlorure de sodium, 2 à 5 ml de pus sont prélevés, transférés dans un flacon contenant des billes, puis 2 à 3 ml supplémentaires de solution isotonique de chlorure de sodium sont ajoutés. Le flacon est bouché et agité dans un agitateur pendant 8 à 10 minutes. La suspension homogénéisée est examinée.

Dans les formes fistuleuses de tuberculose ostéoarticulaire, le pus est prélevé dans la fistule. L'écoulement abondant est recueilli directement dans un tube à essai. En cas d'écoulement pus peu abondant, le trajet fistuleux est lavé avec une solution isotonique stérile de chlorure de sodium, et le liquide de lavage recueilli dans un tube à essai ou un tampon imbibé de pus est envoyé pour examen.

Le matériel chirurgical obtenu lors d'interventions chirurgicales sur les os et les articulations peut être constitué de masses purulentes-nécrotiques, de granulations, de tissu cicatriciel, de tissu osseux, de tissu synovial et d'autres substrats. Son traitement est effectué comme dans le cas de la tuberculose rénale.

L'examen microbiologique du liquide synovial dans une solution de citrate de sodium à 3 % (dans un rapport 1:1) pour prévenir la coagulation est effectué immédiatement après la ponction.

Tuberculose ganglionnaire. Le pus extrait lors de la ponction ganglionnaire est examiné de la même manière que le pus d'un abcès. Le tissu ganglionnaire obtenu lors d'interventions chirurgicales et de biopsies est examiné comme pour les autres formes de tuberculose.

L'étude des selles pour Mycobacterium tuberculosis est réalisée extrêmement rarement en raison de l'absence presque totale de résultats positifs.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Microscopie des mycobactéries

La microscopie des expectorations est une méthode relativement rapide, simple et peu coûteuse, qui doit être utilisée dans tous les cas de suspicion de tuberculose. De plus, cet examen permet d'évaluer l'efficacité de la chimiothérapie et de confirmer la guérison ou l'échec du traitement en l'absence de résultats de culture.

Deux méthodes d'examen microscopique sont utilisées:

• méthode de microscopie directe, lorsqu'un frottis est préparé directement à partir du matériel diagnostique;
• une méthode de microscopie de sédiments préparés à partir de matériaux traités avec des décontaminants pour la recherche culturelle.

La première méthode est utilisée dans les laboratoires où seules des études microscopiques sont réalisées (laboratoires de diagnostic clinique du réseau médical général).

Les meilleurs résultats de l'examen microscopique sont obtenus en concentrant le matériel diagnostique (par exemple, par centrifugation).

Pour détecter Mycobacterium tuberculosis avec une probabilité de 50 % par microscopie, 1 ml d'expectoration doit contenir plus de 5 000 cellules microbiennes. Les expectorations des patients atteints de formes pulmonaires de tuberculose contiennent généralement un nombre important de bactéries acido-résistantes, ce qui permet une détection fiable par bactérioscopie. La sensibilité diagnostique de cette méthode peut être augmentée par l'examen de plusieurs échantillons d'expectorations d'un même patient. Un résultat négatif à l'examen bactérioscopique n'exclut pas le diagnostic de tuberculose, car les expectorations de certains patients contiennent moins de Mycobacterium que ce qui est détectable par microscopie. Une mauvaise préparation des frottis d'expectoration peut également être à l'origine d'un résultat négatif à l'examen bactérioscopique.

La méthode la plus courante pour détecter les mycobactéries acido-résistantes dans un frottis est la coloration de Ziehl-Neelsen. Cette méthode repose sur la pénétration de la fuchsine phéniquée dans une cellule microbienne à travers une membrane comprenant une couche de cire et de lipides, sous l'effet simultané du chauffage et de la forte action de gravure du phénol. La décoloration ultérieure du frottis avec une solution à 25 % d'acide sulfurique ou à 3 % d'alcool chlorhydrique entraîne la décoloration de toutes les structures non acido-résistantes. Les éléments décolorés du frottis sont colorés avec une solution à 0,3 % de bleu de méthylène. Les mycobactéries ne perçoivent pas les colorants anilines classiques; les mycobactéries acido-résistantes sont donc colorées en rouge framboise, tandis que les autres microbes et éléments cellulaires sont colorés en bleu.

Pour examiner les frottis colorés selon la méthode de Ziehl-Neelsen, utilisez un microscope binoculaire optique équipé d'un objectif à immersion (grossissement 90 ou 100 fois) et d'un oculaire grossissant 7 ou 10 fois. 100 champs de vision sont examinés, ce qui est suffisant pour détecter une mycobactérie isolée dans le frottis. Si le résultat de cet examen est négatif, il est recommandé d'examiner 200 champs de vision supplémentaires pour confirmation. Les résultats sont enregistrés, indiquant le nombre de mycobactéries acido-résistantes (BAAR) détectées.

Outre cette méthode, la coloration au fluorochrome est utilisée en microscopie luminescente, ce qui permet d'obtenir des résultats optimaux. Cette méthode augmente l'efficacité de la microscopie de 10 à 15 %. Lorsque les mycobactéries sont traitées avec des colorants luminescents (auramine, rhodamine, etc.), ces substances se lient également aux structures cireuses de la cellule microbienne. Lorsque les cellules colorées sont irradiées par une source lumineuse excitante (un certain spectre de rayonnement ultraviolet), elles commencent à briller en orange ou en rouge vif sur un fond noir ou vert foncé. Grâce à la luminosité et au contraste élevés de l'image visible, le grossissement global du microscope peut être réduit de 4 à 10 fois, ce qui élargit le champ de vision et réduit le temps d'observation de la préparation. De plus, la profondeur de champ nettement plus importante améliore le confort d'étude.

En microscopie à fluorescence, l'observation d'une même zone de frottis est nettement plus rapide qu'en microscopie optique de frottis colorés selon la méthode de Ziehl-Neelsen. Si un microscopiste observe environ 20 à 25 frottis de ce type au cours d'une journée de travail, la microscopie à fluorescence lui permet d'examiner simultanément plus de 60 à 80 échantillons. Les microscopistes expérimentés savent que la coloration des cellules avec un mélange d'auramine et de rhodamine est spécifique des mycobactéries acido-résistantes, qui ont alors l'aspect de bâtonnets dorés. Les saprophytes sont colorés en vert.

Un autre avantage important de la méthode de microscopie à fluorescence est la possibilité de détecter des mycobactéries altérées qui ont perdu leurs propriétés de résistance aux acides sous l'influence d'un certain nombre de facteurs défavorables, en particulier une chimiothérapie intensive, et ne sont donc pas détectées par la coloration de Ziehl-Neelsen.

Les inconvénients de la microscopie à fluorescence incluent le coût relativement élevé du microscope et de son fonctionnement. Cependant, dans les laboratoires centralisés ou de grande taille, où la charge de travail dépasse la norme de trois techniciens travaillant avec trois microscopes conventionnels, il est plus économique d'utiliser un seul microscope à fluorescence.

Les méthodes bactérioscopiques présentent une spécificité assez élevée (89-100 %). Environ 97 % des résultats positifs obtenus par toute méthode de microscopie sont clairement confirmés par les résultats de l'ensemencement.

Il convient de noter que l'examen microscopique d'un frottis de matériel pathologique ne permet pas de déterminer l'espèce de mycobactéries acido-résistantes détectées. La méthode microscopique permet uniquement de conclure à la présence ou à l'absence de micro-organismes acido-résistants dans la préparation, ce qui s'explique par l'existence dans la nature d'un grand nombre de micro-organismes acido-résistants non tuberculeux, morphologiquement similaires aux mycobactéries du complexe tuberculeux.

L’évaluation des résultats de microscopie est réalisée en unités semi-quantitatives.

Afin de pouvoir comparer les résultats de différentes méthodes de microscopie, des coefficients empiriques sont introduits. Par exemple, pour comparer les résultats d'un frottis coloré par des colorants fluorescents avec les données d'une étude en microscopie optique (grossissement 1000 fois), il est nécessaire de diviser le nombre de mycobactéries acido-résistantes détectées au microscope à fluorescence par le coefficient correspondant: à un grossissement de 250 fois, par 10, à un grossissement de 450 fois, par 4 et à un grossissement de 630 fois, par 2.

Caractéristiques de la microscopie dans la tuberculose extrapulmonaire

La microscopie directe est réalisée, ainsi que la microscopie des frottis préparés après enrichissement, puis coloration selon la méthode de Ziehl-Neelsen ou par des colorants fluorescents. La microscopie directe des frottis est inefficace en raison de la faible concentration de mycobactéries dans le matériel; il est donc plus judicieux d'utiliser des méthodes d'enrichissement. La centrifugation est la plus efficace. Si le matériel biologique est visqueux, on utilise une centrifugation avec homogénéisation et liquéfaction simultanées, réalisée à l'aide de centrifugeuses à grande vitesse d'une force de centrifugation de 3 000 g et de solutions d'hypochlorite. Les autres méthodes d'enrichissement, comme la microflottation, ne sont actuellement pas utilisées en raison de la formation d'aérosols biologiquement dangereux.

[ 37 ]

Méthode de culture pour le diagnostic de la tuberculose

La méthode d'ensemencement, ou méthode de culture, est plus sensible que la microscopie de frottis et présente de nombreux avantages. Elle permet de détecter plusieurs dizaines de mycobactéries viables dans le matériel examiné et présente une valeur diagnostique élevée. Ceci est particulièrement important lors de l'examen de matériel provenant de patients récemment diagnostiqués ou traités qui excrètent un faible nombre de mycobactéries.

Comparée à la microscopie, la recherche par culture permet d'augmenter de plus de 15 à 25 % le nombre de patients tuberculeux détectés, ainsi que de détecter la tuberculose à un stade précoce, lorsque la maladie est encore facilement traitable. Un avantage majeur de la recherche par culture est la possibilité d'obtenir une culture d'agents pathogènes, qui peut être identifiée et étudiée quant à sa sensibilité aux médicaments, sa virulence et d'autres propriétés biologiques.

Les inconvénients des méthodes de culture comprennent leur durée (la période d’attente pour les matériaux atteint 10 semaines), leur coût plus élevé et la complexité du traitement du matériel de diagnostic.

