Un flacon, deux cibles: diagnostic portable de la tuberculose basé sur CRISPR avec une sensibilité de 100 %

Un article sur un test portable de dépistage de la tuberculose, réalisable directement à partir des expectorations, sans équipement complexe, a été publié dans Science Advances. L'amplification isotherme de l'ADN et la lecture CRISPR sont combinées dans un seul tube à essai; deux insertions conservatrices de M. tuberculosis (IS6110 et IS1081) sont testées simultanément, ainsi qu'un gène humain comme témoin interne. Lors d'un petit test « en aveugle » sur des échantillons cliniques, le test a donné une sensibilité de 100 % (6/6) et une spécificité de 100 % (7/7) par rapport à la culture; la limite de détection est d'environ 69 à 81 UFC/ml dans les expectorations simulées. Le résultat est visible sur une bandelette de test en papier et les réactifs sont lyophilisés (conservation sans « chaîne du froid »).

Arrière-plan

Selon l'OMS, la tuberculose tuera environ 1,25 million de personnes en 2023; elle est redevenue la principale cause infectieuse de décès, avec environ 10,8 millions de cas. Il est donc crucial de disposer de diagnostics accessibles et rapides, en particulier dans les pays aux ressources limitées.

• Les tests actuels constituent un compromis entre précision, rapidité et prix. La culture dite « de référence » est très précise mais lente; la microscopie est rapide mais peu sensible; les plateformes PCR comme Xpert MTB/RIF Ultra sont nettement plus sensibles (LOD ≈ 15,6 UFC/ml), mais nécessitent un équipement et des cartouches coûteux, ce qui limite leur couverture.
• Pourquoi l'amplification isotherme et CRISPR? L'amplification RPA isotherme fonctionne à 37–42 °C et ne nécessite pas de thermocycleur, ce qui la rend pratique sur le terrain. La lecture CRISPR (Cas12/13) ajoute une spécificité d'espèce et permet un flux latéral visuel (« bande ») sans optique complexe. En résumé, c'est la voie vers des tests PVR portables et économiques.
• Pourquoi utiliser deux cibles MBT simultanément (IS6110 + IS1081)? IS6110 est un insert multicopie du complexe M. tuberculosis, mais certaines lignées en contiennent peu, et les tests pour IS6110 seul peuvent être infructueux. L'ajout d'un second insert IS1081 réduit le risque de faux négatifs.
• Pourquoi un contrôle humain interne? Les échantillons d'haleine peuvent contenir des inhibiteurs et des échantillons « mauvais ». Un contrôle humain endogène (par exemple, ARNase P/ADN génomique) confirme que le matériel est adéquat et que la réaction n'est pas inhibée; sinon, le résultat ne peut être considéré comme négatif.
• Le format « one-pot » est important en soi. Il réduit les étapes, diminue le risque de contamination et facilite le travail en dehors du laboratoire. De telles approches pour la tuberculose ont déjà démontré leur viabilité; les nouveaux travaux étendent l'idée à un format à double cible avec contrôles internes, et démontrent la lyophilisation des réactifs et un lecteur de bandelettes.
• Quelle est la valeur de cet article? Les auteurs ont démontré une détection directe à partir des expectorations après une préparation d'échantillon simplifiée, une limite de détection d'environ 70 à 80 UFC/ml dans des expectorations simulées et une sensibilité/spécificité de 100 % sur un petit échantillon clinique en aveugle – une bonne « démonstration technique » pour de futures validations multicentriques.

Comment cela marche-t-il

• Les scientifiques ont combiné l'amplification isotherme rapide du matériel génétique à 37 °C (RPA) avec les enzymes de « coupe » Cas13a/Cas12a. Après avoir sélectionné les ARN guides, ils ont configuré le système pour cibler deux cibles MBT simultanément, et parallèlement à l'ADN humain (en vérifiant la présence de matériel dans l'échantillon et l'absence de blocage de la réaction).
• Toute la chimie se déroule dans un seul tube à essai; après incubation, le résultat est lu soit avec un fluorimètre, soit sur une bandelette à flux latéral - essentiellement comme un test express.
• Le traitement des expectorations a été simplifié par un chauffage et une brève centrifugation, sans extracteurs d'acides nucléiques. Pour les conditions les plus difficiles, les auteurs envisagent même des alternatives manuelles à la centrifugeuse.

Ce que les tests ont montré

• Limite de détection: 69,0 UFC/ml (souche H37Rv) et 80,5 UFC/ml (BCG) dans les expectorations « spike ». Aucune réactivité croisée avec d’autres bactéries/champignons n’a été détectée.
• Contexte clinique (échantillons en aveugle): sur 13 échantillons de pratique réelle, sensibilité de 100 % (6/6) et spécificité de 100 % (7/7) par rapport à l'ensemencement. À titre de comparaison, sur le même kit, GeneXpert Ultra a montré des valeurs respectives de 100 % et 86 %.
• Nuances techniques: des deux options de lecture, Cas13a a été le plus performant (pour le format « one-pot », il est plus sensible que Cas12a). De plus, le test parallèle de deux cibles Mtb réduit le risque de résultats erronés.

Pourquoi est-ce nécessaire?

Les tests actuels représentent un compromis entre précision, rapidité et disponibilité: la culture est très précise, mais lente; les écouvillons sont rapides, mais imprécis; les systèmes PCR comme GeneXpert sont précis et rapides, mais nécessitent des instruments et des cartouches coûteux. La nouvelle approche CRISPR vise à combler cette lacune: des diagnostics de terrain fonctionnant à 37 °C, avec des lectures sur bandelettes de papier et la possibilité de stocker les réactifs sans réfrigération.

Limites et prochaines étapes

Il s'agit d'une première démonstration sur un petit échantillon clinique; des tests multicentriques à grande échelle sont nécessaires (notamment pour la co-infection par le VIH, chez l'enfant, avec des formes paucibacillaires et différentes lignées de MBT). Les auteurs soulignent que, dans la version « terrain », la centrifugeuse de paillasse devra être remplacée par une solution entièrement manuelle. Cependant, l'architecture elle-même – « deux cibles + contrôle interne » dans un seul tube à essai – a déjà prouvé son opérabilité et ouvre la voie à des améliorations pour une utilisation à grande échelle.

Source: Alexandra G. Bell et al. Un test simplifié basé sur CRISPR pour la détection de la tuberculose directement à partir des expectorations, Science Advances, en ligne, le 6 août 2025 (vol. 11, numéro 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206