Travaux expérimentaux sur la transplantation de kératinocytes allogéniques sur des cicatrices artificiellement créées de rats blancs

Le désir d'utiliser le potentiel cellulaire et la nécessité de rechercher de nouvelles méthodes efficaces pour améliorer l'aspect esthétique des cicatrices ont conduit à l'idée d'essayer d'étudier la possibilité d'une transplantation de kératinocytes sur des surfaces cicatricielles.

Afin de prouver la possibilité d'utiliser la culture pour améliorer kératinocyte l'apparence des cicatrices travaux expérimentaux ont été effectuées sur des rats de laboratoire blancs, qui ont été créées surface de cicatrice. Le modèle du rumen des rats a été obtenu à la suite de la guérison des plaies artificiellement infligées sur le dos, le long de la colonne vertébrale. Les rats ont été coupés morceaux du même cuir, taille de 2x3 cm. Après 2,5 mois après l'opération rats « cicatrices de simulation » a été réalisée chirurgie dermabrasion (ablation des couches supérieures via ruminale de ignioperation) et des kératinocytes allogéniques transplantées, isolé de la peau des jeunes rats 2-4 jours après la naissance.

L'isolement et la croissance des épidermocytes de rat a été réalisée dans le laboratoire des technologies cellulaires de l'Institut de cytologie RAS de la technologie suivante.

La peau a été lavée dans une solution saline de Hank contenant 200 U / ml de gentamicine, coupé en petits morceaux, une zone de 0,2-0,5 cm ². Des cubes de peau ont été incubés dans une solution de désaspase à 0,5% dans une solution tamponnée au phosphate salin équilibrée à 37 ° C pendant une heure. Les morceaux ont ensuite été transférés dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco et l'épiderme a été séparé du derme. L'épiderme a été incubé dans une solution de trypsine à 0,125% pendant 10-15 minutes sous agitation à 50 tr / min, après quoi l'action de l'enzyme a été stoppée par l'addition de 5% de sérum fœtal bovin. Un tiers de la suspension cellulaire obtenue a été utilisé dans sa forme pure pour l'une des variantes de la transplantation dans les cicatrices, le deuxième tiers a été cultivé sur des revêtements de films domestiques biocompatibles "Polypor", le troisième sur des boîtes de Pétri sans substrat. L'opération de la dermabrasion des cicatrices obtenues chez les rats avec une transplantation subséquente d'épidermocytes de rat sur eux a été réalisée sous anesthésie à l'éther en utilisant une cautérisation par la chaleur.

Le premier groupe de rats après dermabrasion sur polie, lavées avec une solution saline et des pièces superposées rumen stériles de surface sèche de gazon, qui a été déposé brouillé la suspension de rat allogénique à une concentration de cellules de 1,5 millions pour 1 ml (en fonction de l'Institut de la cytologie). Batistovye pièces s'adaptent sur la cicatrice polie de sorte que les cellules se trouvent sur la surface de la cicatrice. Un bandage de plusieurs couches de gaze a été cousu sur le dessus, qui a été cousu aux bords de la cicatrice.

Une partie de la suspension cellulaire résultante a été étalée dans des boîtes de Pétri sur des films de Polypore stériles coupés en forme de coupelles, l'autre partie sur des boîtes de Pétri sans film. La culture a été réalisée dans un milieu FAD constitué d'un mélange de DMEM et de F12 dans un rapport de 3: 1. Avec l'addition de 10% de sérum fœtal bovin, 5 ug / ml d'insuline (Sigma), 0,5 ug / ml d'hémisuccinate d'hydrocortisone (Sigma). 10 ug / ml de facteur de croissance épidermique EGF (Institute of Cytology RAS, Saint-Pétersbourg). Les deuxième et troisième groupes de rats avec 7 individus ont été opérés 6 jours après le premier. A ce moment, des strates multicouches ont été formées à partir de la suspension de kératinocytes ensemencés dans des boîtes de Pétri, qui ont été transplantées sur des rats. Le deuxième groupe a été transplanté avec des épidermocytes sur le film, le troisième groupe - avec une couche multicouche sans substrat. Après 7 jours, les couches multicouches de kératinocytes alogiques (MPALK), ensemencées sur des films de Polypore, ont été transplantées par culture directement sur la surface de la plaie. Au-dessus, le film, afin d'éviter son arrachement, a été fixé avec un pansement de gaze multicouche et cousu à la peau des rats.