Principes du traitement pré-ensemencement du matériel de diagnostic

Les méthodes microbiologiques conventionnelles ne permettent pas de réaliser des tests de dépistage de la tuberculose. En effet, les mycobactéries tuberculeuses se développent très lentement et la plupart des échantillons cliniques contiennent des micro-organismes et des champignons pyogènes et putréfiants à croissance rapide. Leur croissance rapide sur des milieux nutritifs riches perturbe le développement des mycobactéries et empêche l'isolement de l'agent pathogène de la tuberculose. Le matériel diagnostique doit donc être prétraité avant l'ensemencement. De plus, les mycobactéries libérées par les voies respiratoires du patient sont généralement entourées d'une grande quantité de mucus, ce qui rend leur concentration difficile. Par conséquent, les expectorations et autres matériels similaires doivent être liquéfiés et décontaminés avant d'être ensemencés.

Tous les détergents et décontaminants ont un effet toxique plus ou moins prononcé sur les mycobactéries. Le traitement peut entraîner la mort de jusqu'à 90 % des mycobactéries. Afin de préserver une proportion suffisante de la population mycobactérienne, il est nécessaire d'utiliser des méthodes de traitement douces permettant, d'une part, de supprimer les micro-organismes pyogènes et putréfiants à croissance rapide et, d'autre part, de préserver au maximum la viabilité des mycobactéries présentes dans le matériau.

Selon le matériau, son homogénéité et son niveau de contamination, différents décontaminants sont utilisés pour le traitement de pré-ensemencement: pour les expectorations, une solution d’hydroxyde de sodium à 4 %, des solutions de phosphate trisodique à 10 %, du chlorure de benzalkonium, du NALC-NaOH (N-acétyl-L-cystéine-hydroxyde de sodium) avec une concentration finale en NaOH de 1 %; pour l’urine et autres matériaux liquides, une solution d’acide sulfurique à 3 %; pour les échantillons contaminés et les matériaux contenant des graisses, une solution d’acide oxalique jusqu’à 5 %. De plus, dans certains cas, des enzymes et des tensioactifs (détergents) sont utilisés. L’utilisation de Tween et de certains autres détergents s’accompagne d’une mortalité moindre des cellules mycobactériennes (40 à 50 % survivent). Cependant, ils ne peuvent être utilisés que pour les matériaux liquides. Le NALC-NaOH, produit en kits, est le plus utilisé au monde. Cette méthode permet d’isoler plus de 85 % de la population cellulaire mycobactérienne. La décontamination des matières solides contenant des tissus est plus complexe, car il est difficile d'estimer le degré de dispersion du matériau lors de l'homogénéisation. Par exemple, le traitement des biopsies de ganglions lymphatiques s'accompagne souvent d'une fréquence accrue de contamination par une flore étrangère. Dans ce cas, de l'étonium à 1 % peut être utilisé.

Les matériaux hétérogènes sont homogénéisés à l'aide de billes de verre en présence de décontaminants. Les matériaux liquides sont précentrifugés et seul le sédiment est traité.

Technique de semis et d'incubation

Après un traitement préliminaire, le matériel est centrifugé, ce qui précipite les mycobactéries et augmente leur teneur dans le sédiment (« enrichissement du sédiment »). Le sédiment obtenu est neutralisé et inoculé à la surface de milieux nutritifs denses ou de tubes à essai contenant un milieu liquide (semi-liquide). Des frottis pour examen microscopique sont préparés à partir du sédiment restant. La technique d'ensemencement doit empêcher toute contamination croisée du matériel de diagnostic.

Pour une interprétation clinique fiable des résultats de la recherche microbiologique, la règle suivante doit être respectée: les études microscopiques et culturelles doivent être réalisées en parallèle à partir du même échantillon de matériel diagnostique.

Les tubes ensemencés sont placés dans un thermostat à 37 ^° C pendant deux jours en position horizontale. Cela assure une absorption plus uniforme du matériau dans le milieu nutritif. Après deux jours, les tubes sont remis en position verticale et fermés hermétiquement avec des bouchons en caoutchouc ou en silicone pour éviter le dessèchement du milieu ensemencé.

Les cultures sont conservées dans un thermostat à 37 ^° C pendant 10 à 12 semaines, avec des inspections hebdomadaires régulières. Les paramètres suivants sont enregistrés à chaque inspection de contrôle:

• période de croissance visuellement observable à partir du jour du semis;
• taux de croissance (nombre d'UFC);
• contamination de la culture par une flore microbienne étrangère ou des champignons (ces tubes à essai sont retirés);
• Aucune croissance visible. Les tubes sont laissés dans le thermostat jusqu'à la prochaine inspection.

Milieux nutritifs

Différents milieux nutritifs sont utilisés pour cultiver les mycobactéries: solides, semi-liquides et liquides. Cependant, aucun des milieux nutritifs connus ne possède les propriétés nécessaires à la croissance de toutes les cellules mycobactériennes. Pour améliorer l'efficacité, il est recommandé d'utiliser simultanément deux ou trois milieux nutritifs de compositions différentes.

L'OMS recommande le milieu de Lowenstein-Jensen comme milieu standard pour l'isolement primaire de l'agent pathogène de la tuberculose et la détermination de sa sensibilité aux médicaments. Il s'agit d'un milieu dense à base d'œufs sur lequel la croissance des mycobactéries est obtenue 20 à 25 jours après l'ensemencement du matériel bactérioscopiquement positif. L'ensemencement du matériel bactérioscopiquement négatif nécessite une période d'incubation plus longue (jusqu'à 10 à 12 semaines).

Dans notre pays, le milieu œuf Finn-II proposé par ER Finn s'est largement répandu. Il diffère par l'utilisation de glutamate de sodium au lieu de L-asparagine, qui active d'autres voies de synthèse des acides aminés chez les mycobactéries. La croissance apparaît un peu plus tôt sur ce milieu et la fréquence d'isolement des mycobactéries est de 6 à 8 % supérieure à celle du milieu de Lowenstein-Jensen.

Pour accroître l'efficacité du diagnostic bactériologique de la tuberculose extrapulmonaire, il est conseillé d'inclure des milieux Finn-II modifiés dans le complexe de milieux nutritifs. Pour accélérer la croissance, du thioglycolate de sodium à 0,05 % est ajouté au milieu nutritif Finn-II, ce qui réduit la concentration en oxygène. Pour protéger les systèmes enzymatiques des mycobactéries des produits toxiques de la peroxydation lipidique, l'acétate d'α-tocophérol, un antioxydant, est ajouté au milieu nutritif Finn-II à une concentration de 0,001 μg/ml. Le matériel diagnostique est ensemencé selon la méthode standard.

Dans les laboratoires antituberculeux en Russie, d'autres modifications de milieux nutritifs denses sont également utilisées: le milieu nutritif "Novaya" proposé par GG Mordovsky, les milieux nutritifs A-6 et A-9 développés par VA Anikin, etc.

En raison du fait que pendant la chimiothérapie, des dommages se produisent dans divers systèmes métaboliques de la cellule microbienne, une partie de la population mycobactérienne perd la capacité de se développer normalement sur des milieux nutritifs conventionnels et nécessite des milieux nutritifs osmotiquement équilibrés (semi-liquides ou liquides).

Évaluation et enregistrement des résultats de la culture matérielle diagnostique

Certaines souches et certains types de mycobactéries se développent lentement, la croissance pouvant apparaître dès le 90e jour. Le nombre de ces cultures est faible, mais cela oblige à conserver les semis dans un thermostat pendant 2,5 à 3 mois.

Les cultures virulentes de Mycobacterium tuberculosis se développent généralement sur des milieux solides à base d'œufs sous forme de colonies de forme R de taille et d'aspect variables. Ces colonies sont sèches, ridées, de couleur ivoire et légèrement pigmentées. Sur d'autres milieux, les colonies de Mycobacterium tuberculosis peuvent être plus humides. Après une chimiothérapie ou pendant le traitement, des colonies lisses à croissance humide (formes S) peuvent être isolées.

Lors de l'isolement des cultures, un ensemble d'études spéciales est utilisé pour distinguer les mycobactéries de la tuberculose des mycobactéries non tuberculeuses et des saprophytes acido-résistants.

Une réponse positive est donnée après un examen microscopique obligatoire d'un frottis issu de colonies cultivées, coloré selon la méthode de Ziehl-Neelsen. En cas de croissance de mycobactéries, des bâtonnets rouge vif sont observés dans les frottis, isolés ou groupés, formant des amas en forme de feutre ou de tresses. Dans les cultures jeunes, en particulier celles isolées de patients traités par chimiothérapie pendant une longue période, les mycobactéries se distinguent par un polymorphisme prononcé, allant jusqu'à la présence de variantes courtes, presque coccoïdes ou allongées, ressemblant à du mycélium fongique, ainsi que de formes en forme de bâtonnets.

L'intensité de la croissance mycobactérienne est indiquée selon le schéma suivant: (+) - 1 à 20 UFC dans un tube à essai (faible excrétion bactérienne); (++) - 20 à 100 UFC dans un tube à essai (excrétion bactérienne modérée); (+++) - > 100 UFC dans un tube à essai (excrétion bactérienne abondante). Pour le diagnostic de la tuberculose en laboratoire, il ne suffit pas de répondre par une méthode précise si des mycobactéries ont été détectées. Il est également nécessaire d'avoir une idée précise du volume et de la nature de la population mycobactérienne, de sa composition et de ses propriétés. Ces données permettent d'interpréter correctement l'état du processus, de planifier la stratégie et d'adapter rapidement le traitement.

Ces dernières années, des milieux nutritifs à base d'agar, enrichis de divers additifs de croissance et utilisant un mélange gazeux spécifique, ont été proposés pour accélérer la croissance des mycobactéries. Pour favoriser la croissance des mycobactéries sur ces milieux, une atmosphère à forte teneur en dioxyde de carbone (4-7 %) est créée pendant la culture. Des incubateurs à CO2 spéciaux sont utilisés à cet effet _. Cependant, les systèmes automatisés de culture de mycobactéries ont connu les plus grands développements: MGIT-BACTEC-960 et MB/Bact.

L'un de ces systèmes est le tube indicateur de croissance des mycobactéries (MGIT), un développement de haute technologie conçu pour accélérer le diagnostic bactériologique de la tuberculose et déterminer la sensibilité des mycobactéries aux médicaments de première intention et à certains médicaments de deuxième intention. Le MGIT est conçu pour être utilisé avec le dispositif VASTEC-960. Les micro-organismes sont cultivés dans des tubes à essai spéciaux contenant un milieu nutritif liquide à base de milieu Middlebrook-7H9 modifié. Pour stimuler la croissance des mycobactéries et inhiber la croissance de la microflore étrangère, le supplément de croissance MGIT et un mélange de médicaments antibactériens PANTA sont utilisés.

