Travaux expérimentaux sur la transplantation de kératinocytes allogènes sur des cicatrices artificielles de rats blancs

Le désir d’utiliser le potentiel cellulaire et la nécessité de trouver de nouvelles méthodes efficaces pour améliorer l’aspect esthétique des cicatrices ont conduit à l’idée d’essayer d’étudier la possibilité de transplanter des kératinocytes sur les surfaces cicatricielles.

Afin de démontrer la faisabilité de la culture de kératinocytes pour améliorer l'apparence des cicatrices, une étude expérimentale a été menée sur des rats de laboratoire blancs, sur lesquels des surfaces cicatricielles ont été créées. Le modèle de cicatrice a été obtenu suite à la cicatrisation de plaies artificielles sur le dos, le long de la colonne vertébrale. Des morceaux de peau identiques, de 2 x 3 cm, ont été découpés sur les rats. Deux mois et demi après l'opération de « modelage de cicatrice », les rats ont subi une dermabrasion (ablation des couches supérieures de la cicatrice par thermocaustique) et des kératinocytes allogéniques, isolés de la peau de ratons 2 à 4 jours après leur naissance, ont été transplantés.

L'isolement et la culture des cellules épidermiques de rat ont été réalisés dans le laboratoire de technologies cellulaires de l'Institut de cytologie de l'Académie des sciences de Russie en utilisant la technologie suivante.

Français La peau a été lavée dans une solution saline de Hank contenant 200 U/ml de gentamicine et découpée en petits morceaux de 0,2 à 0,5 cm² ^. Les morceaux de peau ont été incubés dans une solution de dispase à 0,5 % dans une solution tamponnée au phosphate salin équilibré à 37 °C pendant 1 heure. Les morceaux ont ensuite été transférés dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco et l'épiderme a été séparé du derme. L'épiderme a été incubé dans une solution de trypsine à 0,125 % pendant 10 à 15 minutes sous agitation à 50 tr/min, après quoi l'action enzymatique a été stoppée par l'ajout de 5 % de sérum bovin fœtal. Un tiers de la suspension cellulaire obtenue a été utilisé sous forme pure pour l'une des options de transplantation sur cicatrices, le deuxième tiers a été cultivé sur des films de revêtement biocompatibles domestiques « Polypor », et le troisième sur des boîtes de Petri sans substrat. L'opération de dermabrasion des cicatrices résultantes chez les rats avec transplantation ultérieure de cellules épidermiques de rat sur celles-ci a été réalisée sous anesthésie à l'éther à l'aide d'un cautère thermique.

Chez le premier groupe de rats, après dermabrasion, des morceaux de batiste stériles ont été déposés sur la surface polie, lavée au sérum physiologique et séchée de la cicatrice. Une suspension agitée d'épidermocytes allogéniques de rat a été appliquée à une concentration de 1,5 million de cellules par ml (selon l'Institut de cytologie). Les morceaux de batiste ont été déposés sur la cicatrice polie de manière à ce que les cellules se déposent à sa surface. Un pansement de gaze multicouche a été placé par-dessus, puis cousu aux bords de la cicatrice.

Une partie de la suspension cellulaire obtenue a été ensemencée en boîtes de Petri sur des films Polypore stériles découpés à la forme des boîtes, l'autre partie sur des boîtes de Petri sans film. La culture a été réalisée en milieu FAD, composé d'un mélange de DMEM et de milieu F12 dans un rapport 3:1, avec ajout de 10 % de sérum fœtal bovin, 5 μg/ml d'insuline (Sigma), 0,5 μg/ml d'hémisuccinate d'hydrocortisone (Sigma) et 10 μg/ml de facteur de croissance épidermique EGF (Institut de cytologie RAS, Saint-Pétersbourg). Les deuxième et troisième groupes de rats, composés de 7 individus chacun, ont été opérés 6 jours après le premier. À ce stade, des couches multicouches s'étaient formées à partir de la suspension de kératinocytes ensemencés dans les boîtes de Petri, qui ont été transplantées chez les rats. Le deuxième groupe a été transplanté avec des épidermocytes sur film, le troisième avec une couche multicouche sans substrat. Après 7 jours, les couches multicouches de kératinocytes allogéniques (MPALK) obtenues, ensemencées sur les films « Polypore », ont été transplantées sous forme de culture directement sur la plaie. Pour éviter tout déchirement, le film a été fixé par une bande de gaze multicouche et cousu à la peau des rats.