Avant la transplantation de kératinocytes troisième groupe de rats, cultivés sans substrat, produisant une séparation des PAC à partir du fond du traitement de dispase de boîte de Pétri, ayant la capacité de décomposer sélectivement la communication dermo-épidermique. Sous l'action d'une dispase réservoir multicouche détruit la liaison de la couche de cellules basales au fond de la boîte de Petri et, dans une moindre mesure, cela affecte la communication intercellulaire, qui permet de « retirer » la totalité de la couche. Le détachement de la strate cellulaire multicouche par la disposition a été effectué comme suit. De boîtes de Petri mélangés milieu de transport, les feuilles de cellules ont été lavées trois fois avec du milieu contenant des antibiotiques, en particulier - gentamicine (0,2 mg / ml). On a versé des couches multicouches solution 0.125% de dispase ( «Sigma») et placées dans un incubateur où elles ont été incubées à t = 37 ° C pendant 20-30 minutes. L'apparition de la corolle blanche, épluchage autour de la périphérie du réservoir - un indicateur du début du processus de séparation à partir des bords et le fond de la boîte de Petri. Quelques minutes après le début du processus de séparation, la solution a été vidé dispase 2-3 fois les couches epitheliales ont été lavées avec du milieu. Sur la surface de la couche épidermique a été appliquée, coupe à pièce de tasse de taille plaie stérile pansement « Leith couleur, qui est clivé séparé dispase formation, la délamination ultérieure du fond de la coupelle avec une spatule. En utilisant des pincettes ophtalmiques couche conjointement avec le revêtement de la serviette » Leith-couleur « (Russian ) rompu avec le fond d'une boîte de Pétri et soigneusement transférée sur la surface préparée de la cicatrice. Serviettes « Lita-couleur » contient dans sa composition et de la gentamicine eksolin (extrait de collagène), qui, lorsqu'il milieu humide demeure pousse à l'avenir solution saline Shem enflé et est devenu revêtement moderne des plaies qui assure une bonne protection contre l'infection externe et la guérison rapide due à l'humidité naissante avec la structure.

Des films de polypropylène et des serviettes de couleur Lita ont été stratifiés avec des bandages de gaze qui ont été cousus sur la peau des rats pour une fixation plus durable. Chaque rat a été planté dans une cage séparée, pour créer des conditions optimales pour son maintien et sa prise de greffe de kératinocytes transplantés. Bandages rats qui transplantées suspension et réservoir à couches multiples epidermotsitov dispase shot, chaque jour plusieurs fois par jour, humidifiés avec une solution saline stérile pour créer les conditions les plus favorables, les cellules pour la prise de greffe. Considérant que le film "Polypor" était imperméable à l'eau, les rats du deuxième groupe n'ont pas humidifié les pansements, ce qui était l'un des avantages par rapport aux greffes sans films. Après 10 jours, les bandages ont été enlevés. Le tableau clinique des cicatrices après la transplantation cellulaire différait peu des cicatrices sans transplantation, à l'exception d'une coloration plus rose (due à la dermabrasion) et d'un plus grand pelage. Ce fait suggère cela. Que, immédiatement après la disparition des plaies avec IPC, aucun changement n'est survenu dans le rumen.

Prenant le matériel de biopsie chez les rats.

Après 1, 2, 5 et 9 mois après le transfert des kératinocytes alogiques de rat sur les cicatrices broyées des rats blancs, le matériel a été prélevé pour examen histologique, cytomorphologique et microscopique électronique. Comme témoin, des échantillons de peau et de cicatrice de rat normales ont été prélevés sans transplantation de cellules. L'anesthésie chez le rat a été réalisée avec une anesthésie à l'éther.

Après anesthésie, à partir des zones marquées, dans lesquelles les kératinocytes ont été transplantés, un biopsie perceur d'un diamètre de 2 mm. Les morceaux de tissu cicatriciel ont été prélevés et placés dans une solution à 2,5% de glutaraldéhyde pour préparer le matériau pour la microscopie électronique. Des morceaux de tissu prélevés pour un examen histologique ont été placés dans une solution à 10% de formol neutre, puis passés à travers des spiritueux et versés dans de la paraffine, puis coupés en tranches ultra-minces et observés dans des microscopes optiques.

Contrôle I. Peau de rat normale.

Afin de voir la différence entre l'image microscopique de la peau cicatricielle normale des rats et des cicatrices à certains moments après la transplantation IPC, des photographies et des descriptions à eux à tous les stades de cette étude sont démontrées.

L'épiderme de la peau normale est composé de 7 à 9 couches de cellules. Couche cornée d'épaisseur modérée. Par endroits, il se compose de 6-8 couches d'écailles cornées. La couche basale est représentée par des cellules de forme cylindrique avec une grande lumière, des noyaux réguliers et plusieurs nucléoles. Les connexions desmosomales entre les cellules et la membrane basale sont clairement exprimées. Sous membrane basale bien définie qui présente des protubérances fines dans la couche sous-épidermique sont parallèles aux faisceaux douces de collagène et les fibres d'élastine, y compris les fibroblastes allongés, de petits vaisseaux. Dans les couches plus profondes, les faisceaux de fibres de collagène et d'élastine se trouvent dans des directions différentes. Parmi eux, il y a beaucoup de vaisseaux avec des parois minces du même calibre, des éléments cellulaires (fibroblastes, mastocytes, leucocytes). Dans un grand nombre de follicules pileux, les glandes sébacées.