La croissance des micro-organismes est enregistrée optiquement. Elle repose sur la fluorescence, qui se produit lorsque les mycobactéries consomment de l'oxygène pendant leur croissance. Un fluorochrome oxygéno-dépendant est contenu au fond d'un tube à essai spécial et recouvert d'une couche de silicone. La reproduction des mycobactéries entraîne une diminution de la quantité et de la concentration d'oxygène dans le tube à essai, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence. Cette fluorescence devient visible lorsque le tube à essai est irradié aux ultraviolets et est automatiquement enregistrée par les photocapteurs intégrés au dispositif VASTES-960. L'intensité de la luminescence est mesurée en unités de croissance (UG). Les données de croissance sont automatiquement saisies dans un ordinateur où elles peuvent être enregistrées. L'analyse informatique des courbes de croissance peut fournir des informations sur la présence de divers pools de mycobactéries, y compris non tuberculeuses, et permet également d'évaluer les propriétés de croissance des mycobactéries.

Grâce à l'introduction de ces systèmes, la durée de croissance des mycobactéries a été considérablement réduite, atteignant en moyenne 11 jours sur VASTEC-960 et 19 jours sur MB/Bact, contre 33 jours sur un milieu nutritif dense standard. Il est à noter que ces systèmes nécessitent un personnel hautement qualifié. L'ensemencement sur milieu liquide s'accompagne obligatoirement d'un semis sur milieu de Lowenstein-Jensen, qui joue le rôle de milieu de réserve lorsque les mycobactéries de la tuberculose ne se développent pas sur d'autres milieux.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Détermination de la sensibilité aux médicaments des mycobactéries

La détermination du spectre et du degré de sensibilité des mycobactéries aux antituberculeux revêt une importance clinique majeure, ainsi que pour l'évaluation épidémiologique de la propagation de la tuberculose pharmacorésistante. De plus, la surveillance de la pharmacorésistance permet d'évaluer l'efficacité du programme antituberculeux dans son ensemble, car elle constitue un indicateur essentiel de l'efficacité de toutes les composantes des mesures antituberculeuses.

Fréquence et moment des tests de sensibilité aux médicaments:

• avant le début du traitement, une fois pour déterminer la stratégie et les tactiques de traitement:
• Lors de l'isolement de cultures à partir de divers matériaux provenant d'un patient (expectorations, LBA, urine, exsudats, liquide céphalo-rachidien, etc.), toutes les souches isolées sont examinées:
• à la fin de la phase intensive de traitement en l'absence de dynamique clinique et radiologique:
• s'il est nécessaire de modifier le schéma thérapeutique en cas de:
  • absence de négativité des expectorations;
  • reculture après négativité des expectorations;
  • Une forte augmentation de la quantité de BAAR dans un frottis après une diminution initiale. Il est bien connu que des souches de Mycobacterium tuberculosis présentant différentes sensibilités aux médicaments sont isolées à partir de matériel provenant d'un patient atteint de tuberculose. La sensibilité des souches aux médicaments antituberculeux peut varier selon le spectre des médicaments, le degré, la fréquence et la vitesse de développement de la résistance.

Le degré de résistance aux médicaments de Mycobacterium tuberculosis est déterminé conformément à des critères établis, qui sont axés sur la signification clinique de la résistance et dépendent de l'activité antituberculeuse du médicament, de sa pharmacocinétique, de sa concentration dans la lésion, de la dose thérapeutique maximale, etc.

La détermination de la sensibilité des mycobactéries aux médicaments est actuellement réalisée à l'aide de méthodes microbiologiques:

• concentrations absolues (méthode de dilution sur milieux nutritifs solides ou liquides),
• proportions,
• coefficient de résistance.

Habituellement, la résistance se manifeste par une croissance visuelle de colonies de Mycobacterium tuberculosis. Cependant, il existe des méthodes qui induisent la croissance dès les premiers stades de la division cellulaire mycobactérienne, sous forme de réactions colorées. Ces méthodes réduisent la durée du test de 3-4 à 2 semaines.

La méthode de concentration absolue recommandée par le Comité de chimiothérapie de l'OMS s'est répandue en Russie comme méthode unifiée. D'un point de vue méthodologique, c'est la plus simple, mais elle exige une standardisation et une précision élevées des procédures de laboratoire. Le test de sensibilité aux médicaments consiste en un ensemble de tubes à essai contenant un milieu nutritif modifié avec des médicaments antituberculeux. L'ensemble comprend deux ou trois tubes à essai contenant différentes concentrations de chaque médicament utilisé, un tube témoin contenant un milieu sans médicament et un tube à essai contenant 1 000 µg/ml de salicylate de sodium ou 500 µg/ml d'acide paranitrobenzoïque pour détecter la croissance des mycobactéries non tuberculeuses.

Pour préparer un ensemble de milieux contenant des préparations, utilisez un milieu de Lowenstein-Jensen modifié (sans amidon), que vous versez dans des flacons. Un volume de la dilution correspondante du médicament antituberculeux est ajouté à chaque flacon. Le contenu des flacons est soigneusement mélangé, versé dans des tubes à essai et coagulé en position inclinée pendant 40 minutes à une température de 85 °C. Il est recommandé de coaguler le milieu dans un coagulateur électrique à régulation automatique de température. Milieu contenant des médicaments antituberculeux

Les préparations de la première série peuvent être conservées au réfrigérateur entre 2 et 4 °C pendant 1 mois, celles de la deuxième série ne dépassant pas 2 semaines. Le stockage des milieux contenant des médicaments à température ambiante est inacceptable. Lors de la préparation des solutions de médicaments antituberculeux, leur activité est prise en compte, la concentration étant calculée en tenant compte du poids moléculaire de la partie non spécifique du médicament, de sa pureté, etc. Pour déterminer la sensibilité aux médicaments, seules des substances chimiquement pures sont utilisées.

Le principe de cette méthode consiste à déterminer la concentration d'un médicament antituberculeux capable de supprimer la croissance d'une partie significative de la population mycobactérienne. Correctement mise en œuvre, cette méthode présente une bonne fiabilité.

Avant de réaliser le test, il est nécessaire de s'assurer que la culture isolée de Mycobacterium tuberculosis ne contient pas de microflore étrangère. Une suspension homogène contenant 500 millions de corps microbiens dans 1 ml (standard de turbidité optique 5 unités) est préparée à partir de la culture de mycobactéries dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 %. La suspension obtenue est diluée avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % (1:10) et 0,2 ml de suspension est ajouté à chaque tube à essai du kit de milieux nutritifs. Les tubes à essai ensemencés sont placés dans un thermostat à 37 °C et maintenus horizontalement pendant 2 à 3 jours afin que la surface inclinée du milieu nutritif soit uniformément ensemencée avec la suspension de Mycobacterium tuberculosis. Les tubes à essai sont ensuite placés en position verticale et incubés pendant 3 à 4 semaines. Les résultats sont enregistrés après 3 à 4 semaines.

Étant donné que l'isolement de l'agent pathogène à partir du matériel clinique sur milieu nutritif prend au moins 1 à 1,5 mois, les résultats de la détermination de la sensibilité aux médicaments par cette méthode ne peuvent être obtenus qu'après 2 à 2,5 mois d'ensemencement. C'est l'un des principaux inconvénients de cette méthode.

Les résultats des tests de sensibilité aux médicaments mycobactériens sont interprétés selon certains critères. Sur milieu solide, une culture est considérée comme sensible à la concentration du médicament contenu dans le milieu si le nombre de colonies mycobactériennes cultivées dans un tube à essai contenant le médicament ne dépasse pas 20, avec une croissance abondante dans un tube témoin sans médicament. Ce n'est qu'en présence de plus de 20 colonies que la culture est considérée comme résistante à une concentration donnée. En pratique, lorsque des résultats de croissance en tubes à essai proches de 20 UFC sont obtenus, il est nécessaire d'informer le service clinique que la sensibilité ou la résistance est limite, car cela peut parfois expliquer la dynamique floue des indicateurs cliniques.

Pour diverses préparations, une concentration est établie à laquelle la reproduction d'une proportion critique de la population mycobactérienne est observée. Ces concentrations sont dites « critiques ». L'ampleur de la croissance de la population mycobactérienne sur un milieu nutritif contenant la préparation à une concentration critique sert de critère de stabilité.

En pratique phthisiologique nationale, la détermination de la résistance aux médicaments ne se limite pas à la détermination des concentrations critiques. En effet, une définition plus précise du niveau de résistance de l'agent pathogène permet au clinicien de formuler plus précisément les stratégies de chimiothérapie, en s'appuyant sur la connaissance de l'effet potentialisateur des associations médicamenteuses, d'anticiper les résistances croisées ou d'utiliser des médicaments plus efficaces du groupe d'antituberculeux utilisé.

La méthode de la concentration absolue est la plus simple, mais aussi la plus sensible aux erreurs de mise en œuvre. Plus fiable, notamment pour déterminer la sensibilité aux médicaments de deuxième intention, et largement répandue hors de Russie, la méthode des proportions. Elle prend en compte les défauts de la méthode de la concentration absolue, mais sa mise en œuvre est plus laborieuse.

La méthode est très similaire à la méthode de concentration absolue. La préparation des tubes à essai contenant les médicaments est identique. Cependant, la dose d'ensemencement de la suspension de mycobactéries tuberculeuses est réduite de 10 fois, ce qui élimine la fréquence de résistance spontanée de certaines souches de mycobactéries tuberculeuses à des médicaments tels que l'éthambutol, le prothionamide et la capréomycine. Deux ou trois tubes contenant une dose d'ensemencement égale à celle des tubes à essai, dilués successivement 10 et 100 fois, sont utilisés comme témoins. Le critère de résistance est la proportion de croissance de mycobactéries tuberculeuses observée visuellement. Pour les médicaments de première intention, le critère de résistance est une croissance excédentaire de 1 % de la population initiale; pour les médicaments de deuxième intention, une croissance de 1 % ou plus de 10 % de la population initiale, selon la concentration critique sélectionnée.