Avant la transplantation des kératinocytes au troisième groupe de rats cultivés sans substrat, le PAC a été séparé du fond de la boîte de Pétri par traitement à la dispase, une substance capable de rompre sélectivement les liaisons dermo-épidermiques. En agissant sur une couche multicouche, la dispase rompt la connexion des cellules de la couche basale avec le fond de la boîte de Pétri et a un effet bien moindre sur les connexions intercellulaires, ce qui permet de « retirer » entièrement la couche. Le détachement de la couche cellulaire multicouche par la dispase a été réalisé comme suit: le milieu de transport a été drainé des boîtes de Pétri, les couches cellulaires ont été lavées trois fois avec un milieu nutritif contenant des antibiotiques, notamment de la gentamicine (0,2 mg/ml). Les couches multicouches ont été remplies d'une solution de dispase à 0,125 % (« Sigma ») et placées dans un thermostat, où elles ont été incubées à t = 37 °C pendant 20 à 30 minutes. L'apparition d'un bord blanc se décollant à la périphérie de la couche indique le début de sa séparation des bords et du fond de la boîte de Pétri. Quelques minutes après le début de la séparation, la solution de dispase a été égouttée et les couches épithéliales ont été lavées 2 à 3 fois avec le milieu. Un morceau de pansement stérile « Lita-color », découpé aux dimensions du récipient, a été appliqué sur la surface de la couche épidermique, sur laquelle la couche séparée par la dispase, préalablement décollée du fond du récipient à l'aide d'une spatule, a été collée. À l'aide d'une pince à épiler, la couche ainsi que le revêtement de la serviette « Lita-color » (Russie) ont été arrachés du fond de la boîte de Pétri et soigneusement transférés sur la surface préparée de la cicatrice. Les serviettes "Lita-color" contiennent de la gentamicine et de l'exoline (extrait de collagène), qui, une fois humidifiées avec les restes du milieu de croissance puis avec une solution physiologique, gonflent et deviennent un pansement moderne, offrant une bonne protection contre les infections externes et une guérison rapide grâce à la structure absorbant l'humidité.

Des bandages de gaze multicouches ont été appliqués sur les films Polypore et les lingettes Lita-color, puis cousus à la peau des rats pour une fixation plus solide. Chaque rat a été placé dans une cage séparée afin de créer des conditions optimales pour le maintien et la prise de greffe des kératinocytes transplantés. Les bandages des rats transplantés avec la suspension et la couche multicouche d'épidermocytes prélevée par dispase ont été humidifiés avec du sérum physiologique stérile plusieurs fois par jour afin de créer les conditions optimales pour la prise de greffe. Le film Polypore étant imperméable à l'eau, les bandages des rats du deuxième groupe n'ont pas été humidifiés, ce qui constituait l'un des avantages par rapport aux greffes sans films. Les bandages ont été retirés au bout de 10 jours. Le tableau clinique des cicatrices après transplantation cellulaire différait peu de celui des cicatrices sans transplantation, à l'exception d'une couleur plus rose (due à la dermabrasion) et d'une desquamation plus importante. Cela suggère qu'immédiatement après le retrait des pansements avec le MPC, aucune modification de la cicatrice n'est apparue.

Prélèvement de matériel de biopsie sur des rats.

Après 1, 2, 5 et 9 mois de transplantation de kératinocytes allogéniques de rat sur des cicatrices polies de rats blancs, du matériel a été prélevé pour examen histologique, cytomorphologique et microscopique électronique. Des échantillons de peau et de cicatrice de rat normal, sans transplantation cellulaire, ont servi de témoins. L'anesthésie des rats a été réalisée à l'éther.

Après anesthésie, des fragments de tissu cicatriciel ont été prélevés sur les zones marquées, puis transplantés à l'aide d'un poinçon à biopsie de 2 mm de diamètre. Ces fragments ont été placés dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % afin de préparer le matériel à l'examen au microscope électronique. Les fragments de tissu prélevés pour l'examen histologique ont été placés dans une solution de formol neutre à 10 %, puis passés dans des alcools et inclus dans de la paraffine, puis découpés en coupes ultrafines et observés au microscope optique.

Témoin I. Peau normale de rat.

Afin de voir la différence entre l'image microscopique de la peau de rat normale altérée par des cicatrices et les cicatrices à certains moments après la transplantation de MPC, des photographies et des descriptions de celles-ci sont présentées à toutes les étapes de cette étude.

L'épiderme d'une peau normale est constitué de 7 à 9 couches de cellules. La couche cornée est d'épaisseur moyenne. Par endroits, elle est constituée de 6 à 8 couches d'écailles cornées. La couche basale est constituée de cellules cylindriques dotées de gros noyaux légers et réguliers, ainsi que de plusieurs nucléoles. Les connexions desmosomales entre les cellules et avec la membrane basale sont clairement visibles. Sous cette membrane basale bien définie, qui présente de petites excroissances dans la couche sous-épidermique, se trouvent parallèlement de délicats faisceaux de fibres de collagène et d'élastine, parmi lesquels se trouvent des fibroblastes allongés et de petits vaisseaux. Dans les couches plus profondes, ces faisceaux de fibres de collagène et d'élastine sont orientés dans des directions différentes. Parmi eux se trouvent de nombreux vaisseaux à parois fines de même calibre, des éléments cellulaires (fibroblastes, mastocytes, leucocytes), un grand nombre de follicules pileux et de glandes sébacées.