Contrôle 2. Scar d'un rat âgé de 2 mois.

Image clinique. Cicatrices rose pâle, avec desquamation, par endroits les croûtes restent. Leur superficie est réduite en raison de la contraction des fibres de collagène et deviennent environ 3,0-3,5 cm ^:. Les attaches de peau sont absentes.

Image microscopique. L'épiderme se compose de 3-5 couches de cellules, pliées, représentées par des cellules basales de forme arrondie, une rangée de subulate, 1-2 rangées de granules avec des grains de kératogialine dans la couche supérieure, il y a des sections d'œdème intracellulaire. La couche cornéenne est changée de façon hétérogène de très mince à épaissie. Il y a un plissement du rumen dû à la contraction du tissu cicatriciel. Les plis pénètrent dans la couche papillaire et donnent l'impression de papilles. La limite entre l'épiderme et le derme est une ligne droite. La membrane basale ne peut pas être tracée partout. Dans la partie inférieure des couches subépidermiques et plus profondes - des vaisseaux avec une paroi épaisse et décollée, beaucoup ont déserté, avec des phénomènes de stase. Autour des vaisseaux - un groupe de macrophages, fibroblastes. Les macrophages entourent les érythrocytes émergeant des capillaires et les phagocytent. Dans les couches plus superficielles - petits capillaires. Sous l'épiderme, les fibres de collagène sont lâches. Dans la couche plus profonde du rumen - des faisceaux grossiers de fibres de collagène parmi lesquels il y a beaucoup de fibroblastes.

La cicatrisation d'un rat un mois après la transplantation de kératinocytes de rat MPAl.

Image clinique. Cicatrices roses, leur surface a diminué, surtout en diamètre et en moyenne 2,5-3 cm ². Les poils et les glandes sébacées sont absents.

Ces examen microscopique du matériau obtenu à partir de rats avec transfert MPAlK MPAlK sur le film et le substrat sans sensiblement identiques. Toutefois, sur le plan technique, le travail avec MPAlK non pris en charge beaucoup plus difficile et laborieuse que lorsqu'il est cultivé MPAlK sur le substrat, de sorte que la nouvelle étude de la question sur la transplantation kertainotsitov cicatrices, nous avons utilisé comme base pour la culture ( « substrat ») à gazon en couches.

Image microscopique. Il y a un épaississement de l'épiderme à 15-20 couches, presque au milieu desquelles les kératinocytes ont une forme étroite, allongée, verticale et un arrangement compact. Les cellules basales sont disposées en une ligne irrégulière. Leurs noyaux sont légers, larges, de forme ronde avec un ou deux nucléoles, ce qui indique leur haute activité synthétique et proliférative. La limite entre l'épiderme et le derme est une ligne droite. La couche épineuse est bien développée, se compose de 3-5 couches de cellules de forme ronde, il y a 2 cellules nucléolaires.

Immédiatement sous la membrane basale - des faisceaux minces denses de fibres de collagène, en parallèle à eux un grand nombre de vaisseaux vides, les fibres de collagène plus profondes sont plus grossières, recueillies en faisceaux denses. Beaucoup de grands fibroblastes, des mastocytes (2-3 dans le champ de vision), des macrophages, des leucocytes et des vaisseaux vides, dont les parois sont desserrées, autour d'eux sont des fibres de collagène lâche. Dans certains vaisseaux - la stase, la diapédèse des éléments uniformes. Autour des vaisseaux - les fibroblastes, les lymphocytes simples. Les attaches de peau sont absentes.

Lorsqu'une suspension de kératinocytes est transplantée sur une cicatrice polie, l'image microscopique diffère de la précédente. Dans la plupart des animaux - l'épiderme est mince, se compose de 5-6 couches de cellules. La couche inférieure est constituée de cellules de forme polygonale irrégulière avec des noyaux arrondis de forme irrégulière. L'état de la couche sous-épidermique est similaire à celui du groupe d'animaux sans transplantation.

Dans ce cas, on peut parler soit de retard dans les processus accompagnant la transplantation cellulaire, soit d'une perte importante de cellules transplantées sous forme de suspension. Par conséquent, une conclusion a été faite que la correction de la cicatrisation par la transplantation de kératinocytes sous la forme d'une suspension est inappropriée.

Cicatrisation du rat 2 mois après la transplantation de kératinocytes de rat MPAl.