En 1997, le groupe de travail de l'OMS et de l'Union internationale contre la tuberculose sur la détection de la résistance aux médicaments antituberculeux a ajusté ces critères, proposant de considérer comme résistantes les mycobactéries se développant sur le milieu dense aux œufs de Lowenstein-Jensen aux concentrations suivantes:

• dihydrostreptomycine - 4 μg/ml;
• isoniazide - 0,2 µg/ml:
• rifampicine - 40 mcg/ml:
• Éthambutol - 2 mcg/ml.

En 2001, des concentrations critiques ont été proposées pour les médicaments de deuxième intention suivants (pour une proportion critique de 1 %):

• capréomycine - 40 mcg/ml;
• protionamide - 40 mcg/ml;
• kanamycine - 30 μg/ml;
• viomycine - 30 μg/ml;
• cyclosérine - 40 mcg/ml;
• acide aminosalicylique - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacine - 2 mcg/ml.

Les résultats de croissance sont évalués après 4 semaines comme préliminaires et après 6 semaines de culture comme définitifs.

Pour déterminer la sensibilité au pyrazinamide, largement utilisé dans la chimiothérapie antituberculeuse moderne, la concentration critique recommandée est de 200 μg/ml. Cependant, il n'existe pas encore de méthode généralement acceptée pour déterminer la résistance à ce médicament sur des milieux nutritifs solides, car son activité antibactérienne ne se manifeste qu'en milieu acide (pH < 6), techniquement difficile à maintenir. De plus, de nombreuses cultures cliniques de Mycobacterium tuberculosis sont réticentes à se développer sur des milieux à base d'œufs en milieu acide.

Afin d'évaluer la qualité des résultats de la détermination de la sensibilité des mycobactéries aux médicaments, il est recommandé de contrôler chaque nouveau lot de milieu de Lowenstein-Jensen en déterminant parallèlement la sensibilité de la souche standard de musée H37Rv. De plus, certains critères microbiologiques doivent être respectés pour que les méthodes donnent un résultat reproductible et correctement interprété. Ces critères incluent la viabilité de la culture de mycobactéries tuberculeuses, les règles d'obtention d'une suspension homogène, les règles de sélection des cultures de mycobactéries tuberculeuses et la représentativité de la masse bactérienne sélectionnée. La fiabilité de la détermination de la résistance aux médicaments diminue en cas d'excrétion bactérienne extrêmement faible.

Récemment, la méthode de détermination de la sensibilité aux médicaments à l'aide de systèmes automatisés s'est révélée prometteuse. Les développements les plus avancés dans ce domaine sont ceux basés sur le VASTEC MGIT-960. Dans ce cas, la sensibilité aux médicaments des mycobactéries de la tuberculose est déterminée selon une méthode de proportion modifiée. Lors de la détermination, le taux de croissance des mycobactéries de la tuberculose dans le tube témoin et dans les tubes contenant les médicaments est comparé. Pour déterminer la sensibilité à la streptomycine, à l'isoniazide, à la rifampicine et à l'éthambutol, des additifs d'enrichissement et des antibiotiques inclus dans le kit SIRE sont utilisés. Pour déterminer la sensibilité au pyrazinamide, le kit PZA est utilisé. Au cours de l'essai, les tubes à essai contenant les médicaments sont ensemencés avec une suspension de mycobactéries de la tuberculose, ainsi que les tubes témoins avec une dilution de la suspension au centième pour tous les médicaments, à l'exception du pyrazinamide, où la dilution de la suspension est au dixième. Le critère de stabilité est un indicateur de croissance mycobactérienne de 100 UG lorsque la croissance dans le tube témoin atteint 400 UG (voir « Méthodes de culture pour l'isolement des mycobactéries »). Les résultats sont enregistrés et interprétés automatiquement et sont définis par le programme sélectionné.

Les concentrations finales dans le tube à essai contenant le milieu nutritif liquide sont utilisées comme concentrations critiques. Des concentrations critiques ont actuellement été définies pour les médicaments de première intention et certains médicaments de deuxième intention. Il convient de noter que la détermination de la sensibilité des mycobactéries de la tuberculose à la cyclosérine et à l'acide aminosalicylique est réalisée uniquement sur des milieux nutritifs à base d'œuf.

Un protocole détaillé d'utilisation du système décrit permet de réaliser des tests de sensibilité aux médicaments à la fois sur une culture isolée (avec un milieu nutritif dense) et sur la culture primaire de mycobactéries dans un tube à essai MGIT. Cette dernière option réduit considérablement le temps nécessaire à la réalisation des études de culture, permettant d'obtenir des résultats complets sur la culture de mycobactéries de la tuberculose (y compris des informations sur la sensibilité aux médicaments) dans les trois semaines suivant le prélèvement, alors que la méthode traditionnelle ne permet de les obtenir qu'au bout de trois mois. Des résultats rapides, lorsque le patient est en phase intensive de traitement, peuvent compenser le coût relativement élevé des études.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Différenciation des mycobactéries

Étant donné que les milieux nutritifs utilisés ne sont pas strictement sélectifs, la différenciation ultérieure des mycobactéries isolées est considérée comme obligatoire. La nécessité de différencier les mycobactéries est due à plusieurs caractéristiques des processus pathologiques induits par les représentants du genre: évolution et issue différentes de la tuberculose et des mycobactérioses, présence d'une résistance naturelle à certains médicaments antituberculeux.

Il est reconnu que l'identification primaire des mycobactéries du complexe M. tuberculosis à partir des mycobactéries non tuberculeuses est réalisée selon les caractéristiques suivantes: taux de croissance sur milieux nutritifs denses, formation de pigments, morphologie des colonies, présence de résistance aux acides et température optimale pour la croissance.

Malheureusement, il n'existe pas de méthode de laboratoire unique permettant de distinguer de manière fiable les mycobactéries du complexe M. tuberculosis des autres mycobactéries acido-résistantes; cependant, une combinaison des signes décrits ci-dessus avec les résultats d'un certain nombre de tests biochimiques donnés ci-dessous permet d'identifier les mycobactéries du complexe M. tuberculosis avec une probabilité allant jusqu'à 95 %.

Pour différencier les mycobactéries du complexe M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii et autres) des mycobactéries non tuberculeuses à croissance lente, des tests biochimiques de base sont utilisés pour détecter la présence des signes suivants:

• capacité à produire de l'acide nicotinique (test à la niacine):
• activité nitrate réductase;
• catalase thermostable;
• croissance sur un milieu avec salicylate de sodium (1 mg/ml).

En guise de test supplémentaire, des tests de croissance sur un milieu contenant 500 μg/ml d'acide para-nitrobenzoïque ou 5 % de chlorure de sodium peuvent également être utilisés.

De nombreux laboratoires de bactériologie identifient ces micro-organismes uniquement au niveau complexe, ce qui est dû aux capacités limitées des laboratoires et aux capacités méthodologiques des spécialistes.

Dans la plupart des cas, les tests suivants suffisent à différencier M. tuberculosis de M. bovis: niacine, nitrate réductase, pyrazinamidase et enregistrement de la croissance sur un milieu contenant 2 µg/ml d’hydrazide d’acide thiophène-2-carboxylique. Il est à noter que les mycobactéries du complexe M. tuberculosis sont caractérisées par les caractéristiques suivantes:

• croissance lente (plus de 3 semaines);
• température de croissance entre 35 et 37 ^° C;
• absence de pigmentation (couleur ivoire);
• coloration acido-résistante prononcée;
• test de niacine positif;
• test positif à la nitrate réductase;
• absence de catalase thermostable (68 ^o C).
• absence de croissance sur milieu Lowenstein-Jensen contenant:
  • 1000 µg/ml d'acide salicylique de sodium,
  • 500 mcg/ml d'acide para-nitrobenzoïque,
  • 5% de chlorure de sodium:
• croissance en présence de 1 à 5 μg/ml d'acide thiophène-2-carboxylique.

La pertinence de la différenciation des mycobactéries isolées augmentera considérablement avec l'augmentation de la fréquence d'enregistrement des cas de VIH/SIDA associés à la tuberculose ou à la mycobactériose. À l'heure actuelle, il n'existe aucune certitude absolue quant à la capacité des laboratoires régionaux à réaliser correctement ce volume de travail.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Diagnostic immunologique de la tuberculose

Plusieurs phénomènes, préparations et tests immunologiques universels ont été initialement découverts spécifiquement dans le cadre de la tuberculose ou dans le modèle de réponse immunitaire aux mycobactéries. Parmi ceux-ci figurent le BCG et la tuberculine, un phénomène tel que les tests cutanés de sensibilité (tests tuberculiniques – réactions de Pirquet et de Mantoux) et la réaction à l'administration sous-cutanée de tuberculine à des animaux sensibilisés (phénomène de Koch). Certains des premiers anticorps utilisés dans les maladies infectieuses ont également été découverts dans le cadre de la tuberculose. Bien entendu, plus la compréhension des mécanismes de l'immunité antituberculeuse et de leur contrôle génétique sera approfondie, plus l'utilisation des méthodes et préparations immunologiques agissant sur l'immunité pourra être étendue pour résoudre les problèmes pratiques de la phtisiologie.

Le problème pratique le plus important et le plus complexe à l'heure actuelle est considéré comme le dépistage de la tuberculose dans le cadre du dépistage de masse. Cependant, malgré de nombreux rapports de « succès » (sur un matériel limité), il n'existe aucune méthode immunologique (reproductible par n'importe quelle main) ni aucun médicament adapté à ces objectifs.

Les méthodes immunologiques, en particulier les études sérologiques (détermination des antigènes, des anticorps) et les tests de provocation à la tuberculine, sont largement utilisées en pratique clinique.

Les méthodes sérologiques, qui déterminent les antigènes et les anticorps dans différents environnements du corps, occupent la première place parmi les études immunologiques utilisées dans le diagnostic différentiel.

La spécificité de la détermination des anticorps dirigés contre Mycobacterium tuberculosis dépend des antigènes utilisés dans l'analyse immunitaire. Un nombre significatif d'antigènes ont été proposés, le premier étant la tuberculine PPD:

• PPD et autres préparations complexes à partir de liquide de culture;
• désintégrateur à ultrasons;
• Extrait de Triton et autres préparations complexes de parois cellulaires;
• 5-antigène (Daniel);
• 60-antigène (Coccito);
• lipoarabinomannane;
• facteur de cordon (tréhalose-6,6-di-mycolate);
• glycolipides phénoliques et autres;
• lipopolysaccharides;
• antigène de liaison à la fibronectine;
• protéines (le plus souvent recombinantes); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, etc.