Témoin 2. Cicatrice de rat, âgée de 2 mois.

Tableau clinique. Les cicatrices sont rose pâle, avec desquamation, et des croûtes persistent par endroits. Leur surface a diminué en raison de la contraction des fibres de collagène et mesure environ 3 à 3,5 cm ^. Les annexes cutanées sont absentes.

Image microscopique. L'épiderme est constitué de 3 à 5 couches de cellules repliées, représentées par des cellules basales arrondies, une rangée de cellules subulées et une à deux rangées de cellules granuleuses avec des grains de kératohyaline dans la couche supérieure. On observe des zones d'œdème intracellulaire. La couche cornée est irrégulièrement modifiée, passant d'une couche très fine à une couche épaissie. On observe un plissement cicatriciel dû à la contraction du tissu cicatriciel. Les plis pénètrent jusqu'à la couche papillaire et donnent l'impression de papilles. La frontière entre l'épiderme et le derme est rectiligne. La membrane basale n'est pas visible partout. Dans la partie inférieure des couches sous-épidermiques et plus profondes, on trouve des vaisseaux à paroi épaisse et relâchée, dont beaucoup sont désertés et en stagnation. Autour des vaisseaux, on observe une accumulation de macrophages et de fibroblastes. Les macrophages entourent les érythrocytes libérés des capillaires et les phagocytent. Dans les couches plus superficielles, on trouve de petits capillaires. Sous l'épiderme, les fibres de collagène sont dispersées. Dans la couche profonde de la cicatrice, on trouve des faisceaux grossiers de fibres de collagène, parmi lesquels se trouvent de nombreux fibroblastes.

Cicatrice de rat un mois après la transplantation de kératinocytes de rat.

Tableau clinique. Les cicatrices sont roses, leur surface a diminué, notamment en diamètre, et mesurent en moyenne 2,5 à 3 cm² ^. Les cheveux et les glandes sébacées sont absents.

Les données d'examen microscopique du matériel obtenu chez les rats transplantés de MPaLK sur film et de MPaLK sans substrat sont pratiquement identiques. Cependant, d'un point de vue purement technique, la culture de MPaLK sans substrat est beaucoup plus complexe et laborieuse que la culture de MPaLK sur substrat. C'est pourquoi, pour approfondir la question de la transplantation de kératinocytes sur cicatrices, nous avons utilisé de la batiste multicouche comme substrat de culture.

Image microscopique. On observe un épaississement de l'épiderme jusqu'à 15 à 20 couches, presque jusqu'au milieu desquelles les kératinocytes ont une forme étroite, allongée, verticale et une disposition compacte. Les cellules basales sont disposées en ligne irrégulière. Leurs noyaux sont légers, gros et arrondis, avec un ou deux nucléoles, ce qui témoigne de leur forte activité synthétique et proliférative. La frontière entre l'épiderme et le derme est rectiligne. La couche épineuse est bien développée et se compose de 3 à 5 couches de cellules arrondies, dont certaines sont binucléaires.

Immédiatement sous la membrane basale, on trouve de denses faisceaux fins de fibres de collagène. Parallèlement, on observe un grand nombre de vaisseaux désertés. Les fibres de collagène plus profondes sont plus grossières et rassemblées en faisceaux denses. On y trouve de nombreux fibroblastes, mastocytes (2 à 3 visibles), macrophages, leucocytes et vaisseaux désertés, dont les parois sont relâchées, entourés de fibres de collagène lâches. Dans certains vaisseaux, on observe une stase, une diapédèse des éléments figurés. Autour des vaisseaux, on trouve des fibroblastes et des lymphocytes isolés. Les annexes cutanées sont absentes.

Lors de la transplantation d'une suspension de kératinocytes sur une cicatrice polie, l'image microscopique diffère de la précédente. Chez la plupart des animaux, l'épiderme est fin et composé de 5 à 6 couches de cellules. La couche inférieure est constituée de cellules de forme irrégulière et polygonale, avec des noyaux de forme arrondie et irrégulière. L'état de la couche sous-épidermique est similaire à celui observé chez les animaux n'ayant pas reçu de transplantation de MPALK.

Dans ce cas, on peut parler soit d'un retard dans les processus accompagnant la transplantation cellulaire, soit d'une perte importante de cellules transplantées sous forme de suspension. Il a donc été conclu que la correction des cicatrices par transplantation de kératinocytes sous forme de suspension était inopportune.