Image clinique. La cicatrice est mince, tendre. Par endroits il y a une ecdysis, des échelles.

Images microscopiques. La couche cornée est épaissie, par endroits - hyperkératose. L'épiderme est épaissi, il se compose de 12-20 rangées de cellules. La limite entre l'épiderme et le derme est une ligne droite. Les fibres de collagène délicates sous l'épiderme sont assez serrées. Dans les couches plus profondes du rumen, ils sont recueillis dans de gros faisceaux grossiers. Dans la couche sous-épidermique, une nouvelle formation de vaisseaux apparaît. Dans les couches inférieures du tissu cicatriciel - de nombreux vaisseaux vides, situés parallèlement à la surface de l'épiderme. Les gros fibroblastes sont répartis uniformément dans l'épaisseur du rumen, il y a des macrophages géants, aux multiples facettes, nombreux.

La cicatrisation du rat 5 mois après la transplantation de la MP des spermocytes de rat.

Image clinique. La cicatrice semble lisse, lisse sans peler, il y a des poils simples, leur densité est plus grande à la périphérie des cicatrices, ce qui indique la croissance marginale des follicules pileux dans la cicatrice et la formation de follicules pileux. La zone des cicatrices continue de diminuer.

Image microscopique. L'épiderme est encore épais (15-20 couches, parfois jusqu'à 30) dans les couches supérieures est rempli de grains de kératogialine. La membrane basale est clairement visible. Sous ses fibres de collagène se détacher. Dans les couches inférieures, le collagène est plus puissant et plus compact. Parmi les faisceaux de collagène, il y a beaucoup de capillaires. Dans les couches supérieures, le nombre de vaisseaux vides diminue. L'épiderme et le derme sont légèrement ondulés. Il y a des excroissances épidermiques profondes dans le tissu cicatriciel. Parmi les fibres de collagène, on distingue des vaisseaux nouvellement formés. Apparaissent les follicules pileux simples et les glandes sébacées.

La cicatrisation du rat 9 mois après la transplantation d'épidermocytes de rat rat IPA.

Image clinique. Les cicatrices sont devenues beaucoup plus petites en comparaison avec les termes antérieurs, leur superficie moyenne est d'environ 1,5-2,0 cm ². Les cicatrices sont inégalement couvertes de poils fins, particulièrement autour de la périphérie. La mise à l'échelle mineure des petites plaques est conservée.

Image microscopique.

L'épiderme est devenu plus mince, représenté de 6-8 rangées de cellules, rappelant la structure épidermique de la peau normale des rats, seule la densité des cellules de 1 mm. Plus haut et ils sont plus petits. La couche basale est constituée de petites cellules de forme cylindrique ronde. La membrane basale est bien définie, les hémidesmosomes sont clairement visibles. La présence d'excroissances épidermiques dans la couche sous-épidermique est notée. La couche papillaire est exprimée sur toute la longueur de la cicatrice. Ces faits indiquent que, pendant cette période, l'adhésion des kératinocytes transplantés est devenue beaucoup plus durable avec les tissus sous-jacents du rumen. Par conséquent, la prise en charge des cicatrices des personnes ayant subi une greffe de MALC, 9 mois après la transplantation IPC, peut être traditionnelle. Sous l'épiderme sont des fibres de collagène plus délicates que dans les couches profondes. Il y avait beaucoup de navires, particulièrement situés en surface. Dans les grands navires, les murs sont épaissis. Les follicules pileux et les glandes sébacées en grande quantité. Le motif microscopique ressemble à un tissu dermique.

Résultats du travail expérimental et de leur discussion.

Au cours de ce travail sur les cicatrices de la peau artificielle de rats après une dermabrasion de fonctionnement, les kératinocytes transplantées dans divers formah- sur les surfaces des plaies, en tant que suspension dans batiste et sans formation en couches un substrat. Le travail a été effectué pour obtenir des données morphologiques sur l'effet des kératinocytes allogéniques transplantés sur les cicatrices, ainsi que pour déterminer les variants de transplantation optimale.

Il a été constaté que les trois méthodes de transplantation sont réelles, mais la transplantation d'IPAA sans substrat est une procédure très laborieuse, au cours de laquelle l'IPAC peut être blessé, ce qui affecte les résultats de la transplantation. De plus, cette méthode de transplantation exclut le travail sur de grandes surfaces.