Grâce à de nombreuses années de recherche menées par des scientifiques russes et étrangers, les principaux schémas de formation d'anticorps et l'efficacité du diagnostic sérologique de la tuberculose ont été identifiés: plus l'antigène est complexe, plus la sensibilité est élevée et plus la spécificité des tests est faible. La spécificité varie selon les pays en fonction de l'infection de la population par M. tuberculosis et des mycobactéries non tuberculeuses, de la vaccination par le BCG, etc. Chez l'enfant, le contenu informatif du sérodiagnostic est plus faible que chez l'adulte. En cas de tuberculose primaire (plus souvent chez l'enfant), la détermination des IgM est plus informative; en cas de tuberculose secondaire, elle est plus informative, celle des IgG. Chez les personnes infectées par le VIH, le contenu informatif du sérodiagnostic pour la détermination des anticorps est réduit. L'efficacité du dosage des anticorps dépend de plusieurs facteurs cliniques: l'activité du processus (présence ou non d'« isolement » de mycobactéries, présence de cavités de décomposition, degré d'infiltration), la prévalence du processus et sa durée.

La sensibilité de la méthode d'immuno-analyse enzymatique (EIA) est d'environ 70 %. L'efficacité insuffisante de l'étude est due à sa faible spécificité. Auparavant, la possibilité d'utiliser le dépistage sérologique dans les groupes à haut risque était envisagée, notamment chez les personnes présentant des altérations pulmonaires post-tuberculeuses.

Pour accroître la spécificité de l'ELISA, des antigènes plus spécifiques sont recherchés, notamment ceux obtenus par génie génétique: ESAT-6, etc. (voir ci-dessus). L'utilisation d'antigènes strictement spécifiques (38 kDa, ESAT) augmente la spécificité, mais réduit considérablement la sensibilité de l'analyse. Outre l'ELISA (systèmes de test expérimentaux de laboratoire, tels que le kit Pathozyme ELISA), des kits immunochromatographiques avec filtration latérale (Mycodot) sont également proposés, ainsi que d'autres tests similaires (analyse par points membranaires) avec évaluation visuelle du résultat. L'analyse dure de 10 à 30 minutes; ils ne nécessitent pas d'équipement spécifique, mais une évaluation visuelle des résultats, associée à une certaine subjectivité. Ces méthodes présentent approximativement les mêmes caractéristiques de sensibilité et de spécificité (70 % et 90-93 %, respectivement) que l'ELISA traditionnel.

L'utilisation de méthodes d'analyse immunitaire présente un intérêt certain en tant que méthode complémentaire au diagnostic différentiel de la tuberculose, notamment pour ses formes extrapulmonaires. La méthode ELISA est particulièrement efficace pour le diagnostic de la méningite tuberculeuse lors de l'analyse du liquide céphalorachidien. Dans ce cas, la sensibilité de l'analyse est de 80 à 85 % et sa spécificité de 97 à 98 %. Des données existent sur l'efficacité de la détermination des anticorps dirigés contre Mycobacterium tuberculosis dans le liquide lacrymal pour le diagnostic de l'uvéite tuberculeuse.

Induction de la synthèse d'interféron gamma in vitro

L'interféron gamma (IFN-γ) est un facteur de protection immunitaire spécifique, obtenu par l'activation des systèmes enzymatiques des macrophages. L'induction de la synthèse d'IFN-γ par les lymphocytes T sensibilisés est due à leur interaction avec les antigènes mycobactériens.

La tuberculine PPD et des antigènes spécifiques obtenus par génie génétique sont utilisés comme antigènes, notamment l'antigène ESAT-6 (antigène sécrété précocement de 6 kDa) et la protéine CFP-10 (protéine de filtrat de culture de 10 kDa). Les antigènes génétiquement modifiés ou recombinants sont absents des cellules du vaccin BCG et d'autres mycobactéries. Avec la tuberculine, les résultats du test d'induction de l'IFN-γ sont comparables à ceux du test cutané à la tuberculine (corrélation directe). Avec des antigènes génétiquement modifiés, les résultats du test sont plus spécifiques et ne dépendent pas d'une vaccination antérieure par le BCG. Chez les personnes vaccinées n'ayant pas été en contact avec une infection tuberculeuse, la spécificité du test est de 99 %. La sensibilité du test chez les patients tuberculeux varie de 81 à 89 %.

Des tests et des diagnostics ont été développés à partir de la culture à court terme de cellules sanguines totales ou de cellules mononucléaires isolées du sang contenant des antigènes de mycobactéries de la tuberculose in vitro, suivie de la détermination de la concentration d'IFN-γ ou du comptage du nombre de lymphocytes T synthétisant l'IFN-γ. La concentration d'interféron synthétisée dans un tube à essai est déterminée par ELISA à l'aide d'anticorps monoclonaux liant l'IFN-γ. Ensuite, grâce à l'étalonnage de l'IFN-γ standard, sa concentration dans le tube à essai ou les puits de la plaque est déterminée.

Dans le test Elispot, le nombre de cellules T synthétisant l'IFN-γ est compté sur la surface d'une boîte recouverte d'anticorps anti-IFN-γ.

Les développeurs du test in vitro d'induction de l'IFN-γ, approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) américaine, affirment que ce test ne permet pas de différencier une infection tuberculeuse latente d'une tuberculose active. Par conséquent, dans les régions où le taux d'infection est élevé, ce test n'a aucune valeur diagnostique directe. Cependant, dans notre pays, il peut être utilisé pour différencier une infection tuberculeuse chez l'enfant d'une allergie post-vaccinale, ainsi que pour évaluer le niveau d'immunité spécifique pendant le traitement.

Actuellement, un système de test national permettant de déterminer l’induction de la synthèse d’IFN-γ par des antigènes spécifiques de la tuberculose in vitro est à l’étude.

Statut immunitaire et évolution de la tuberculose, immunocorrection

Au cours du traitement de la tuberculose, des modifications de l'antigénémie et de l'état du système immunitaire se produisent chez les personnes.

Les données concernant les modifications des exsudats et des tissus sont largement contradictoires. La seule constatation pleinement justifiée est que les granulomes tuberculeux contiennent généralement un nombre important de lymphocytes T activés.

Il est judicieux de s’attarder sur deux autres points nécessaires à la compréhension du rôle des mécanismes immunologiques dans le traitement de la tuberculose chez l’homme:

• Les patients atteints du SIDA présentent une incidence particulièrement élevée de développer une résistance multiple aux médicaments;
• En cas de résistance multiple aux médicaments (et en l’absence d’infection par le VIH), les troubles immunitaires (principalement l’immunité des lymphocytes T) sont particulièrement importants.

Dans la tuberculose, diverses méthodes d'immunocorrection sont largement utilisées: tout d'abord, il s'agit de médicaments qui agissent principalement sur l'immunité des cellules T et le système phagocytaire mononucléaire (hormones thymiques, isophone, licopide, polyoxidonium, etc.), ainsi que sur les mycobactéries entières (atténuées) et leurs composants.

Diagnostic biologique moléculaire de la tuberculose

Les méthodes de biologie moléculaire utilisées dans le diagnostic des maladies infectieuses reposent principalement sur la manipulation du matériel génomique d'agents pathogènes bactériens et viraux afin d'identifier du matériel génétique spécifique (des fragments d'ADN possédant une séquence nucléotidique spécifique à une espèce ou une souche donnée d'agent pathogène), d'analyser des séquences d'ADN spécifiques dans les gènes déterminant la sensibilité de l'agent pathogène à certains médicaments, ainsi que d'analyser l'activité fonctionnelle de certains gènes de l'agent pathogène. Les méthodes de biologie moléculaire se sont généralisées dans la recherche scientifique et leurs applications pratiques dans le diagnostic et la surveillance de diverses infections bactériennes et virales après la découverte de la réaction en chaîne par polymérase en 1985 par Carrie Mullis (prix Nobel 1989).

Principes et capacités de la méthode de réaction en chaîne par polymérase

La PCR permet l'amplification (multiplication) d'une séquence nucléotidique (un fragment d'ADN pathogène) dans un tube à essai, en quelques heures, des millions de fois. La réalisation de la réaction en présence de chaînes d'ADN individuelles assure la sensibilité exceptionnelle de l'analyse.

La séquence nucléotidique de certaines sections de la chaîne d'ADN détermine l'unicité génétique du micro-organisme, ce qui explique la grande spécificité de la PCR.

L'importance de cette méthode pour la détection et l'étude des caractéristiques de Mycobacterium tuberculosis est due aux caractéristiques biologiques du micro-organisme, qui a une croissance très lente: le temps de doublement de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis lors de leur culture est de 12 à 24 heures.

Le principe de la méthode PCR est l'amplification - multiplication multiple, des millions de fois, de sections d'une séquence d'ADN spécifique dans un microvolume de tube à essai avec répétition cyclique des trois étapes de réaction suivantes, chacune d'elles se déroulant dans un régime de température différent:

• Stade I - dénaturation de l'ADN double brin lors du chauffage avec divergence de ses chaînes;
• Stade II - liaison complémentaire (hybridation) des amorces (oligonucléotides d'amorçage) avec les sections terminales des chaînes d'un fragment d'ADN strictement spécifique sélectionné pour l'amplification;
• Étape III – achèvement de la chaîne de fragments d’ADN à l’aide d’une ADN polymérase thermostable.

Pour l'amplification, le tube à essai doit contenir des molécules d'ADN matriciel. Quatre types de désoxynucléosides triphosphates (nucléotides) contenant les bases azotées correspondantes: adénine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C); des oligonucléotides d'amorçage synthétisés artificiellement (amorces) constitués de 18 à 20 paires de bases; une enzyme thermostable, l'ADN polymérase, dont la température optimale est de 68 à 72 ^° C, et des ions magnésium.

La spécificité de la PCR dépend du choix du fragment d'ADN. Conformément à ce choix, des oligonucléotides amorces flanquantes sont synthétisés. La spécificité de l'hybridation et de la complétion de la chaîne d'ADN est déterminée par le principe de complémentarité des paires de bases azotées suivantes: adénine-thymine, guanine-cytosine.