Cicatrice de rat 2 mois après transplantation de kératinocytes de rat.

Tableau clinique. La cicatrice est fine et délicate. On observe par endroits une desquamation et des squames.

Image microscopique. La couche cornée est épaissie, avec une hyperkératose par endroits. L'épiderme est épaissi et se compose de 12 à 20 rangées de cellules. La frontière entre l'épiderme et le derme est rectiligne. Les fines fibres de collagène sous-épidermiques sont denses. Dans les couches profondes de la cicatrice, elles sont regroupées en gros faisceaux grossiers. Une nouvelle vascularisation apparaît dans la couche sous-épidermique. Dans les couches inférieures du tissu cicatriciel, on observe de nombreux vaisseaux désertiques, parallèles à la surface de l'épiderme. De gros fibroblastes sont répartis uniformément dans l'épaisseur de la cicatrice, ainsi que de nombreux macrophages géants, multi-ramifiés.

Cicatrice de rat 5 mois après transplantation de cellules épidermiques de rat.

Tableau clinique. La cicatrice est régulière, lisse et ne pèle pas. On observe des poils isolés, plus denses en périphérie, ce qui indique une infiltration marginale de follicules pileux dans la cicatrice et leur formation. La surface cicatricielle continue de diminuer.

Image microscopique. L'épiderme est encore épais (15 à 20 couches, parfois jusqu'à 30). Dans les couches supérieures, il est rempli de grains de kératohyaline. La membrane basale est clairement visible. En dessous, les fibres de collagène sont lâches. Dans les couches inférieures, le collagène est plus puissant et dense. On trouve de nombreux capillaires parmi les faisceaux de collagène. Dans les couches supérieures, le nombre de vaisseaux désertés a diminué. La jonction de l'épiderme et du derme est légèrement ondulée. Par endroits, on observe des excroissances épidermiques profondes dans le tissu cicatriciel. Des vaisseaux néoformés sont visibles parmi les fibres de collagène. Des follicules pileux et des glandes sébacées apparaissent.

Cicatrice de rat 9 mois après la transplantation de cellules MPA épidermiques de rat.

Tableau clinique. Les cicatrices ont considérablement diminué de taille par rapport aux périodes précédentes, leur surface moyenne étant d'environ 1,5 à 2,0 cm² ^. Elles sont couvertes de poils fins de manière inégale, surtout en périphérie. Une légère desquamation en plaques subsiste.

Image microscopique.

L'épiderme s'est aminci, composé de 6 à 8 rangées de cellules et présente une structure similaire à celle de la peau normale de rat. Seules la densité cellulaire est supérieure de 1 mm et les cellules sont plus petites. La couche basale est constituée de petites cellules cylindriques arrondies. La membrane basale est bien exprimée, les hémidesmosomes étant clairement visibles. On observe la présence d'excroissances épidermiques dans la couche sous-épidermique. La couche papillaire est présente sur toute la longueur de la cicatrice. Ces données indiquent qu'à ce stade, l'adhésion des kératinocytes transplantés au tissu cicatriciel sous-jacent est devenue beaucoup plus forte. Par conséquent, le traitement des cicatrices chez les personnes ayant reçu une greffe de MPALK 9 mois après une greffe de MPC peut être traditionnel. Sous l'épiderme, les fibres de collagène sont plus fragiles que dans les couches profondes. De nombreux vaisseaux sont apparus, notamment superficiels. Les parois des vaisseaux les plus gros sont épaissies. Les follicules pileux et les glandes sébacées sont abondants. L'image microscopique ressemble à un tissu dermique.

Résultats des travaux expérimentaux et leur discussion.

Au cours de ce travail, des kératinocytes sous diverses formes ont été transplantés sur des cicatrices cutanées de rat artificiellement créées après une dermabrasion: sur des pansements, en suspension sur de la batiste et en couche multicouche sans substrat. Ces travaux visaient à obtenir des données morphologiques sur l'effet des kératinocytes allogéniques transplantés sur les cicatrices et à déterminer les options de transplantation optimales.

Il a été constaté que les trois méthodes de transplantation sont réalisables, mais la transplantation de MPAC sans substrat est une procédure très laborieuse, au cours de laquelle le MPAC peut être endommagé, ce qui affecte les résultats de la transplantation. De plus, cette méthode exclut le travail sur de grandes surfaces.