La transplantation de la suspension de kératinocytes est une méthode beaucoup plus économique, ne nécessite pas de culture de cellules longues, et est simple dans notre version proposée en utilisant des billettes de batte stériles dont les dimensions correspondent à la taille des cicatrices. Le retard de l'effet thérapeutique lors de la transplantation de la suspension cellulaire pendant environ un mois par rapport à la CMI sur le revêtement de la plaie n'est pas un moment significatif avec la durée du traitement, calculé en plusieurs mois. Il est connu que lors de la transplantation de l'IPC pour brûler des patients, la transformation de l'état de la structure de la peau s'est produite progressivement et pendant plusieurs années. La transplantation de la culture de kératinocytes sur les couvertures de plaies est la méthode la plus pratique et la plus prometteuse, mais elle est également beaucoup plus coûteuse. De plus, nécessitant pour aujourd'hui la recherche de revêtements plus sophistiqués qui doivent être plastiques, hygroscopiques, avoir des propriétés bactériostatiques ou bactéricides et être biologiquement neutres pour les cellules. Le film « Polipor » - une version intermédiaire de la couverture de la plaie cinématographique nationale, en dépit de quelques lacunes, nous a permis d'étudier les rats de transplantation expérimentale sur les cicatrices et kératinocytes de tirer des conclusions sur l'efficacité de cette cicatrice attraction direction.

Les auteurs qui ont effectué la transplantation IPC sur des plaies brûlées ont noté que pendant la première semaine après la transplantation de la couche de kératinocytes multicouches sur les plaies aseptisées, l'épiderme s'épaississait et se stratifiait. Toutes les couches de l'épiderme étaient bien définies. Il est intéressant que le nombre de couches cellulaires dans les greffes soit de 10 à 30% plus élevé que dans les échantillons de biopsie cutanée. Les auteurs ont noté l'apparition de granules de kératogialine au 5ème jour après la transplantation de MPA, de la membrane basale et des hémidesmosomes - déjà le troisième jour.

J.Rives et autres (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) ont constaté que pendant les premières périodes suivantes transplantation patients DMO avec des défauts de la peau polnosloynymi après des brûlures, la communication entre le derme et l'épiderme est très faible et est une ligne droite, la couche papillaire est absent. À la fin du deuxième mois, la formation des papilles peu profondes et des appendices de la peau commence, la connexion entre le derme et l'épiderme devient plus durable. Les données de la littérature parlent de la transplantation de kératinocytes allogéniques sur les plaies de patients brûlés, comme une méthode prometteuse. Malgré le fait que le rejet des kératinocytes allogéniques se produit par différents auteurs dans la période de 10 jours à 3 mois, néanmoins ils remplissent leur rôle dans la cicatrisation de la surface de la plaie, l'isolement des facteurs de croissance et la fermeture mécanique du défaut. On pense que MPALK a une activité antigénique réduite, puisque pendant la culture in vitro, les cellules de Langerhans perdent, ce qui leur permet d'exister longtemps dans l'organisme receveur. De plus, la culture allogénique obtenue à partir de la peau de jeunes gens en bonne santé a un potentiel biologique incomparablement plus grand que la culture autologue de patients après un traumatisme.

Le but principal de notre étude était de déterminer si les kératinocytes allogènes survivraient sur les cicatrices et quels seraient les changements dans le tissu cicatriciel sous l'influence d'un tel «enrobage» biologiquement actif. En cas de résultat positif, élaborer la technologie la plus efficace et la moins exigeante en main-d'œuvre dans ce domaine de la médecine de réadaptation.

Les données que nous avons obtenues à bien des égards se sont révélées être similaires aux données de la littérature sur les changements morphologiques survenant dans l'épiderme humain après le transfert de kératinocytes allogènes pour brûler les plaies. Mais il existe des différences significatives, à la fois en termes de substrat morphologique, qui est transplanté, et en termes de technologie. Donc le processus de formation de la membrane basale et des connexions dermo-épidermiques (hémidesmosomes, papilles) survient plus tard que lors de la transplantation de kératinocytes sur les surfaces de la plaie sans changement de cicatrice. Apparemment, cela est dû à une mauvaise nutrition des tissus du rumen par rapport au derme ou à l'aponévrose musculaire. La cicatrice, en particulier l'ancienne, est un tissu conjonctif dense avec un très petit nombre de vaisseaux, le fond de la plaie est un tissu de granulation riche en vaisseaux sanguins. Ainsi, il est évident que les conditions dans lesquelles la transplantation et la prise de greffe de kératinocytes se produisent sont complètement différentes. Plus la zone de transplantation des cellules est vascularisée, plus il est facile de les traiter. De ce postulat, il y a une conclusion sur la préférence pour travailler avec de jeunes cicatrices, dans lesquelles le tissu conjonctif est encore assez lâche et riche en vaisseaux sanguins.