Pour déterminer le génome des mycobactéries du complexe tuberculeux, la cible d'amplification la plus efficace dans la plupart des systèmes de test est le fragment d'ADN IS6110. Chez la plupart des souches de mycobactéries tuberculeuses, ce fragment présente un nombre significatif (10-20) de répétitions, ce qui garantit, outre la spécificité, une sensibilité élevée de l'analyse. Parallèlement, des souches de mycobactéries tuberculeuses présentant un faible nombre de répétitions ou l'absence du fragment IS6110 ont été décrites.

Extraction de molécules d'ADN à partir d'un échantillon biologique

Pour réaliser la PCR, les molécules d'ADN du pathogène doivent être isolées du matériel biologique dans un volume minimal, avec une quantité minimale d'ADN non spécifique et divers inhibiteurs de l'enzyme - l'ADN polymérase.

La préparation des échantillons doit être effectuée dans des conditions empêchant toute contamination croisée des échantillons étudiés par des molécules d'ADN isolées. Cela nécessite un traitement préalable de la pièce à la lumière ultraviolette, ainsi que du sol et des surfaces de travail des tables et des appareils avec des solutions chlorées. Il est également nécessaire d'utiliser des gants propres, des tubes à essai jetables et des embouts pour pipettes automatiques.

Pour isoler l'ADN de Mycobacterium tuberculosis à partir d'échantillons cliniques (liquide céphalo-rachidien, lavage bronchique) qui ne contiennent pas un grand nombre de leucocytes, de débris cellulaires ou de sels, il suffit de centrifuger l'échantillon à 3-4 mille tours par minute, d'ajouter 20-30 µl d'une solution à 2% de Triton X-100 au sédiment et de chauffer à 90 ^o C pendant 30 minutes.

La préparation des échantillons d'expectorations nécessite une liquéfaction efficace, généralement à l'aide d'hydroxyde de sodium à 4 % et de N-acétyl-L-cystéine (NALC) à raison de 50 à 80 mg par échantillon, selon la viscosité de l'échantillon. La solution de NALC doit être préparée ex tempore, ou la poudre de NALC peut être ajoutée sèche directement à l'échantillon. Après liquéfaction, les échantillons doivent être centrifugés pendant 15 minutes à 3 500-4 000 tr/min (3 000 g) dans des tubes à bouchon à vis de 50 ml, c'est-à-dire dans les mêmes conditions que celles recommandées pour la préparation des expectorations avant culture.

Pour extraire l'ADN des sédiments, on utilise généralement une méthode basée sur l'utilisation d'une solution 5-6 molaire d'isothiocyanate de guanidine comme réactif de lyse et de particules microporeuses d'oxyde de silicium (« terre de diatomées ») qui adsorbent les molécules d'ADN. Les substances non spécifiques, y compris d'éventuels inhibiteurs, sont ensuite lavées dans une solution 2,5 molaire d'isothiocyanate de guanidine et une solution d'éthanol, après quoi les molécules d'ADN sont désorbées dans l'eau, et ces échantillons sont utilisés pour réaliser la PCR. Afin de simplifier la technologie d'extraction de l'ADN, la « terre de diatomées » est souvent remplacée par des microparticules magnétiques recouvertes d'oxyde de silicium. Dans ce cas, un support magnétique spécial pour microtubes est utilisé pour précipiter les particules au lieu de les centrifuger.

Une méthode originale de séparation immunomagnétique des mycobactéries, suivie d'une extraction de l'ADN du pathogène, a été développée en Russie. Pour la séparation immunomagnétique des mycobactéries de la tuberculose, on utilise des ferroparticules de 3 à 5 μm, recouvertes d'oxyde de silicium, auxquelles sont fixés des anticorps polyclonaux (de lapin) dirigés contre les mycobactéries de la tuberculose par liaison chimique. Après lyse alcaline, les échantillons d'expectorations sont neutralisés par une solution acide de Tris-HCl et incubés avec un sorbant immunomagnétique. Les immunoferroparticules sont ensuite collectées à l'aide d'une tige magnétique à embout remplaçable, transférées dans un microtube et précipitées. 20 à 30 μl d'une solution de Triton X-100 à 2 % sont ajoutés et chauffés pendant 30 minutes à 90 ^° C. Le surnageant est utilisé comme matrice d'ADN pour l'analyse par PCR.

L'extraction de l'ADN de la bactérie tuberculosis à partir de biopsies pose un problème complexe. Pour la lyse biopsique, l'enzyme protéinase K est utilisée à une concentration finale de 200 à 500 mg/l à une température de 56 ^° C pendant la nuit. L'extraction est ensuite réalisée selon l'une des méthodes connues. Un excès d'ADN non spécifique lors de l'analyse PCR des biopsies inhibe souvent la réaction, ce qui nécessite des extractions répétées.

Méthodes de détection des résultats

Une fois la réaction terminée, les fragments amplifiés d’ADN pathogène sont identifiés à l’aide de diverses méthodes.

La méthode d'électrophorèse sur gel est bien connue. Dans ce cas, le fragment d'ADN obtenu est identifié par un témoin positif contenant le fragment d'ADN spécifique souhaité, ou par une taille connue (nombre de paires de nucléotides) du fragment, déterminée à l'aide d'un marqueur moléculaire standard.

En présence d'un colorant spécifique - le bromure d'éthidium, qui est inclus dans l'ADN double brin, le fragment d'ADN synthétisé se révèle comme une bande qui brille sous l'influence de la lumière ultraviolette.

La taille du fragment d'ADN, déterminée par électrophorèse en fonction de la distance parcourue depuis le départ, doit correspondre à un marqueur de poids moléculaire connu ou à un contrôle positif.

D'autres méthodes de détermination des résultats de la PCR sont basées sur l'hybridation de produits de PCR monocaténaires avec un oligonucléotide complémentaire - une sonde d'ADN marquée à la biotine, suivie d'une détection à l'aide d'une réaction enzymatique en liant, par exemple, un conjugué streptavidine-phosphatase alcaline à la biotine.

Sur la base de ce type de détection, des analyseurs PCR ont été créés dans lesquels la détection des résultats PCR est effectuée automatiquement à la suite de la lecture de la densité optique dans les échantillons après la réaction enzymatique.

Les inconvénients de ces méthodes incluent le risque de contamination intralaboratoire par des fragments relativement courts de molécules d'ADN. Lorsque ces molécules pénètrent dans des échantillons fraîchement testés, elles deviennent une matrice pour la PCR et conduisent à des résultats faussement positifs.

À cet égard, afin d'éviter les faux positifs, des règles strictes ont été mises en place pour séparer et isoler les salles: celles destinées à l'extraction d'ADN des échantillons biologiques; celles destinées à la détection des résultats (électrophorèse) de la zone propre. Ces salles représentent une zone de contamination probable. Une autre zone isolée est la salle propre destinée à l'introduction des échantillons d'ADN à étudier dans des tubes à essai contenant le mélange réactionnel pour la PCR. Enfin, il est supposé que l'appareil principal, l'amplificateur d'ADN, doit être transporté dans une pièce séparée, éventuellement un bureau.

Pour éviter la contamination par les produits des réactions précédentes (amplicons), certains systèmes de test PCR contiennent de l'uridine désoxynucléoside au lieu de la thymidine désoxynucléoside, qui est construite à la position correspondante lors de la synthèse de chaîne in vitro, c'est-à-dire que la base azotée thymine présente dans l'ADN natif est remplacée par l'uracile. L'uracile ADN glycosylase ajoutée au mélange réactionnel du matériel analysé détruit uniquement les fragments contaminants par la désoxyuridine, mais pas l'ADN natif analysé contenant de la désoxythymidine. Un chauffage ultérieur à 94 ^° C inactive cette enzyme et n'interfère pas avec l'amplification en PCR.

Il existe un système de test basé sur l'amplification isotherme de l'ARNr, pour lequel la transcription inverse et la synthèse des molécules d'ADN sont d'abord réalisées. Ces molécules constituent à leur tour la matrice de la synthèse ultérieure des molécules d'ARN. Les amplicons d'ARN sont détectés à l'aide d'une sonde d'ADN colorée à l'acridine lors de l'hybridation dans une solution en tube à réaction. Cette méthode, outre sa grande sensibilité, présente l'avantage de réaliser l'analyse dans un seul tube, ce qui évite toute contamination. Selon les auteurs, la sensibilité de cette méthode dans les échantillons respiratoires atteint 90 % avec une spécificité de 99 à 100 %.

De nouvelles méthodes de détection sont mises en œuvre dans la PCR en temps réel. Ces méthodes se distinguent principalement par le fait que la PCR et la détection de ses résultats sont réalisées simultanément dans un tube à essai fermé. Cela simplifie non seulement la méthode d'analyse, mais évite également la contamination des locaux et des échantillons du laboratoire par les produits des PCR précédentes.

En PCR en temps réel, les résultats sont détectés par la fluorescence résultant de l'hybridation d'une sonde d'ADN fluorogène avec un fragment d'ADN spécifique amplifié lors de la PCR. La structure des sondes d'ADN fluorogènes est telle que le marqueur fluorescent est libéré par une réaction enzymatique ou se détache de la molécule extinctrice de fluorescence uniquement lors d'une hybridation spécifique avec la molécule d'ADN souhaitée amplifiée lors de la PCR. À mesure que le nombre de molécules hybridées avec la sonde augmente, l'augmentation de la fluorescence jusqu'à un niveau détectable est proportionnelle au nombre de molécules du produit amplifié. Comme le nombre de molécules de fragments d'ADN double à chaque cycle de PCR, le nombre de cycles à partir duquel la fluorescence est détectée et augmente est inversement proportionnel au nombre de molécules d'ADN présentes dans l'échantillon initial. Si plusieurs concentrations connues de molécules du fragment correspondant d'ADN de la bactérie tuberculosis sont introduites dans la réaction comme étalon, le nombre de génomes d'ADN dans le matériel étudié peut être calculé à l'aide d'un programme informatique.