La transplantation de suspension de kératinocytes est une méthode beaucoup plus économique, ne nécessite pas de culture cellulaire prolongée et est simple dans la version que nous proposons, utilisant des ébauches de batiste stériles, dont la taille correspond à celle des cicatrices. Le retard d'environ un mois de l'effet thérapeutique lors de la transplantation d'une suspension cellulaire par rapport à la transplantation de MPC sur un pansement n'est pas significatif compte tenu de la durée du traitement. Il est connu que la transplantation de MPC chez les brûlés entraîne une transformation progressive de la structure cutanée sur plusieurs années. La transplantation de culture de kératinocytes sur un pansement est la méthode la plus pratique et la plus prometteuse, mais aussi nettement plus coûteuse. De plus, elle nécessite actuellement la recherche de revêtements plus performants, flexibles, hygroscopiques, dotés de propriétés bactériostatiques ou bactéricides et biologiquement neutres pour les cellules. Le film « Polypor », une version intermédiaire du film de pansement domestique, malgré quelques imperfections, nous a permis d'étudier expérimentalement la transplantation de kératinocytes de rat sur des cicatrices et de tirer des conclusions sur l'efficacité de ce traitement.

Les auteurs ayant transplanté des MPC sur des brûlures ont constaté qu'au cours de la première semaine suivant la transplantation d'une couche multicouche de kératinocytes sur des plaies désinfectées, l'épiderme s'est épaissi et stratifié. Toutes les couches de l'épiderme étaient clairement visibles. Il est intéressant de noter que le nombre de couches cellulaires dans les greffes était de 10 à 30 % supérieur à celui des biopsies cutanées. Les auteurs ont constaté l'apparition de granules de kératohyaline dès le cinquième jour après la transplantation de MPC, ainsi que de la membrane basale et des hémidesmosomes dès le troisième jour.

J. Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) ont constaté qu'au début de la transplantation de MPC chez des patients présentant des lésions cutanées de pleine épaisseur après des brûlures, la connexion entre le derme et l'épiderme est très faible et constitue une ligne droite, la couche papillaire étant absente. À la fin du deuxième mois, des papilles superficielles et des annexes cutanées commencent à se former, la connexion entre le derme et l'épiderme se renforce. Les données de la littérature indiquent que la transplantation de kératinocytes allogéniques sur les plaies des patients brûlés est une méthode prometteuse. Malgré le rejet des kératinocytes allogéniques, selon différents auteurs, dans un délai de 10 jours à 3 mois, ils jouent néanmoins leur rôle dans la cicatrisation de la surface de la plaie, la sécrétion de facteurs de croissance et la fermeture mécanique du défaut. On pense que les MPALC ont une activité antigénique réduite, car lors de la culture in vitro, elles perdent des cellules de Langerhans, ce qui leur permet de survivre longtemps dans l'organisme du receveur. De plus, une culture allogénique obtenue à partir de la peau de sujets jeunes et en bonne santé présente un potentiel biologique incomparablement supérieur à une culture autologue de patients après une blessure.

L'objectif principal de notre étude était de déterminer si les kératinocytes allogéniques s'implantent sur les cicatrices et quelles modifications se produisent dans le tissu cicatriciel sous l'influence d'un tel « revêtement de plaie » biologiquement actif. En cas de résultat positif, nous serions en mesure de développer la technologie la plus efficace et la moins exigeante en main-d'œuvre pour ce domaine de la médecine de réadaptation.

Les données obtenues sont en grande partie similaires aux données de la littérature concernant les modifications morphologiques de l'épiderme humain après transplantation de kératinocytes allogéniques sur des plaies de brûlure. Cependant, il existe des différences significatives, tant au niveau du substrat morphologique sur lequel la transplantation est réalisée que de la technologie utilisée. Ainsi, la formation de la membrane basale et des connexions dermo-épidermiques (hémidesmosomes, papilles) intervient plus tardivement que lors de la transplantation de kératinocytes sur des surfaces de plaies sans modifications cicatricielles. Cela semble dû à une nutrition moins bonne du tissu cicatriciel que du derme ou du fascia musculaire. Une cicatrice, surtout ancienne, est un tissu conjonctif dense et très peu vasculaire, tandis que le fond d'une plaie de brûlure est un tissu de granulation riche en vaisseaux. Il est donc évident que les conditions de transplantation et de prise de greffe de kératinocytes sont radicalement différentes. Plus la zone de transplantation cellulaire est vascularisée, plus le processus de greffe est facile. Ce postulat suggère qu'il est préférable de travailler sur des cicatrices jeunes, dont le tissu conjonctif est encore assez lâche et riche en vaisseaux.