À la suite de ce travail expérimental, il est prouvé que:

1. Une transplantation de MALK aux cicatrices est possible. 
2. La méthode optimale de transplantation est la transplantation de kératinocytes sur la couverture de la plaie.
3. La surface de la cicatrice doit être rectifiée en utilisant une dermabrasion opératoire utilisant le laser de Schumann ou un cutter.
4. Sous l'influence de MPALK, il se produit une rapide épithélisation de la surface du rumen.
5. Le meilleur tissu cicatriciel vascularisé, c'est-à-dire, plus la cicatrice est jeune, meilleurs sont les résultats de la transplantation de kératinocytes.
6. Le tissu cicatriciel sous l'influence des kératinocytes transplantés est progressivement transformé et se transforme en un tissu dermique (tissu cicatriciel plus friable avec des appendices de la peau).
7. Le descellement progressif du tissu cicatriciel commence par la couche sous-épidermique. Améliore sa vascularisation, les faisceaux de fibres de collagène dans les parties supérieures et inférieures du rumen prennent une localisation plus friable que dans le tissu cicatriciel sans transplantation de cellules. Il y a des follicules pileux et des glandes sébacées. L'épiderme dans sa structure, après avoir passé la phase d'hypertrophie, s'approche de l'épiderme de la peau normale.
8. Les changements observés sont associés à des facteurs de croissance dérivés des kératinocytes, des cytokines, qui améliorent le trophisme du tissu cicatriciel et facilitent sa transformation du tissu fibreux grossier en un tissu plus lâche, ce qui conduit à une amélioration du type de cicatrice.

Ainsi, sur la base de cette étude, on peut conclure que l'effet bénéfique des kératinocytes transplantés sur le tissu cicatriciel, qui peut être d'une importance pratique pour la réadaptation des patients avec différents types de cicatrices.

Ce travail sur les rats a également permis de formuler des exigences. Aux couvertures de la plaie, sur lesquelles les kératinocytes sont cultivés.

Les plaies doivent être:

• biocompatible avec des cellules,
• respirant,
• avoir une base de construction de forme élastique,
• être hydrophile,
• Comme les additifs médicinaux contiennent des médicaments antibactériens et les antioxydants ne sont pas toxiques pour les cellules cultivées.

Les résultats cliniques du traitement biotechnologique des cicatrices.

Plus tôt, N. Carver et al. (1993) ont trouvé que les pansements occlusifs sont les meilleurs pour s'attacher à la plaie et à la survie des kératinocytes, mais ne permettent pas la formation d'un épiderme stratifié (mature). Pour former un épiderme stratifié, un environnement aérien est nécessaire. Par conséquent, après la fixation de la couche multicouche, un recouvrement de plaie occlusif a été suggéré après 7-10 pour enlever et conduire les plaies sous des bandages secs ou des pommades hydrosolubles. Nous pouvons dire que la qualité et les propriétés du «substrat» sur lequel les cellules sont cultivées sont très importantes pour l'efficacité de la transplantation du matériel cellulaire, et par conséquent pour les résultats du travail des médecins. Mais il n'y a pas de couverture idéale de la plaie aujourd'hui, malgré l'abondance des options proposées (cuir artificiel, non-tissé de carboxyméthylcellulose, revêtements de fibrine, films de polyuréthane semi-perméables). Le coût des "substrats" (revêtements spéciaux pour plaies), dont le coût élevé augmente le coût total du traitement biotechnologique, n'est pas sans importance à cet égard.

L'efficacité des technologies cellulaires a été prouvée à ce jour, mais, malheureusement, ces technologies sont très coûteuses, en particulier dans les pays où la production industrielle de compositions cellulaires n'est pas établie. Néanmoins, des pays tels que les États-Unis ont depuis longtemps établi une industrie pour la production de matériel cellulaire pour la transplantation de brûlé. En particulier, BioSurface Technology Inc, depuis 1989, a cultivé 37 000 strates de kératinocytes multicouches qui ont été utilisés pour traiter 240 patients dans 79 pays (R.Odessey, 1992) avec 1 cm ^{2 de} culture cellulaire coûte environ 7-8 $ US.

La technologie du traitement de diverses maladies et problèmes cutanés présente un certain nombre de différences, mais au cœur de tout traitement avec des cellules, il y a la production de matériel cellulaire de qualité et sa transplantation.

Ce processus comprend les étapes suivantes:

• sélection de la peau chez les personnes affectées (ou chez les donneurs),
• le transport des lambeaux cutanés vers le centre de biotechnologie,
• l'isolement des cellules de la couche basale et leur multiplication,
• accumulation de couches multicouches de kératinocytes (IPC).
• transplantation de cultures cellulaires.