Chaque échantillon standard est dupliqué. Le critère quantitatif est le nombre minimal de cycles de PCR requis pour l'apparition et la croissance d'une fluorescence détectable. L'axe des abscisses représente le nombre de cycles; l'axe des ordonnées représente la valeur de fluorescence. Les concentrations d'ADN sont inversement proportionnelles au nombre de cycles nécessaires à l'apparition de la fluorescence. Les fenêtres de la colonne de droite (21-32) indiquent les numéros de cycles pour les concentrations correspondantes. Les différences entre les concentrations décuplées de fragments d'ADN 10 ² -10 ⁶ ml sont de 3,2 à 3,4 cycles. Pour deux patients, les concentrations de fragments IS6110 étaient d'environ 10 ³ /ml et 10 ⁴ /ml. Compte tenu du nombre de répétitions (6-20) des fragments analysés dans le génome de Mycobacterium tuberculosis, le nombre de Mycobacterium tuberculosis dans les échantillons cliniques est d'environ 100 et 1 000 cellules, respectivement.

Application de la PCR au diagnostic de la tuberculose

La méthode PCR est largement utilisée pour le diagnostic rapide de la tuberculose, c'est-à-dire la détection de Mycobacterium tuberculosis dans les échantillons cliniques: crachats, lavages bronchiques, exsudat pleural, urine, liquide céphalorachidien, ponctions d'ostéolyse, aspirations de l'appareil génital féminin et diverses biopsies. Une étude menée aux Pays-Bas, portant sur environ 500 échantillons d'expectorations et de lavages bronchiques provenant de 340 patients chez qui un diagnostic de tuberculose pulmonaire a été confirmé, a comparé la sensibilité des méthodes PCR, de culture et d'examen microscopique des frottis. La sensibilité de l'analyse était respectivement de 92,6 %, 88,9 % et 52,4 %. La spécificité de toutes les méthodes était d'environ 99 %.

Une comparaison a été effectuée sur l'efficacité de la détection de Mycobacterium tuberculosis par microscopie de frottis, ensemencement sur milieu de Lowenstein-Jensen, test VASTES et analyse PCR. La PCR a montré une sensibilité de 74,4 %, la microscopie de 33,8 %, l'ensemencement sur milieu solide de 48,9 % et le test VASTES de 55,8 %. Le délai moyen de détection pour l'ensemencement sur milieu de Lowenstein-Jensen est de 24 jours. VASTES: 13 jours, PCR: 1 jour.

Le potentiel d’utilisation de la PCR comme méthode sensible et rapide pour surveiller l’efficacité du traitement de la tuberculose est également discuté.

La détection de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis par la méthode PCR avec une chimiothérapie efficace est déterminée sur une période de temps plus longue - en moyenne 1,7 mois par rapport à l'excrétion bactérienne déterminée par microscopie à fluorescence et 2,5 mois par rapport à l'examen bactériologique.

Diagnostic des formes extrapulmonaires de tuberculose

L'importance de la PCR en tant que méthode sensible est particulièrement grande pour les formes extrapulmonaires, car c'est précisément dans ces formes que les méthodes cliniques et radiologiques et les méthodes bactériologiques traditionnelles pour déterminer Mycobacterium tuberculosis dans les matériaux de diagnostic sont inefficaces.

Lors de l'examen des échantillons d'urine, les résultats de l'analyse PCR étaient positifs chez 16 des 17 patients atteints de tuberculose active du système urinaire et négatifs chez 4 patients atteints de tuberculose rénale inactive et 39 patients atteints de maladies non tuberculeuses du système urinaire.

L'efficacité de l'analyse par PCR a été démontrée dans l'étude des ponctions de moelle osseuse chez des patients présentant une fièvre d'origine inconnue et une suspicion de tuberculose. Pour le diagnostic de lymphadénite tuberculeuse chez l'enfant, 102 ponctions et biopsies de 67 enfants suspectés de lymphadénite tuberculeuse ont été étudiées. Des résultats positifs ont été obtenus: par PCR en temps réel – 71,6 %, par microscopie à fluorescence – 46,3 %, et par culture – 41,8 %. L'étude de 50 biopsies de ganglions lymphatiques chez des patients atteints de la maladie des griffes du chat a montré que tous les résultats étaient négatifs. Ainsi, une spécificité de 100 % de l'analyse par PCR a été démontrée. Dans le même travail, la possibilité de détecter M. avium a été démontrée par ponction-biopsie de ganglions lymphatiques.

Le diagnostic de tuberculose génitale féminine en cas d'infertilité est reconnu comme l'un des plus difficiles. Des résultats positifs ont été obtenus lors d'études PCR sur des biopsies endométriales, des ponctions endométriales et des échantillons de liquide de Douglas chez 14 (56 %) des 25 patientes examinées par laparoscopie avec suspicion de tuberculose. L'examen microscopique des frottis et les cultures ont donné respectivement un et deux résultats positifs. Ces cas étaient également positifs à la PCR. La plupart des résultats positifs à la PCR concernaient des cas présentant des signes caractéristiques de tuberculose selon l'examen histologique; un nombre plus faible concernait des cas suspects de tuberculose selon la laparoscopie. Un seul résultat positif à la PCR a été obtenu en l'absence de données laparoscopiques pour la tuberculose.

Lors du diagnostic des formes extrapulmonaires de tuberculose, les cliniciens s'interrogent souvent sur la possibilité d'identifier l'agent pathogène lors de l'analyse d'échantillons sanguins par PCR. Les données de la littérature indiquent que la détection de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis à partir d'échantillons sanguins est possible dans les formes avancées d'infection par le VIH. L'ADN de Mycobacterium tuberculosis n'a été détecté que dans des cas de tuberculose généralisée touchant divers organes chez des patients transplantés rénaux et immunodéprimés.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identification des espèces de mycobactéries

La méthode PCR peut s'avérer très efficace pour l'identification rapide des mycobactéries du complexe tuberculeux et de certains types de mycobactéries non tuberculeuses après l'obtention de leur croissance primaire. Dans ce cas, l'utilisation de la PCR permet de gagner 7 à 10 jours pour l'identification ultérieure par culture d'un résultat positif. L'étude PCR est techniquement très simple, car elle ne nécessite pas de préparation complexe d'échantillons cliniques pour atteindre une sensibilité élevée. Lors de l'analyse de 80 cultures positives avec un tel système de test (MB BacT. d'Organon), tous les résultats positifs de l'analyse PCR étaient strictement spécifiques et ont été obtenus en un jour. Pour identifier d'autres types de mycobactéries obtenues en culture, l'ADN du pathogène est hybridé avec des sondes d'ADN spécifiques marquées à l'acridine, et les souches sont détectées par chimioluminescence à l'aide d'un chimiluminomètre ou sur des bandelettes de nitrocellulose avec évaluation visuelle après hybridation. Ce kit identifie un nombre limité d'espèces: complexe Mycobacterium tuberculosis, M. avium, complexe M. avium, M. kansasii et M. gordonae.

A. Telenti et al. ont également développé une méthode relativement simple et peu coûteuse pour l'identification des espèces de mycobactéries cliniquement importantes, basée sur la PCR et le traitement ultérieur par deux enzymes de restriction (enzymes capables de couper une molécule d'ADN à des points spécifiques). Dans ce cas, un fragment d'ADN codant pour une protéine de choc thermique (65 kDa) est amplifié, après quoi le fragment d'ADN obtenu par PCR, d'une taille de 439 paires de nucléotides, est traité séparément par deux enzymes: Bste II et Nae III. Ensuite, par électrophorèse sur gel d'agarose, les deux produits obtenus sont analysés, déterminant leur taille (nombre de paires de nucléotides) à l'aide d'un ensemble de fragments d'ADN standard (marqueurs moléculaires d'ADN) de 100 à 1 000 paires de nucléotides de longueur. Chez chacune des espèces définies (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum), 2 ou 3 fragments d'ADN de tailles différentes sont trouvés pour chaque enzyme de restriction. La combinaison des fragments d’ADN résultants de différentes tailles permet de différencier ces espèces les unes des autres.

Une technologie de microréseaux d’ADN biologique est en cours de développement. Elle permettra d’identifier plus de 100 espèces de mycobactéries en une seule étude.

L'identification des espèces peut également être réalisée par amplification PCR de la région variable de l'ARNr 16S suivie du séquençage des amplicons en comparaison avec la structure primaire correspondante, ce qui permet l'identification de plus de 40 espèces de mycobactéries.

La PCR peut également être utilisée pour identifier les espèces au sein du complexe mycobactérien de la tuberculose, notamment pour différencier M. bovis et M. bovis BCG. Cela se fait en analysant la présence ou l'absence de certains gènes dans les régions génomiques RD1, RD9 et RD10. RD1 est absent chez M. bovis BCG, mais est présent chez les espèces virulentes, dont M. bovis.

Détermination de la sensibilité aux médicaments de Mycobacterium tuberculosis par PCR

Les méthodes de génétique moléculaire pour déterminer la sensibilité ou la résistance de Mycobacterium tuberculosis aux médicaments se limitent à l'identification de mutations dans certaines séquences nucléotidiques de gènes connus. Les principales méthodes reposent soit sur la lecture directe (séquençage) de ces séquences après amplification, soit sur l'hybridation de fragments d'ADN marqués à la biotine et amplifiés par PCR avec des sondes ADN. Ces deux options impliquent l'identification de substitutions dans les séquences nucléotidiques qui, lors de l'utilisation de sondes ADN, conduisent à une absence ou à une hybridation incomplète sur une membrane de nitrocellulose, grâce à un conjugué enzymatique (streptavidine-phosphatase alcaline) – la méthode LIPA-Rif-TB.

La méthode de mesure de la fluorescence dans des sondes d'ADN fixées localement sur des microrégions complémentaires de mutations connues dans des régions géniques amplifiées par PCR responsables de la sensibilité ou de la résistance aux médicaments est appelée méthode des microbiopuces. L'algorithme de base pour mener cette étude est le suivant. Après isolement de l'ADN d'un échantillon clinique ou d'une culture mycobactérienne, une PCR doit être réalisée pour amplifier les fragments correspondants du gène groB responsable de la sensibilité à la rifampicine, ou des gènes katG et inhA codant pour les protéines mycobactériennes responsables de la sensibilité à l'isoniazide. Les résultats de la PCR sont évalués par électrophorèse sur gel d'agarose, qui confirme la réception des fragments d'ADN correspondants de la longueur souhaitée. Ensuite, une deuxième PCR est réalisée pour introduire un marqueur fluorescent dans l'ADN. Les résultats de la PCR sont à nouveau confirmés par électrophorèse sur gel. Ensuite, l'hybridation est réalisée (incubation pendant une nuit), suivie d'un lavage du matériel obtenu sur une biopuce. Ce matériel est constitué d'un grand nombre de courtes chaînes d'ADN (sondes) fixées sur une petite plaque de verre, complémentaires des séquences nucléotidiques de la mycobactérie tuberculeuse sensible aux médicaments, aux points de mutations possibles, ainsi que des séquences mutantes responsables de la résistance aux médicaments. L'emplacement des sondes d'ADN sur la plaque est strictement défini et le niveau de fluorescence observé pendant l'hybridation est déterminé à l'aide d'un dispositif de lecture spécial. Les résultats de l'analyse sont ensuite déterminés à l'aide d'un logiciel informatique dédié.