À la suite de ce travail expérimental, il a été prouvé que:

1. La transplantation de MPALK sur des cicatrices est possible.
2. La méthode optimale de transplantation est la transplantation de kératinocytes sur la plaie.
3. La surface de la cicatrice doit être polie à l’aide d’une dermabrasion chirurgicale au laser ou d’un cutter Schumann.
4. Sous l'influence du MPALK, une épithélialisation rapide de la surface polie de la cicatrice se produit.
5. Plus le tissu cicatriciel est vascularisé, c'est-à-dire plus la cicatrice est jeune, meilleurs sont les résultats de la transplantation de kératinocytes.
6. Sous l'influence des kératinocytes transplantés, le tissu cicatriciel se transforme progressivement et se transforme en un tissu cicatriciel de type dermique (tissu cicatriciel plus lâche avec des appendices cutanés).
7. Le tissu cicatriciel se relâche progressivement, en commençant par la couche sous-épidermique. Sa vascularisation s'améliore, et les faisceaux de fibres de collagène des parties supérieure et inférieure de la cicatrice prennent une forme plus lâche que dans le tissu cicatriciel sans greffe cellulaire. Des follicules pileux et des glandes sébacées apparaissent. L'épiderme, ayant dépassé la phase d'hypertrophie, se rapproche structurellement de l'épiderme d'une peau normale.
8. Les changements observés sont associés à des facteurs de croissance et à des cytokines sécrétés par les kératinocytes, qui, en améliorant le trophisme du tissu cicatriciel, favorisent sa transformation d'un tissu fibreux grossier en un tissu plus lâche, ce qui conduit à une amélioration de l'apparence de la cicatrice.

Ainsi, sur la base de cette étude, on peut conclure que les kératinocytes transplantés ont un effet bénéfique sur le tissu cicatriciel, ce qui peut avoir des implications pratiques pour la rééducation des patients présentant divers types de cicatrices.

Ces travaux sur les rats nous ont également permis de formuler les exigences relatives aux revêtements de plaies sur lesquels les kératinocytes sont cultivés.

Les pansements doivent être:

• biocompatible avec les cellules,
• respirant,
• avoir une base élastique et formatrice,
• être hydrophile,
• car les additifs médicinaux contiennent des médicaments antibactériens et des antioxydants qui ne sont pas toxiques pour les cellules cultivées.

Résultats cliniques du traitement biotechnologique des cicatrices.

Auparavant, N. Carver et al. (1993) ont constaté que les pansements occlusifs favorisaient l'adhésion à la plaie et la survie des kératinocytes, mais ne permettaient pas la formation d'un épiderme stratifié (mature). Un environnement aéré est nécessaire à la formation d'un épiderme stratifié. Par conséquent, après l'adhésion d'une couche multicouche, il a été proposé de retirer le pansement occlusif après 7 à 10 jours et de traiter les plaies sous pansements secs ou onguents hydrosolubles. On peut affirmer que la qualité et les propriétés du « substrat » sur lequel les cellules se développent sont un facteur essentiel pour l'efficacité de la transplantation de matériel cellulaire, et donc pour les résultats du travail des médecins. Cependant, il n'existe pas aujourd'hui de pansement idéal, malgré l'abondance d'options proposées (peau artificielle, non-tissé en carboxyméthylcellulose, revêtements de fibrine, films de polyuréthane semi-perméables). Un point important dans cette affaire est le coût des « substrats » (revêtements spéciaux pour plaies), car leur coût élevé augmente le coût global du traitement biotechnologique.

L'efficacité des technologies cellulaires a été prouvée à ce jour, mais elles sont malheureusement très coûteuses, notamment dans les pays où la production industrielle de compositions cellulaires n'est pas encore établie. Cependant, des pays comme les États-Unis ont depuis longtemps développé une industrie de production de matériel cellulaire pour la transplantation de brûlés. En particulier, la société BioSurface Technology Inc. a cultivé, depuis 1989, 37 000 couches de kératinocytes multicouches, qui ont servi à traiter 240 patients dans 79 pays à travers le monde (R. Odessey, 1992), alors qu'un cm² de culture ^cellulaire coûte environ 7 à 8 dollars américains.

La technologie de traitement de diverses maladies et problèmes de peau présente un certain nombre de différences, mais tout traitement cellulaire repose sur l’obtention de matériel cellulaire de haute qualité et sa transplantation.

Ce processus comprend les étapes suivantes:

• prélever la peau des victimes (ou des donneurs),
• transport de lambeaux cutanés vers un centre de biotechnologie,
• isolement des cellules de la couche basale et leur prolifération,
• croissance de couches multicouches de kératinocytes (MLK).
• transplantation de culture cellulaire.

Le principal problème du traitement par transplantation de feuillets de kératinocytes multicouches réside dans la nécessité de cellules viables à toutes les étapes de la transplantation. Les fragments de peau destinés à l'isolement des cellules autologues ou allogéniques doivent être aussi fins que possible, car ils sont alors plus faciles à séparer par des méthodes mécaniques et enzymatiques et à obtenir une suspension de cellules vivantes pour la culture. Ils peuvent être obtenus par incision au dermatome ou à partir de la peau des paupières, du prépuce et de la face interne de l'épaule. Étant donné la sensibilité des cellules aux halogènes (chlore, iode) et au peroxyde d'hydrogène, elles ne peuvent pas être utilisées lors du traitement de la peau lors du prélèvement du matériel.