Le principal problème dans le traitement de la transplantation de strates de kératinocytes multicouches est le besoin de cellules viables à tous les stades de la transplantation cellulaire. Les morceaux de peau pour isoler les cellules autologues ou allogéniques doivent être aussi minces que possible, car dans ce cas, il est plus facile de les séparer en utilisant des méthodes mécaniques et enzymatiques et d'obtenir une suspension de cellules vivantes pour la croissance. Ils peuvent être obtenus en coupant le dermatome ou en utilisant la peau des paupières, le prépuce, la surface interne de l'épaule. Étant donné que les cellules sont sensibles aux halogènes (chlore, iode), au peroxyde d'hydrogène, elles ne peuvent pas être utilisées dans le traitement de la peau au moment de la prise du matériau.

Le rendement quantitatif et qualitatif des cellules issues des greffes de peau et l'efficacité de leur culture dépendent également de l'état de santé et de l'âge du donneur. En outre, les échantillons de biopsie cutanée doivent être livrés au laboratoire dès que possible et dans des conditions appropriées (environnement, température) livrés à un laboratoire agréé et accrédité.

A moyen ou moyen 199 Eagle avec l'addition de 10% de sérum bovin, milieu DMEM supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal et des antibiotiques peuvent être utilisés pour stocker et transporter des lambeaux cutanés.

Dans le laboratoire de cytologie, la biopsie cutanée est d'abord mécaniquement divisée en petits morceaux, puis le traitement des fragments de peau est réalisé à l'aide d'enzymes: trypsine, collagénase, dyspase, etc.

Sous l'action des enzymes, la destruction par des desmosomes a lieu et les kératinocytes sont libérés dans le milieu sous forme de cellules séparées ou d'agrégats constitués de différents nombres de cellules. Pour la culture, on utilise seulement des kératinocytes basaux qui sont cultivés sur des milieux spéciaux dans des incubateurs contenant 5% de CO, dans des boîtes de Pétri ou dans des flacons à t = 37 ° C. En 48 heures, on observe la formation de colonies de kératinocytes qui convergent progressivement en une monocouche. Après avoir obtenu un nombre suffisant de cellules, la suspension résultante est étalée sur les couvertures de plaies préparées à cet effet et placée dans des boîtes de Pétri. A partir de la suspension, on forme d'abord une couche monocouche puis une couche multicouche de kératinocytes. Schématiquement, les étapes du processus de culture des kératinocytes sont montrées sur la Fig. 12 (33,43,54,65).

La formation d'une formation de kératinocytes multicouches adaptée à la transplantation prend habituellement de 7 à 10 jours. Parfois, cette période est plus longue, ce qui dépend de la qualité du matériel source (âge, santé du donneur, exactitude du matériel, qualité du support utilisé, etc.). Si la couche multicouche envahit, alors à sa surface il peut y avoir des cellules avec des phénomènes d'apoptose impropres à la transplantation. Les boîtes de Pétri, cultivées sur les plaies par des couches multicouches de kératinocytes (IPC), sont livrées à la clinique dans des récipients spéciaux à une température non inférieure à + 15 ° C.

La méthode modifiée de Green pour développer l'IPC

Dans notre travail en tant que revêtement de plaie, nous avons utilisé une batte multicouche, abandonnant les films de polypore avec lesquels nous avons commencé à travailler dans une expérience avec des rats. Ainsi, des strates kératinocytaires multicouches ont été cultivées par nous sur des batiste préférables et stériles, bien que ce ne soit pas non plus le recouvrement optimal de la plaie.

Des études cliniques ont été menées sur des volontaires avec le respect des normes éthiques nécessaires: la signature d'un traité et le consentement éclairé.

1. La culture de propre (autologue) et prise à partir des cellules de banques (allogéniques) keratinocytes a été appliquée.
2. Les kératinocytes propres ont été obtenus à partir d'un morceau de peau coupé de l'intérieur de l'épaule des patients.
3. L'opération de la dermabrasion des cicatrices a été réalisée avec l'aide du thermocouplage, des disques rotatifs et du laser erbium.
4. Des groupes de patients présentant des cicatrices normotrophes, hypotrophiques et hypertrophiques ont été pris.

Le processus technologique pour l'application de la technologie cellulaire pour améliorer le type de cicatrices cutanées se composait des étapes suivantes:

1. Sélection des patients
2. Expliquer l'essence du traitement, le moment de l'obtention des résultats attendus, la signature d'un traité et le consentement éclairé.
3. La nomination des patients pendant 2-3 semaines avant la chirurgie selmevit par 1 t. 3 fois par jour, zinkteral sur 1t. 3 fois par jour
4. Prenant un morceau de peau de 2,0 cm de long et 0,7-1,0 cm de large de la surface interne de l'épaule, haute, presque au bas de la région axillaire, pour obtenir des kératinocytes autologues.
5. Dans le cas de patients refusant d'isoler leurs propres kératinocytes en raison de la possibilité d'obtenir une cicatrice linéaire sur la surface interne de l'épaule, le matériel cellulaire a été prélevé sur une banque de cellules (kératinocytes allogéniques).
6. Les kératinocytes ont été isolés et cultivés dans des conditions d'un laboratoire certifié pour ce type de travail.
7. Après avoir reçu une IPC suffisante pour la transplantation, un jour de chirurgie a été administré aux cicatrices à la clinique, où le matériel a été apporté dans des conteneurs spéciaux dans des boîtes de Pétri.
8. L'opération de la dermabrasion du rumen, l'hémostase a été effectuée, la surface du sol a été lavée avec une solution saline stérile, séché, après quoi l'IPC a été transplanté sur des cellules "batiste" stériles. C'est-à-dire que les cellules qui étaient supérieures dans le MIC étaient plus basses, adjacentes à la surface polie.
9. Un film stérile a été superposé sur le dessus, qui a été fixé à la peau avec un bandage élastique ou un pansement élastique Omnifix. A la place du film, des revêtements de plaies indifférents contenant de la silicone, par exemple Mepitel, Mepiform, des plaques de gel de silicone, peuvent également être utilisés.

Après 5-7 jours, le film ou le revêtement de silicone est enlevé. À ce moment-là, tous les kératinocytes doivent ramper sur la cicatrice polie et s'attacher à sa surface.

10. L'environnement humide créé sous le film et le revêtement de silicone contribue activement à cela. Le baptiste restant sur la cicatrice à partir de ce point peut être imprégné de gel de curiose ou de chitosane. En conséquence, le 2ème jour, une croûte dense est créée, qui, pour la commodité du patient, il est préférable de fixer avec un plâtre élastique et perméable à l'air, par exemple Omnifix. La croûte respirante permet à l'épiderme nouvellement formé de se différencier et de devenir mature.

Selon le type de cicatrice et la profondeur de broyage, le pansement est rejeté après 8-10 jours. L'épiderme à ce moment a 30-40% plus de couches cellulaires que dans la peau normale. La membrane basale n'est pas formée. Les kératinocytes de l'épiderme épaissi libèrent une masse de molécules biologiquement actives dans le tissu cicatriciel.

Le succès du traitement biotechnologique des cicatrices dépend en grande partie de la façon dont elles sont prises en charge dans la période postopératoire. Les cultures de cellules sont un type de couverture de plaie «tendre» et dans les premières périodes après la transplantation, la DMO peut facilement être détachée des tissus sous-jacents. Par conséquent, les patients sont invités à prendre soin de la cicatrice après la chirurgie. Pendant 8 à 9 mois, ne frottez pas et travaillez facilement avec de l'eau bouillie froide pour éviter de déchirer un mince épiderme nouvellement créé qui n'a pas une adhérence serrée avec les tissus sous-jacents.

Note:

Avant la chirurgie et pendant l'utilisation de dermabrasion d'oxydants halogénés et des conservateurs (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, la chlorhexidine, le peroxyde d'hydrogène) est autorisée avant la transplantation kletok- absolument contre-indiquée en raison de leurs effets cytotoxiques. Toxique pour les cellules sont également bleu de méthylène. Vert brillant.

Pour éviter l'infection, en particulier lorsque vous travaillez avec des cicatrices hypertrophiques, il est possible de traiter le champ opératoire avec du sulfate de néomycine, de la polymyxine ou de la gentamicine. Ils n'exercent pas d'effet cytotoxique sur les kératinocytes.

À la suite de ce traitement, un triple effet est atteint.

1. Alignement de la surface du rumen.
2. Créer une couche au-dessus d'un nouvel épiderme, épaisseur normale.
3. Conversion de tissu cicatriciel dans dermopodobnuyu par l'action des cytokines, des facteurs de croissance et d'autres molécules bioactives sécrétées par les cellules transplantées et kératinocytes stimulés par eux, les fibroblastes et les macrophages.

La cicatrice devient moins perceptible, plus élastique, les pores y apparaissent, les poils gonflés, la pigmentation peut être restaurée grâce à la présence de mélanocytes dans les MPC.

Cependant, tous ces moments positifs dans la cicatrice ne viennent pas immédiatement. À cet égard, il est nécessaire d'avertir les patients. Que le processus de transformation du tissu cicatriciel dans le derme est lent et que le résultat optimal d'un tel traitement ne peut être attendu au plus tôt 10-14 mois. Immédiatement après le rejet du pansement, les surfaces polies ont une polychromie prononcée, plus le processus de broyage est brillant. Le moindre dommage à la peau se produit lors du broyage des cicatrices normotropes avec un laser erbium. La couleur des cicatrices et de la peau environnante a été restaurée dans la période de 3 à 8 semaines. Malgré ces précautions, il y a parfois une hyperpigmentation postopératoire qui peut durer plusieurs mois de façon indépendante.

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