Ces dernières années, des méthodes alternatives pour déterminer la sensibilité aux médicaments de Mycobacterium tuberculosis ont été développées sur la base de la technologie PCR en temps réel, permettant de réaliser ces études en mode tube à essai fermé.

La figure 13-13 montre le résultat de l'analyse des cultures cliniques de Mycobacterium tuberculosis pour déterminer la résistance aux médicaments contre la rifampicine par PCR en temps réel: 218 - échantillon témoin (sensible à la rifampicine); 93 - témoin positif pour la mutation Ser-Trp TCG-TGG; 4 482 - témoin positif pour la mutation Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - échantillons expérimentaux. Le résultat du calcul des courbes cinétiques d'amplification pour 4 canaux: canal 1: 393 - témoin positif pour la mutation Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4 482 - témoin positif pour la mutation Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - échantillons expérimentaux; canal 4: courbes cinétiques d'amplification de tous les échantillons participant à l'expérience. Témoin positif de la réaction d'amplification. Conclusions: L'analyse a révélé les mutations suivantes qui déterminent la résistance à la rifampicine: dans les échantillons 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Le même principe a été utilisé pour déterminer la résistance aux médicaments à l'isoniazide par les gènes katG et inhA, qui déterminent les mutations les plus fréquentes.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identification de la souche de Mycobacterium tuberculosis

La méthode la plus étudiée pour identifier les souches de Mycobacterium tuberculosis est une technologie appelée polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Elle repose sur la fragmentation (restriction) de l'ADN de Mycobacterium tuberculosis par l'enzyme Pvu II, puis sur l'hybridation des fragments obtenus avec certaines séquences spécifiques de l'ADN de son élément répété IS6110. La variabilité intraspécifique est due au nombre variable de répétitions IS6110 et à leur localisation sur l'ADN, ainsi qu'à la diversité des distances entre certains points d'attaque de l'enzyme de restriction (sites de restriction) et l'élément IS6110. Cette technologie est très complexe et demande beaucoup de travail. Après traitement de l'ADN isolé de la culture de Mycobacterium tuberculosis par l'enzyme de restriction, une électrophorèse sur gel est réalisée, puis des fragments d'ADN de différentes longueurs sont transférés sur une membrane de nitrocellulose, hybridés avec des fragments de l'élément IS6110, et les résultats sont détectés par réaction enzymatique. Le motif de bande spécifique obtenu caractérise l'ADN d'une souche spécifique de Mycobacterium tuberculosis. L'analyse informatique révèle l'identité ou la parenté des souches. Bien que la méthode RFLP soit la plus discriminante, c'est-à-dire qu'elle révèle le plus grand nombre de différences entre les souches analysées, elle est inefficace avec un faible nombre (moins de 5) de répétitions IS6110, observées chez certaines souches. Les figures 13-14 présentent les résultats du typage RFLP des souches.

Une alternative pourrait être la méthode de spoligotypage, qui consiste à analyser le polymorphisme des séquences d'ADN intercalaires, intermédiaires entre les répétitions directes de la région DR. Lors du spoligotypage des souches, la PCR est réalisée avec des amorces limitant la région DR, ce qui produit des fragments de différentes longueurs qui s'hybrident avec des régions d'ADN intermédiaires variables. L'analyse des séquences intercalaires de la région DR semble, selon les chercheurs, plus simple, plus productive et plus adaptée au criblage primaire des souches et aux analyses épidémiologiques préliminaires, ainsi qu'à l'étude directe du matériel clinique.

De toute évidence, une méthode plus efficace et technologiquement accessible est la méthode VNTR (abréviation de l'anglais « VNTR »), qui consiste à déterminer le nombre variable de répétitions en tandem exactes dans l'ADN de Mycobacterium tuberculosis. Cette méthode repose uniquement sur la PCR et ne nécessite aucune manipulation supplémentaire. Le nombre de répétitions en tandem étant différent selon les souches et les loci, des fragments de tailles différentes sont déterminés et analysés sur l'électrophorégramme des produits de PCR obtenu. Selon les chercheurs, la méthode VNTR permet d'obtenir une meilleure discrimination des souches qu'avec la méthode RFLP.

Ces dernières années, une grande attention a été accordée à la propagation des souches de Mycobacterium tuberculosis de la famille W-Beijing (parfois appelée souche Beijing), qui sont largement résistantes aux médicaments.

Exigences de base pour la qualité de la recherche en biologie moléculaire

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Principaux documents réglementaires pour la réalisation d'une PCR

Arrêtés du ministère de la Santé de la Fédération de Russie: n° 45 du 7.02.2000; n° 109 du 21.03.2003; n° 64 du 21.02.2000. Directives: 1.3.1888-04 « Organisation du travail lors de la recherche par PCR de matériel infecté par des agents biologiques pathogènes des groupes de pathogénicité III-IV »; 1.3.1794-03 « Organisation du travail lors de la recherche par PCR de matériel infecté par des micro-organismes des groupes de pathogénicité I-II ». 2003; 3.5.5.1034-01 « Désinfection du matériel d'essai infecté par des bactéries des groupes de pathogénicité I-IV lors de l'utilisation de la méthode PCR », 2001. Annexe 11 aux Instructions sur les méthodes unifiées de recherche microbiologique pour la détection, le diagnostic et le traitement de la tuberculose.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personnel

Les études de biologie moléculaire peuvent être réalisées par des médecins spécialistes du diagnostic clinique de laboratoire, des bactériologistes, des virologues, des biologistes de laboratoire de diagnostic clinique, ainsi que par des spécialistes ayant suivi une formation médicale secondaire et ayant suivi une spécialisation et une formation avancée de la manière établie.

Aménagement des locaux du laboratoire

Les installations de laboratoire suivantes sont requises:

• Zone de traitement des échantillons - un laboratoire adapté pour travailler avec des agents infectieux des groupes de pathogénicité III-IV, conformément aux directives méthodologiques 13.1888-04.
• La zone de préparation des mélanges de réaction PCR est une salle de laboratoire qui offre une protection contre la contamination interne du laboratoire - une zone « propre ».
• • Si l'électrophorèse ou l'hybridation est utilisée pour analyser les produits PCR, la salle de laboratoire dans laquelle les fragments d'ADN amplifiés sont extraits du tube d'amplification et, par conséquent, peuvent pénétrer dans l'environnement, conformément aux exigences des laboratoires de PCR (Directives méthodologiques 1.3.1794-03, Directives méthodologiques 1.3.1888-04), doit être complètement isolée des salles spécifiées dans les paragraphes précédents. Tout mouvement de personnel, d'équipement, de matériel et d'objet de la zone d'électrophorèse vers la zone de traitement des échantillons et la zone « propre », ainsi que tout transfert d'air par le système de ventilation ou par courant d'air, doivent être exclus. Cette zone n'est pas requise pour la détection fluorimétrique des produits PCR.
• La salle de documentation et de traitement des résultats est équipée d'ordinateurs et du matériel de bureautique nécessaire. Elle peut contenir des équipements permettant la détection des produits PCR sans ouverture du tube, tels que des détecteurs PCR fluorescents et des thermocycleurs pour la PCR en temps réel.

Les exigences sanitaires et épidémiologiques pour le traitement primaire des expectorations sont similaires aux exigences microbiologiques standard pour travailler avec Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Ensemble complet d'équipements de laboratoire pour le diagnostic PCR

Le kit de laboratoire comprend l'équipement pour les salles suivantes.

• salle de préparation d'échantillons, contient l'équipement suivant: hotte à flux laminaire de classe de protection II « SP-1.2 »: thermostat à semi-conducteurs avec couvercle chauffant pour tubes à essai Eppendorf; microcentrifugeuse à 13 000 tr/min; centrifugeuse (« Vortex »; réfrigérateur avec une plage de température de -20 ^° C à +10 ^° C; pipettes à volume variable de la série « Proline »; pompe avec un flacon piège OM-1; support de pipettes; support de poste de travail 200 x 0,5 ml; support de poste de travail 50 x 1,5 ml; supports pour le stockage des tubes à essai 80 x 1,5 ml;
• salle de préparation du mélange réactionnel: chambre de protection boîte PCR (« Laminar-C. 110 cm); centrifugeuse « Vortex »; pipettes à volume variable de la série « Proline »; support de pipettes; support de poste de travail 200x0,2 ml; supports pour le stockage des tubes à essai 80x1,5 ml; réfrigérateur avec une plage de température de -20 ^° C à +10 ^° C;
• Salle d'électrophorèse: chambre d'électrophorèse horizontale; source d'alimentation; transilluminateur;
• Amplificateur d'ADN ou analyseur d'acides nucléiques (PCR en temps réel) avec ordinateur et logiciel; peut être installé dans n'importe quelle pièce disponible. Si la technologie PCR en temps réel est utilisée, une salle d'électrophorèse n'est pas nécessaire.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Contrôle de qualité externe

Pour garantir l’obtention de résultats objectivement fiables, les laboratoires doivent participer à un système d’évaluation externe de la qualité de la recherche en laboratoire.

Les participants au système de contrôle de qualité reçoivent: 12 ampoules avec des suspensions lyophilisées de cellules bactériennes, dont deux contiennent E. coli, 3 ampoules avec des mycobactéries de la tuberculose (souche avirulente) à une concentration de 10 ² /ml; 3 ampoules avec des cellules d'une souche similaire à une concentration de 10 ⁴ /ml; 2 ampoules chacune avec des mycobactéries non tuberculeuses M. avium-intracellulare et M. kansasii à une concentration de 10 ⁵ /ml.

Les tests envoyés pour une évaluation externe de la qualité sont pré-testés dans deux laboratoires indépendants possédant une vaste expérience dans ce domaine.

[ 85 ], [ 86 ]