Le rendement quantitatif et qualitatif des cellules issues des greffes cutanées et l'efficacité de leur culture dépendent également de l'état de santé et de l'âge du donneur. De plus, les biopsies cutanées doivent être livrées le plus rapidement possible et dans des conditions appropriées (environnement, température) à un laboratoire certifié et accrédité à cet effet.

Pour le stockage et le transport des lambeaux cutanés, on peut utiliser le milieu d'Eagle ou le milieu 199 additionné de 10 % de sérum bovin, le milieu DMEM additionné de 5 % de sérum bovin fœtal et des antibiotiques.

Au laboratoire de cytologie, la biopsie cutanée est d'abord divisée mécaniquement en petits morceaux, puis les morceaux de peau sont traités à l'aide d'enzymes: trypsine, collagénase, dispase, etc.

Sous l'action des enzymes, les desmosomes sont détruits et les kératinocytes sont libérés dans le milieu sous forme de cellules individuelles ou d'agrégats constitués de nombres différents de cellules. Seuls les kératinocytes basaux sont utilisés pour la culture. Ils sont cultivés sur des milieux spéciaux dans des thermostats contenant 5 % de CO2, en boîtes de Petri ou en flacons à t = 37 °C. Après 48 heures, on observe la formation de colonies de kératinocytes, qui fusionnent progressivement pour former une monocouche. Après avoir reçu un nombre suffisant de cellules, la suspension obtenue est ensemencée sur des pansements préparés à cet effet et placés dans des boîtes de Petri. Une monocouche, puis une couche multicouche de kératinocytes se forment à partir de la suspension. Les étapes du processus de culture des kératinocytes sont schématisées à la figure 12 (33, 43, 54, 65).

La formation d'une couche multicouche de kératinocytes adaptée à la transplantation prend généralement 7 à 10 jours. Cette période peut parfois être plus longue, en fonction de la qualité du matériel source (âge, état de santé du donneur, exactitude du prélèvement, qualité du milieu utilisé, etc.). Si la couche multicouche prolifère, des cellules présentant des phénomènes d'apoptose, impropres à la transplantation, peuvent apparaître à sa surface. Les boîtes de Petri contenant des couches multicouches de kératinocytes (MLK) cultivées sur des pansements de plaies sont livrées à la clinique dans des récipients spéciaux à une température d'au moins +15 °C.

Méthode Green modifiée pour la culture du MPC

Dans notre travail, nous avons utilisé de la batiste multicouche comme pansement, abandonnant les films « Polypor » avec lesquels nous avions commencé à travailler lors de l'expérience sur les rats. Nous avons ainsi cultivé des couches de kératinocytes multicouches sur de la batiste pré-dégraissée et stérile, bien que ce ne soit pas non plus un pansement optimal.

Les études cliniques ont été menées sur des volontaires dans le respect des normes éthiques nécessaires: signature d'un accord et consentement éclairé.

1. Une culture de kératinocytes propres au patient (autologues) et de kératinocytes en banque (allogéniques) a été utilisée.
2. Les propres kératinocytes des patients ont été obtenus à partir d’un morceau de peau prélevé à l’intérieur de la partie supérieure de leurs bras.
3. La chirurgie de dermabrasion des cicatrices a été réalisée à l'aide d'une thermocautérisation, de disques rotatifs et d'un laser erbium.
4. Des groupes de patients présentant des cicatrices normotrophiques, hypotrophiques et hypertrophiques ont été sélectionnés.

Le processus technologique d’application de la technologie cellulaire pour améliorer l’apparence des cicatrices cutanées comprenait les étapes suivantes:

1. Sélection des patients.
2. Explications sur l'essence du traitement, le délai d'obtention des résultats attendus, la signature du contrat et le consentement éclairé.
3. Prescrire aux patients 2 à 3 semaines avant la chirurgie selmevit 1 comprimé 3 fois par jour, zinctheral 1 comprimé 3 fois par jour.
4. Prélever un morceau de peau de 2,0 cm de long et de 0,7 à 1,0 cm de large sur la surface interne de l'épaule, en hauteur, presque dans la partie inférieure de la région axillaire pour obtenir des kératinocytes autologues.
5. Dans les cas où les patients refusaient d'isoler leurs propres kératinocytes en raison de la possibilité d'une cicatrice linéaire sur la surface interne de l'épaule, du matériel cellulaire a été prélevé dans une banque de cellules (kératinocytes allogéniques).
6. Les kératinocytes ont été isolés et cultivés dans un laboratoire certifié pour ce type de travail.
7. Après avoir obtenu une quantité suffisante de MPC pour la transplantation sur les cicatrices, un jour a été fixé pour l'opération à la clinique, où le matériel a été apporté dans des conteneurs spéciaux dans des boîtes de Petri.
8. Une dermabrasion cicatricielle a été réalisée, suivie d'une hémostase. La surface polie a été lavée avec une solution saline stérile, séchée, puis les cellules souches mésenchymateuses (CPM) y ont été transplantées sur une batiste stérile, « cellules vers le bas ». Autrement dit, les cellules situées au-dessus des CPM se sont retrouvées en dessous, adjacentes à la surface polie.
9. Un film stérile a été appliqué par-dessus, puis fixé à la peau à l'aide d'un bandage élastique ou d'un pansement élastique Omnifix. À la place du film, des pansements contenant du silicone peuvent être utilisés, comme Mepitel, Mepiform ou des feuilles de gel de silicone.

Après 5 à 7 jours, le film ou le revêtement de silicone est retiré. À ce stade, tous les kératinocytes devraient avoir envahi la cicatrice polie et adhéré à sa surface.

10. L'environnement humide créé sous le film et le revêtement de silicone y contribue activement. La batiste restant sur la cicatrice peut alors être imprégnée de curiosine ou de gel de chitosane. Ainsi, le deuxième jour, une croûte dense se forme. Pour le confort du patient, il est préférable de la fixer avec un patch élastique et respirant, tel qu'Omnifix. Cette croûte respirante permet à l'épiderme formé de se différencier et de mûrir.

Selon le type de cicatrice et la profondeur du frottement, le pansement est retiré après 8 à 10 jours. À ce stade, l'épiderme présente 30 à 40 % de couches cellulaires en plus que dans une peau normale. La membrane basale n'est pas formée. Les kératinocytes de l'épiderme épaissi sécrètent de nombreuses molécules biologiquement actives dans le tissu cicatriciel.

Le succès du traitement biotechnologique des cicatrices dépend en grande partie de la méthode de soins postopératoire. Les cultures cellulaires constituent un type de pansement « doux » et, dès les premiers stades suivant la transplantation, les cellules souches hématopoïétiques (CPI) peuvent être facilement décollées des tissus sous-jacents. Il est donc conseillé aux patients de manipuler la cicatrice avec précaution après l'intervention. Pendant 8 à 9 mois, évitez de frotter et traitez délicatement à l'eau bouillie froide afin d'éviter d'arracher l'épiderme fin et nouvellement formé, qui n'est pas bien fixé aux tissus sous-jacents.

Note.

Avant une intervention chirurgicale et pendant une dermabrasion, l'utilisation d'antiseptiques et d'oxydants halogénés (iodopyrone, suliodopyrone, iodinol, iodinate, chlorhexidine, peroxyde d'hydrogène) est autorisée. Avant une transplantation cellulaire, elle est strictement contre-indiquée en raison de leur effet cytotoxique. Le bleu de méthylène et le vert brillant sont également toxiques pour les cellules.

Pour éviter toute infection, notamment en cas de cicatrices hypertrophiques, le champ opératoire peut être traité avec du sulfate de néomycine, de la polymyxine ou de la gentamicine. Ces produits n'ont pas d'effet cytotoxique sur les kératinocytes.

Grâce à un tel traitement, un triple effet est obtenu.

1. Nivellement de la surface de la cicatrice.
2. Création d'une couche de nouvel épiderme d'épaisseur normale au-dessus.
3. Transformation du tissu cicatriciel en tissu de type dermique sous l'action des cytokines, des facteurs de croissance et d'autres molécules biologiquement actives sécrétées par les cellules transplantées et stimulées par celles-ci: kératinocytes, fibroblastes et macrophages.

La cicatrice devient moins visible, plus élastique, des pores et des poils duveteux y apparaissent et la pigmentation peut être restaurée grâce à la présence de mélanocytes dans l'IPC.

Cependant, tous ces aspects positifs de la cicatrice ne se manifestent pas immédiatement. À cet égard, il est nécessaire d'avertir les patients que le processus de transformation du tissu cicatriciel en tissu dermique est lent et que le résultat optimal d'un tel traitement ne peut être attendu avant 10 à 14 mois. Immédiatement après le rejet des pansements, les surfaces polies présentent une polychromie prononcée, d'autant plus brillante que le polissage a été effectué en profondeur. Le polissage des cicatrices normotrophes au laser erbium est le moins dommageable pour la peau. La couleur des cicatrices et de la peau environnante est restaurée en 3 à 8 semaines. Malgré ces précautions, une hyperpigmentation postopératoire peut parfois survenir, qui peut disparaître spontanément en quelques mois.

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